Измерение изменений в уровень метаболизма центральное значение для понимания прогрессирования различных заболеваний и старения. Здесь мы представляем Роман технику для измерения потребления всей головы кислорода, что более близко напоминает физиологическое состояние и может помочь в выявлении Роман наркотики, которые изменяют митохондриальной активности.
Регулируемые метаболической активности имеет важное значение для нормального функционирования живых клеток. Действительно изменения метаболической активности каузально связаны с прогрессирования рака, диабета, нейродегенеративные и старения, чтобы назвать несколько. Например изменения в митохондриальной активности, клетки метаболических электростанция, характеризовались во многих таких заболеваний. Как правило показатели потребления кислорода митохондрий считались надежным индикация митохондриальной активности и измерения в некоторых из этих исследований были основаны на изолированных митохондриях или клетки. Однако такие условия не могут представлять сложности всей ткани. Недавно мы разработали Роман метод, который позволяет динамическое измерение показателей потребления кислорода от всей изолированных летать головы. Используя этот метод, мы добились более низкие показатели потребления кислорода всей головы сегмента в молодых против возрасте мух. Во-вторых мы обнаружили, что ингибиторов деацетилаз лизин быстро изменить потребления кислорода по всей голове. Поэтому наш Роман технику может помочь в выявлении новых свойств различных препаратов, которые могут повлиять на уровень метаболизма. Кроме того наш метод может дать лучшее понимание метаболических поведения в экспериментальной установки, которая больше напоминает физиологических состояний.
Регулируемые метаболической активности имеет важное значение для выживания клеток и здоровой функции ткани. Дерегулирование метаболической активности широко доказано быть связано с наступлением и прогрессирования различных недугов1. Например, Нижняя метаболическую активность была ранее описана в нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и обесценение возраста ассоциированной памяти2,3. Кроме того митохондриальной дисфункции считается каузально включиться в процесс старения4,5. С другой стороны более высокие показатели митохондриального и метаболических были описаны в раковых клеток6, где использование ингибиторов митохондриальных уменьшена tumorigenesis7.
Одна индикация метаболической активности является уровень потребления кислорода (OCR) митохондрий. Интересно, что этот тип индикации главным образом получены из изолированных митохондриях или клетки, таким образом большинство того, что описано в литературе основывается главным образом на индикации, которые не похожи на физиологическое состояние. Однако есть несколько недостатков в этой технике. Во-первых протокол митохондриальной изоляции может потенциально повредить ее целостность8, который может быть соответствующим артефакт, при сравнении митохондрий изолированных от молодых и старых тканей9. Кроме того процесс изоляции длинный и может привести к потере соответствующих белков Посттрансляционная модификаций, которые регулируют функции митохондрий9,10,11. Кроме того было показано, что изолированных митохондриях не представляют последовательно цельной ткани метаболизма12,13. Такие Сотовые биологических сложности может рассматриваться как, «целое больше, чем сумма его частей», т.е., митохондрий может отображать различные метаболические ставок внутри комплекса ячейки по сравнению с их метаболизма при изоляции.
В то время как клетки может предложить лучше OCR индикация чем изолированных митохондриях, клетки для сотовой связи в контексте всей ткани могут быть потеряны. Например в головном мозге, сильно зависит от метаболической активности соседние глиальные клетки14метаболической активности нейронов. Таким образом создания новых методов для расследования OCR в цельной ткани или весь организмов может оказаться более глубокий для возникновения и прогрессирования различных расстройств.
Недавно появились новые методы для решения этих вопросов и включения измерения OCR из цельной ткани, сегмента или живых организмов. Например недавняя работа сообщили измерения кислорода от Жук полет мышцы с помощью подхода permeabilized волокно с респирометра15. Новые машины для микро respirometry позволяют измерения OCR панкреатических островков16,17. Следовательно сообщалось, что эта технология позволяет измерение OCR весь червей18 и19Зебра рыбы. Однако наличие пищеварительной барьера может представлять вызов для тестирования различных наркотиков в контексте изменения OCR. Интересно, что последние доклады Невилл и его коллеги показали новую технику для измерения одного дрозофилы личинка мозга с хорошо плиты20,21.
В этом исследовании мы использовали аналогичные установки для включения измерения всего OCR от всей жизни и не mobile дрозофилы22. Этот метод также предлагает вторичных преимущество в измерения воздействия различных препаратов на метаболическую активность в целый сегмент, без необходимости проходить через пищеварительный тракт барьер13,22. Например ранее было показано, что прямое впрыскивание ингибиторов деацетилаз лизина (KDACi), препарат считают, изменить эпигенетический механизм в головном мозге, привели к улучшению воспоминания формирования23. Однако используя наш Роман технику, мы обнаружили, что ингибирование KDAC привели к быстрый рост OCR, который может быть фактором, способствующим сама по себе в активности нейронов. Наш протокол обеспечивает простой и Роман метод для оценки влияния различных препаратов, генетическая манипуляция или физиологических состояний (болезни, старение) на распознавание в контексте всей головы.
Наша новая техника предлагает новый подход к изучению метаболические изменения в старения и болезней в контексте всей летать сегментов22. Этот метод может также подходит для изучения влияния KDAC натрия бутират на потребление кислорода. Как мы показали, лизин deacetlyase ингибиторы (ГДА/KDACs) приводят к изменениям OCR. По существу, как цели таких ингибиторов обычно не локализована в митохондриях (эти ингибиторы не влияют комплексы класса III, Sirtuins)24, такие препараты могут только испытываться на по крайней мере тканевом уровне. Действительно различные препараты вводят непосредственно в мозг, таким образом обходя возможные обработки/изменения/инактивации пищеварительной системой. Таким образом наша техника предлагает Роман проницательность в как такие препараты непосредственно влияние головы сегмента.
Есть несколько важных шагов. Во-первых как указано в протоколе, мы настоятельно рекомендуем, подготовке пластины под один час, с две пары рук, подготовке пластину. Из нашего опыта качество и стабильность измерений OCR лучше, когда подготовлен своевременно. Когда принимая слишком длиной, возникновение низкого потребления скважин OCR растет, а также короче продолжительность стабильной OCR. Во-вторых важно провести проверку качества и обеспечить что экспериментальных условий между различными образцами являются аналогичными (рН, уровень кислорода). Наконец важным шагом является выбор правильного алгоритма для анализа образцы. Как мы показали, используемый по умолчанию алгоритм AKOS принесли заблуждение и иногда противоположные вычисления в образцах, которые потребляются кислорода на высокие ставки13. Поэтому мы подчеркиваем важность проверки исходных данных для уровней кислорода и сравнивая результате OCR.
В настоящее время существует несколько ограничений с этой техникой. При комнатной температуре, машина нагревается до 31 ° C (это минимальное измерения температуры при работе машины при комнатной температуре), который может представлять состояние стресса для fly главы25. Это, однако, могут быть преодолены, поставив машину в холодной комнате, которая даст возможность измерения при 25 ° C и, следовательно без возможных теплового стресса к лету головы. Недавний доклад продемонстрировал, поставив машину в 11 ° C, таким образом позволяя OCR запись мух на 25 ° C21. Тем не менее летать головой разделения должны быть выполнены при комнатной температуре. Кроме того колебания температуры осложняют для контроля рН изменений, и поэтому настоятельно рекомендуется проверить влияние физиологических условиях/наркотиков на OCR с помощью подобных экспериментальных установок. Кроме того вклад потребления кислорода, митохондриальных независимых механизмов еще не установленных26. С помощью различных респираторные ингибиторы, которые являются эффективными в лету головы, было бы возможно установить такие темпы потребления не митохондрий кислородом.
Примечательно, что различные недуги млекопитающих характеризуются изменения в метаболизме энергии. Среди них заболевания, которые характеризуются либо метаболических сокращения, например, болезнь Альцгеймера или метаболических переоснащая например рака. Интересно, что ингибиторы KDAC используются для лечения рака и болезни Альцгеймера27. Хотя точные механизмы, по которой KDAC ингибиторов достижение лечебный аспект остаются неясными, данные из нашей техники поддерживает Роман понятие, что такое ингибиторы могут модулировать метаболизма.
В целом этот метод является ценным для измерения общего потребления кислорода в естественных условиях и более точно отображает эффекты наркотиков на общий обмен веществ, которые могут остаться незамеченными в изолированных митохондриях протоколы12. Например результаты, полученные из этого метода, вместо предыдущих методов, причастны Роман идеи для возраста связанные метаболических гибкости после KDAC лечения. Хотя дополнительная работа необходима для оптимизации экспериментальных условий для fly головы, сочетание нашей техники и подходящих анализа может привести к дополнительные разъяснения митохондриальной деятельности в контексте всего живых тканей.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Андреас Ladurner, Карла Маргулис и их команды для обширных экспериментальная поддержка. Мы благодарим Кейтлин Ondracek за ее замечания по рукописи. Мы хотели бы поблагодарить София Vikstrom для оказания нам помощи в создании на ранних этапах этой техники. Мы также благодарим могут Sanderhoff за ее техническую помощь. LB финансируется немецкого федерального министерства образования и научных исследований (Грант 01KX1012 Infrafrontier). SP финансируется фонд AXA исследований докторской стипендии и NSFC (Грант № 81870900). АВВ финансируется QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |