Denna artikel presenterar en nötkreatur bröstkörteln biopsi med kärna och nål biopsi verktyg. Skördade vävnad kan användas för cellodling eller att bedöma mjölkkörtlar fysiologi och metabolism inklusive genuttryck, proteinuttryck, protein modifieringar, immunohistokemi och metaboliten koncentrationer.
Bovin bröstkörteln biopsier tillåter forskare att samla in vävnadsprover för att studera cellbiologi inklusive genuttryck, histologisk analys, signalering vägar och protein översättning. Den här artikeln beskrivs två metoder för biopsi av nötkreatur bröstkörteln (MG). Tre friska Holstein mjölkkor var betvingar. Innan biopsier, var Korna mjölkas och därefter fastspända i en nötkreatur ränna. Ett analgetikum (flunixin meglumin, 1.1 till 2,2 mg/kg kroppsvikt) administrerades via jugular intravenös [IV] injektion 15-20 min före till biopsi. För stående sedering, Xylazinhydroklorid (0,01-0,05 mg/kg kroppsvikt) injicerades via svans fartygen 5-10 min innan förfarandet. När tillräckligt drogad, biopsi platsen aseptiskt utarbetades och lokalt bedövad med 6 mL 2% lidokain hydroklorid via subkutan injektion. Använd aseptisk teknik, gjordes en 2 till 3 cm vertikala snitt med en nummer 10 skalpell. Core och nål biopsi verktyg användes. Verktyget core biopsi var kopplad till en sladdlös borr och infogas i MG vävnaden genom snittet med viss borr. Verktyget nål biopsi infogades manuellt i snitt webbplatsen. Omedelbart efter ingreppet tillämpas en assistent trycket på webbplatsen snitt för 20-25 min med en steril handduk för att uppnå hemostas. Rostfritt stål kirurgiska häftklamrar användes att motsätta sig huden snittet. Staples var borttagna 10 dagar efter ingreppet. De främsta fördelarna med kärna och nål biopsier är att båda metoderna är minimalt invasiva ingrepp som kan utföras på ett säkert sätt i friska kor. Mjölkavkastningen efter biopsin var opåverkad. Dessa procedurer kräver en kort återhämtningstid och resultera i färre risker för komplikationer. Särskilda begränsningar kan inkludera blödning efter biopsi och infektion på webbplatsen för biopsi. Tillämpningar av dessa tekniker inkluderar vävnad samling för klinisk diagnos och forskningsändamål, såsom primär cellkultur.
En biopsi är ett förfarande för att skörda ett core avsnitt av vävnad från patienter för medicinsk- eller forskningsändamål. Det är en minimalt invasiv och allmänt använd teknik för att samla vävnad som ett alternativ till dödshjälp1 för att möjliggöra analys av vävnad Svaren till behandling eller andra faktorer av intresse. Prover av nötkreatur bröstkörteln (MG) vävnader är väsentliga för mejeri forskning att studera genen och protein uttryck, histologi, organisationen av cellulära organeller, signalvägar och metaboliska processer som svar på förändringar i förvaltningen eller den miljö. Dessutom behövs MG vävnad att diagnostisera och forskning vissa smittsamma sjukdomar, såsom bovin mastit orsakad av bakterieinfektioner2.
Juvret av nötkreatur innehåller fyra separata körtlar och varje körtel innehåller en oberoende sekretoriska mjölksystemet kollektivt kallas parenkymet. I alveolerna, kanaler och bindväv finns i mjölkkörtlar parenkymet. Alveolerna är mikroskopiska sfäriska ihåliga strukturer som består av epitelceller i inre yta (luminala) och specialiserade myoepithelial celler på utsidan (basala). Alveolerna är ansvariga för syntes och sekretion av mjölk. Fibrös bindväv vävnaden i parenkymet kan skilja en grupp av alveolerna från andra grupper av alveolerna, och varje grupp kallas en LOB3. Flera faktorer kan påverka utveckling och funktion av en MG inklusive Djurfysiologi, kost, management, genetik och miljö4. Mastit är också en kritisk faktor som negativt påverkar MG funktion och mjölk kvalitet5. De gifter som släpptes av mastitic patogener kan orsaka skador på alveolerna och inducera nekros leder till biokemiska och histologiska förändringar i MG vävnad6. Således kan den histologi och metaboliska processer varje alveolerna eller LOB i MG vara väsentligt annorlunda från andra. Som sådan, är biopsier som är representativa prover av hela bröstkörteln önskvärt. Små biopsier kan bara fånga en enda LOB eller enskilda alveolerna, begränsa den resulterande vetenskapliga eller diagnostiska informationen. För forskningsändamål, är det nödvändigt att vara medveten om att ett bröst biopsi ger en ”ögonblicksbild” av vävnad egenskaper men en biopsi inte tillräckligt karakterisera mjölkkörtlar summafunktion i avsaknad av uppskattningar av totala bröstkörteln massa.
Flera biopsi verktyg har utvecklats under de senaste 30 åren för humant bruk. Anpassningar av dessa instrument är för närvarande tillgängliga för användning med djur. För mjölkkor, har prover av MG vävnad erhållits med olika tekniker inklusive kirurgisk excision (trubbig dissektion)7, biopsi nålar1,8och core biopsi instrument9,10. Således, MG biopsi tekniker i lakterande mjölkkor har övergått från förfaranden använda recumbent sedering med kirurgisk dissektion med diatermi hemostas i 19927 till samling av core biopsier enligt stående sedering9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi är en invasiv metod, som kan vara dyra och har en högre förekomst av komplikationer såsom hematom, sår problem, och tumören spridit13. För närvarande, core biopsi och nål biopsi (kallas även en tru-cut-biopsi) antagits allmänt som alternativ till kirurgisk biopsi. Fördelarna med kärna och nål biopsier jämfört med kirurgisk biopsi är: förfarandet är minimalt invasiv; större komplikationer är sällsynta. generell anestesi krävs inte; förfarandet är relativley snabbt. återhämtningstiden är kort. Det finns minimal negativa effekter på juverhälsa och bara kortsiktiga effekter på mjölk avkastning och sammansättning8,9,10. och kostnaden är mindre än kirurgisk biopsi13.
En core biopsi-förfarande som beskrivs i 1996 används en steril kanyl i rostfritt stål med löstagbart infällbar klinga att ta bort en representativ mängd vävnad från nötkreatur MG utan narkos9,10,11 ,12. Under förfarandet fästes instrumentet till en sladdlös borr att skapa en låg hastighet, roterande rörelse som rent skär en vävnad kärna som verktyget avancerad i vävnaden. Fördelen var en större vävnad prov (70 mm x 4 mm i diameter, ca 0,75-1 g) 9. En senare studie10 visade att biopsi proceduren som beskrivs av V. C. Farro.a. 9 kan användas för att utföra upprepade MG vävnad samlingar utan negativ inverkan på prestanda och juver hälsan hos lakterande mjölkkor. Nyligen genomfördes en studie14 hos mjölkkor att utvärdera upprepade biopsier av MG med en större troakar (31 cm lång, yttre diameter på 9,5 mm, inre diameter 8 mm) med vakuum som tillämpas på en inre rostfritt stål kanyl för att samla biopsi . Denna metod används för sedering (xylazin) och lokalbedövning (2% lidokain hydroklorid).
Nål biopsi är en annan teknik för att samla bröstvävnad. Flera studier har antagit denna teknik. En studie1 används sedering (detomidin) och lokalbedövning (1% lidokain) i proceduren. Efter biopsi fick korna en profylaktisk behandling med antibiotika. Bröstkörteln var manuellt masseras före och efter mjölkningen. Blod i mjölken observerades för upp till 84 h efter biopsi. Mängden och mjölkens sammansättning påverkades under en kort tid. Nyligen har brukade en studie en biopsi nål utföra upprepade MG biopsier i mjölkkor8. Sedering (1% Acepromazin, intramuskulär) och lokalbedövning (2% lidokain hydroklorid, subkutan) administrerades till djuren. Djuren fick inte intramammär läkemedel eller antibiotika före eller efter ingreppet, och det fanns inga tecken på infektion vid biopsi platsen under den postoperativa perioden. I denna studie hade upprepade nötkreatur MG biopsier med hjälp av en nål en mindre negativ inverkan på mjölk produktion och juver hälsa mjölkkor. I allmänhet verkar nål biopsi vara en mindre invasiv metod än core biopsi instrumentet. Som nämnts tidigare, är det dock viktigt för biopsi tekniken att skörda ett representativt urval av MG vävnad. Begränsning av en nål biopsi är att en liten mängd bovint MG vävnad erhålls (cirka 20 till 25 mg)8,15.
Nästan samtliga studier används en kombination av α-2-agonist sedering och lokalbedövning8,9,10, oavsett om biopsin var via en nål eller en större kärna. I den bovin MG är de flesta nervändar associerade med huden. Innervation till parenkymal vävnad är till stor del via stretch receptorer med gles typ en nervtrådar att upptäcka skarp kirurgisk smärta. Som ett resultat, är fysiologiska mekanismer av smärta på grund av kirurgisk manipulation av en MG via hud och subkutan vävnad3 och inte djupa vävnader såsom parenkymal vävnad. Därför för biopsi förfaranden är det endast nödvändigt att lokalt söva hud och subkutan vävnad, som infiltration av lokalbedövning i de djupa vävnaderna inte avsevärt minskar kirurgisk smärta. Efter en lämplig preparering av området biopsi, djur obehag är, i första hand förknippas med återhållsamhet.
Insamling av större borrkärnor kan öka hematom bildas och ökar risken för infektion inom MG parenkymet. Därför, perioperativ protokoll ofta inkluderar administration av parenteral antibiotika7, även om det inte är universals8. Att uppnå hemostas är också en viktig faktor för att minska Ko sjuklighet. I den ovannämnda studien med en stor kärna biopsi instrument14, manuellt tryck tillämpades till webbplatsen biopsi och en ko BH användes för att tillämpa is sår för minst 2 h efter förfarandet. Trots den stora mängden vävnad som skördats, enda liten minskning i foder intag och mjölk avkastning observerades och proceduren upprepades varje tre veckor utan negativa effekter på Ko hälsa.
Forskare som utför MG biopsi hos mjölkkor behöver överväga den resulterande biopsin diagnostiska eller analytisk kvalitet, enkel teknik och Ko-morbiditet. Korrekt och förplanerade kirurgiska tekniker är absolut nödvändigt att uppnå dessa mål. Hittills har MG biopsi studier har fokuserat på att beskriva biopsi resultat, i motsats till som beskriver biopsi tekniken själv, och beskrivningar för lakterande mjölkkor saknar tillräckligt detaljerade för att möjliggöra replikering. Således, syftet med detta arbete var att beskriva både nål biopsi och större core biopsi tekniker i tillräckligt detaljerade för att möjliggöra säker och Human replikering av MG biopsi av nötkreatur.
Core och nål biopsi metoder har beskrivits i detta protokoll9,16. En detaljerad utvärdering av djurens hälsa och förekomst av mastit14 innan biopsi krävs för båda förfarandena. För forskningsändamål, bör utföra tekniken hos djur med uppenbara tecken på inflammation eller smittsamma sjukdomar undvikas. Detta minskar risken för komplikationer under och efter en biopsi. Alla biopsi-instrument och enheter bör vara ren, desinficeras och steriliseras för att undvika kontaminering av biopsi platsen. Innan förfarandet är det nödvändigt att minimera kirurgiska infektioner (SSI). I allmänhet är SSI associerade med animaliskt sjuklighet, förlorad prestanda och högre produktionskostnader hos mjölkkor. Studier rapporterat tidigare metoder för att förhindra SSI på grund av biopsi inklusive klippning håret runt snittet webbplatsen, tvätta området biopsi för att ta bort föroreningar9,14, och använda antiseptisk agenter (70% alkohol, jod kirurgiska skrubba9, 2% klorhexidin Acetat lösning14, 10% povidonjod8) för huden förberedelse. I några studier antogs administrering av antibiotika under7 eller omedelbart efter biopsi9; men antibiotikaprofylax användes inte i den nuvarande arbetet och inga infektioner av biopsi platsen observerades. För att förhindra kontaminering av biopsin sår, bör svansen säkras för att förhindra kontakt med biopsi platsen tills aerosol bandaget har tillämpats. I detta protokoll bort staples ca 10 till 14 d efter biopsi.
Innan en core biopsi är det viktigt att korrekt konfigurera verktyget och bifoga det till borren; välja en långsam rotationshastighet, Välj framåt rotation och Använd inte omvända funktionsläget av borren. Under förfarandet är det viktigt att använda digitala trycket på båda sidor av snittet att hålla huden kanterna isär och ha en tillräckligt lång incision att tillåta verktyg posten utan att kontakta hud eller bindväv. Om detta förfarande inte görs kan en drar i snitt kanterna under rotation av core biopsi instrumentet uppstå och orsaka ytterligare hud vävnad trauma vilket ökar risken för infektion och kan fördröja läkning av sår. De nuvarande biopsi förfaranden som beskrivs i detta protokoll utfördes av en styrelse-certifierad stora djur kirurg. Förfaranden som utfördes framgångsrikt (figur 5). Båda tekniker är relativt enkel och snabb att utföra jämfört med kirurgisk excision förfarandet.
Blödning från biopsi är vanliga efter MG biopsi i mjölkkor8,9,10,14. I detta protokoll, blödning observerats var minimal (figur 4), vilket kan bero på tillämpning av adekvat (starka) Tryck på såret omedelbart efter ingreppet. Starka påtryckningar för minst 20 min krävs, och det kan krävas för mer än 30 min i vissa fall. Om måttlig till allvarlig blödning observeras efter tillämpning av tryck till biopsi platsen, rekommenderas det att fortsätta pressa, och omedelbart kontakta veterinär.
Hemostas är en viktig faktor för att minska Ko sjuklighet, packade en studie hemostatiska kuddar i biopsi platsen att kontrollera blödning9. Användning av hemostatiska pads på ett sådant sätt har dock en hög potentiell risk för mikrobiologisk förorening i miljön mjölkgård. En annan studie14 tillämpas manuellt tryck på biopsi platsen mellan upprepade biopsier och efter biopsi och huden stängning och tillämpas is till platsen för minst 2 h efter biopsin. I detta protokoll var starka påtryckningar till biopsi platsen för 20-25 min tillräckliga för att kontrollera blödning.
En lyckad biopsi teknik bör resultera i minsta blod i mjölken som kvarstår under en kort tid efter ingreppet. För att undvika ett avbrott i mjölk sekretion under mjölk besvikelse och mastit infektioner, bör intramammär blodproppar tas bort för hand strippar från biopsier kvartalet10,14. I detta protokoll observerades blod i mjölken upp till 48 timmar efter biopsi. I en studie som använde ett större antal djur, observerades dock blod i mjölken i flesta kor för mindre än 6 dagar. Få djur visade blod i mjölken efter 6 dagar8. Av denna anledning krävs daglig observation av mjölk utseende för 6 d efter ingreppet. Djur inte uppvisar några tecken på mastit infektion när ett stort vävnadsprov erhölls14. Tidigare forskning som utförs upprepade biopsier på samma djur med hjälp av en nål fann dock att mastit infektion incidensen var cirka 12% efter den procedur8. I detta protokoll hade varken djur visuella tecken på klinisk mastit infektion efter ingreppet. Det finns också en liten chans att snittet webbplatsen kan bli smittade efter biopsi.
Tolazoline hydrochloride, en drog som upphäver effekterna av sedering, bör finnas tillgänglig i händelse av överdosering från xylazin. En alltför stor dos av xylazin kan orsaka lungödem. Kliniska tecken på lungödem innefattar andnöd, svår dyspné, andningssvårigheter, hosta och skummande sputum. Om tecken på lungödem observeras, rekommenderas det att använda tolazine (2 till 4 mg/kg kroppsvikt) att upphäva xylazin effekterna.
Protokolls beskriver tekniken för att utföra både en nål biopsi och core biopsi. Fördelen med en core biopsi jämfört med nål biopsi är i allmänhet större vävnad prov (0,75-1 g)9 med lägsta negativa effekt på juverhälsa. Nål biopsi är en mindre invasiv metod än core biopsi instrumentet. Dock försöker flera biopsi få en större mängd vävnad med hjälp av en nål biopsi förfarande kan öka risken för större blödning efter den proceduren, samt blodproppar i mjölken. Båda teknikerna orsakade minimal Ko sjuklighet och var lätt uppnås med minimal utbildning av kirurgiska personal. En kortsiktig förändring i dagliga mjölkavkastning (8 till 10% minskning) och dess sammansättning9 och foderintag minskning14 förväntas efter de kärna och nål biopsier, respektive. Begränsningar av förfarandet nål biopsi är den lilla volymen av vävnad tas bort med nålen. Instrumentet behöver aktiveras endast när nålen är inom vävnaden som ska biopsier och flera försök är ofta nödvändigt att få tillräckliga mängder av vävnad, vilket ökar risken för blod i mjölken och mastit efter ingreppet. Begränsningar av core biopsi är en högre risk för blödning efter ingreppet om en stor mängd vävnad (> 200 mg) erhålls. Verktyget biopsi är dessutom svårare att montera som kräver lämplig utbildning före användning.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av National Animal Nutrition Program och Virginia Tech. Tekniskt bistånd av Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage och Dr. Izabelle Teixeira är erkänt tacksamt.
70% Isopropyl alcohol | Walmart | 565106257 | 1 L |
Aerosol spray to kill and repel flies | MWI | 14339 | 1 bottle (if necessary) |
Biopsy needles, 12 G × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
Butterfly infusion set (18 G needle) | Fisher | 22-258087 | 1 |
Cell culture dishes | Fisher | 08-772E | 4 |
Cordless drill (low speed) | Hitachi | DS10DFL | 1 |
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) | 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors. | ||
Cows | cattle healthy | ||
Flunixin meglumine | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight |
Folding table | Amazon | 1 | |
Forceps | Fisher | 09-753-50 | 1 |
Gloves non-sterile | Fisher | 17-200-845 | 9, size dependent |
Hard brush | Sullivan Supply | 18270 | 1, to wash the cows |
Head gate | 1, customized for dairy cows | ||
Lidocaine hydrochloride 2% injectable | MWI/VetOne | 510212 | 6 mL was used, from 3 to 8 mL |
Livestock body wash | eZall Technologies | 39384 | 1, to wash the cows |
Needle 18 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
Needle 20 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
Phosphate buffered saline (0.9%) | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
Povidone Iodine ointment | Jeffers | #VED1A | 500 g (if necessary) |
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
Reusable biopsy instrument | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
Rope halter | Nasco farm and ranch | C10852 | 2, cow size |
Scalpel blades (#10) | MWI | 033870 | 2 |
Scalpel holders (#3) | MWI | 602008 | 1 |
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. | Fisher | 19-130-0038 | 1 case of 800 |
Sterile cotton gauze sponges | Fisher | 22-037-986 | 4 |
Sterile gauze pads | Fisher | 19-090-735 | 4 |
Sterile surgical gloves | Surgical gloves | 19-166-679 | 3, size dependent |
Sterile surgical towels | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
Stethoscope | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
Surgical clipper | Oster A5 | 078005-010-003 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical clipper blades (#40 ) | Oster | 78919-016 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical staple remover | MWI | 541 | 1 |
Surgical stapler pre-loaded | MWI | 17713 | 5 |
Syringes of 10 mL | Fisher | 14-823-224 | 3 |
Syringes of 2 mL | Fisher | 22-028854 | 3 |
Syringes of 20 mL | Fisher | 22-034507 | 3 |
Syringes of 5 mL | Fisher | 22-028855 | 3 |
Thermometer | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
Tolazine hydrochloride | Akorn Animal Health | 61311-486-10 | 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary) |
Tweezer | Fisher | 14-955-025 | 1, for handle the tissue sample |
Water hose | Miracle-Gro, Walmart | 554990501 | 1, to wash the cows |
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) | MWI | 010728 | 1 bottle |
Xylazine hydrochloride | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight |