Biology

牛乳腺活检技术

Published: December 23, 2018 doi: 10.3791/58602

Veridiana L. Daley^1,4, Charles Dye², Sophie H. Bogers³, R. Michael Akers⁴, Francisco C. Rodriguez³, John P. Cant⁵, John Doelman⁵, Peter Yoder⁴, Karan Kumar², Dane Webster⁶, Mark D. Hanigan⁴

¹National Animal Nutrition Program, a National Research Support Project (NRSP-9), Department of Animal and Food Sciences, University of Kentucky, ²School of Performing Arts, Virginia Tech, ³Department of Large Animal Clinical Sciences, The Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, ⁴Department of Dairy Science, Virginia Tech, ⁵Department of Animal Biosciences, University of Guelph, ⁶School of Visual Arts, Virginia Tech

Summary

本文介绍了牛乳腺活检使用核心和针活检工具。采集的组织可用于细胞培养或评估乳腺生理和代谢, 包括基因表达、蛋白质表达、蛋白质修饰、免疫组化和代谢物浓度。

Abstract

牛乳腺活检允许研究人员收集组织样本, 以研究细胞生物学, 包括基因表达、组织学分析、信号通路和蛋白质翻译。本文介绍了牛乳腺 (mg) 活检的两种技术。三头健康的荷斯坦奶牛是研究对象。在活检之前, 奶牛被挤奶, 然后被限制在牛的降落伞里。在活检前15-20 通过颈静脉静脉注射 [iv] 给药镇痛药 (氟尼辛甲可以明, 1.1 至 2.2 mgkg 体重)。对于站立镇静, 在手术前 5-10, 通过尾骨血管注射盐酸木拉嗪 (体重 0.01-0.05 mg kg)。一旦充分镇静剂, 活检部位是无菌准备和局部麻醉与6毫升的盐酸利多卡因通过皮下注射。使用无菌技术, 使用10刀做了2到3厘米的垂直切口。使用了核心和针活检工具。核心活检工具连接到一个无绳钻头, 并通过使用时钟明智的钻头操作插入 mg 组织。针活检工具被手动插入切口部位。手术后, 助理立即在切口部位施加压力 20至25分钟, 使用无菌毛巾, 以实现止血。不锈钢手术钉被用来对抗皮肤切口。手术后 10天, 订书针被取出。核心和针头活检的主要优点是, 这两种方法都是微创手术, 可以安全地在健康的奶牛。活检后的产奶量没有受到影响。这些手术需要较短的恢复时间, 并导致并发症的风险降低。具体的限制可能包括活检后出血和活检部位感染。这些技术的应用包括用于临床诊断和研究目的的组织收集, 例如原代细胞培养。

Introduction

活检是一种为医疗或研究目的从受试者身上采集组织核心部分的程序。这是一种微创和广泛使用的技术, 收集组织作为安乐死¹的替代品, 以便分析组织对治疗的反应或其他感兴趣的因素。牛乳腺组织样本对于乳品研究研究基因和蛋白质表达、组织学、细胞细胞器的组织、信号通路和代谢过程至关重要, 以应对管理或环境。此外, 还需要 mg 组织来诊断和研究某些传染病, 如细菌感染引起的牛乳腺炎²。

牛的乳房包含四个独立的腺体, 每个腺体都含有一个独立的牛奶分泌系统, 统称为实质。肺泡、导管和结缔组织存在于乳腺实质中。肺泡是微观的球形中空结构, 由内部表面 (腔内) 的上皮细胞和外部表面 (基部) 的特殊肌上皮细胞组成。肺泡负责牛奶的合成和分泌。实质中存在的纤维结缔组织可以将一组肺泡与其他一组肺泡分离, 每组都被称为小叶 3.有几个因素会影响 mg 的发育和功能, 包括动物生理、营养、管理、遗传学和环境⁴。乳腺炎也是对 mg 功能和牛奶质量产生负面影响的关键因素⁵。乳腺病原体释放的毒素会对肺泡造成损害, 并诱发坏死, 导致 mg 组织⁶的生化和组织学改变。因此, mg 中每个肺泡或小叶的组织学和代谢过程可能与其他肺泡和小叶有显著差异。因此, 活检是整个乳腺的代表性样本是可取的。小的活检可能只捕获一个小孔或单个肺泡, 限制由此产生的科学或诊断信息。为了研究目的, 有必要意识到, 乳房活检提供了组织特征的 "快照", 但活检不能充分描述整个乳腺功能, 在没有估计的总乳腺质量。

在过去30年里, 开发了几种供人类使用的活检工具。目前, 这些仪器的改编可与动物一起使用。对于奶牛, mg 组织的样本已使用不同的技术, 包括手术切除 (钝性解剖)⁷, 活检针 1^,^{8, 和}核心活检仪器⁹^,¹⁰。因此, 在哺乳期奶牛的 mg 活检技术已过渡到收集核心活检下的核心活检从 1992年^7年使用卧式镇静与手术解剖手术解剖的程序, 到在站立镇静下收集核心活检⁹^, ¹⁰^,¹¹^,¹²。手术活检是一种侵入性方法, 可能费用很高, 发生血肿、伤口问题、肿瘤扩散等并发症的发生率较高.目前, 核心活检和针活检 (也称为经特要好切活检) 已被广泛用作手术活检的替代品。与手术活检相比, 骨线活检和针活检的优点包括: 该程序是微创的;主要复杂化是罕见的;不需要全身麻醉;该程序是相对快速的;恢复时间短;对乳房健康的负面影响最小, 对产奶量和成分⁸^、⁹^、^{10 的}影响仅有短期;而且费用比手术^活检少13。

1996年描述的一个核心活检程序使用了一个无菌的不锈钢插管与可拆卸的可伸缩刀片, 以去除有代表性^的数量的组织从牛 mg 没有全身麻醉^9,¹⁰^,¹¹ ^,^12岁。在这个过程中, 仪器被连接到一个无绳钻头, 以创建一个低速, 旋转运动, 干净地削减组织核心, 因为工具被推进到组织。好处是一个较大的组织样本 (70 毫米 x 4 毫米直径, 约0.75 至1克) ⁹。最近的一项研究¹⁰显示, v. c. farr等人描述的活检程序。⁹可用于重复收集 mg 组织, 而不会对哺乳奶牛的性能和乳房健康产生负面影响。最近, 一项研究¹⁴在奶牛中进行, 以评估 mg 的重复活检使用更大的小车 (31 厘米长, 外径9.5 毫米, 内径为8毫米), 真空应用于内部不锈钢插管收集活检.这种方法使用镇静 (xylazine) 和局部麻醉 (2% 盐酸利多卡因)。

针活检是另一种收集乳腺组织的技术。一些研究已经采用了这种技术。一项研究1在手术^中使用镇静 (非胺) 和局部麻醉 (1% 利多卡因)。活检后, 奶牛接受了预防性抗生素治疗。乳腺在挤奶前后进行人工按摩。活检后观察到牛奶中的血液长达 8 4小时。牛奶的数量和成分在短时间内受到影响。最近, 一项研究使用活检针对奶牛⁸进行反复的 mg 活检。给动物进行镇静 (1% 环丙嗪, 肌肉注射) 和局部麻醉 (2% 盐酸利多卡因, 皮下)。这些动物在手术前后没有接受腔内药物或抗生素, 手术后活检部位也没有感染迹象。在这项研究中, 反复使用针头进行牛 mg 活检对奶牛的牛奶生产和乳房健康有轻微的负面影响。一般来说, 针活检似乎是一种侵入性较小的方法, 而不是核心活检仪器。然而, 如前所述, 活检技术必须采集具有代表性的 mg 组织样本。针活检的局限性在于获得少量的牛 mg 组织 (约20至25毫克)⁸^,¹⁵。

几乎所有的研究都使用了α-2 激动剂镇静剂和局部麻醉^{剂 8}^、⁹^、^{10 的}组合, 不管活检是通过针头还是更大的核心。在牛 mg 中, 大多数神经末梢都与皮肤有关。对实质组织的神经主要是通过具有稀疏的 a 型神经纤维的拉伸受体来检测尖锐的手术疼痛。因此, 由于手术操作 mg 而引起的疼痛的生理机制是通过皮肤和皮下组织 3, 而不是深层组织, 如实质组织。因此, 对于活检程序, 只需要局部麻醉皮肤和皮下组织, 因为局部麻醉剂渗入较深的组织不会显著减少手术疼痛。在对活检区域进行适当准备后, 动物不适主要与约束有关。

收集较大的核心样本可能会增加血肿的形成, 增加 mg 实质内感染的风险。因此, 围手术期的规程通常包括肠外抗生素⁷的管理, 虽然这不是普遍的 8。实现止血也是降低奶牛发病率的一个重要因素。在上述使用大型核心活检仪器¹⁴的研究中, 对活检部位施加了手动压力, 并在手术后至少2小时内使用牛胸罩对伤口加冰。尽管收获了大量组织, 但只观察到饲料摄入量和产奶量略有下降, 每三周重复一次, 对奶牛健康没有负面影响。

在奶牛中进行 mg 活检的研究人员需要考虑所产生的活检的诊断或分析质量、技术的易用性和奶牛的发病率。准确和事先计划好的手术技术是实现这些目标的必要条件。到目前为止, mg 活检研究的重点是描述活检结果, 而不是描述活检技术本身, 对哺乳奶牛的描述缺乏足够的细节, 无法复制。因此, 这项工作的目的是充分详细地描述针活检和更大的核心活检技术, 以便安全和人道地复制牛的 mg 活检。

Protocol

所描述的所有方法都得到了弗吉尼亚理工机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准。

1. 人员

至少有两名有手术和牛处理经验的助手。
在对活体动物执行与本协议相关的程序之前, 至少对所有助手进行三次培训, 如有可能, 请使用尸体材料。
注: 培训应由以前受过培训并执行过该技术的讲师进行。
有一个大型动物兽医在手的药物管理, 并在紧急治疗成为必要的程序。在此过程中可能发生的紧急情况包括但不限于: 出血、α-2 激动剂过量和肺水肿、食物材料的返流和抽吸、疼痛和需要进一步镇静的患者抵抗力。

2. 手术器械、用品和设施的准备

清点和采购所有设备和用品 (见材料表)。
清洁和高压灭菌器手术窗帘、活检仪器、手术刀架、手术毛巾和钳子。
有一个适当大小的挤压降落伞和头部大门, 以约束奶牛。
在挤压槽附近建立一个工作台的工作空间。
确保工作区域清洁, 并有有限的牛通流量。
在工作空间内组织设备和用品, 便于访问。
在工作空间内拥有适当的照明。

3. 动物的准备

在预定的活检前一天, 清洗和擦洗动物, 特别是乳房, 以清除粪便和弄脏的材料。
遵循安全和人道地约束牛的程序。
在活检之前, 在活检时再次, 评估动物的健康、身体状况和行为。
注: 最低检查包括温度、脉搏和呼吸速率, 以及在拟议的手术部位或其他细菌感染区域检查皮炎。收集每个季度的牛奶样本, 并检查乳腺炎。
只使用健康的奶牛。
完全给牛挤奶。
将动物移入挤压槽, 理想情况下在挤奶后2小时内, 以尽量减少腺体中的牛奶存在。
用头门约束动物。

4. 镇痛和镇静

将绳索吊环放在牛的头上, 防止向后和向前移动。
将动物的头拉到一边, 用快速释放结将头部固定在适当的地方, 将绳子绑在挤压槽上。
用70% 异丙醇擦拭清洗注射部位, 并在活检前15-20 通过颈静脉静脉注射氟尼辛 (体重1.1 至 2.2 mg/kg)。
注: 在某些方案中, 如果抗炎药不会影响研究结果, 则在活检后服用非甾体抗炎药。
1. 找到颈静脉。
2. 在颈静脉槽底部施加压力, 提高颈静脉。
3. 检查以确保注射器中没有气泡。
4. 将针头插入凸起的颈静脉, 并将0.5 毫升的血液放入注射器中两次, 然后与内装物混合。如果注射器中没有血迹, 请重新定位针头。如果针头位于静脉中, 请注射内装物。
5. 轻轻取下针头。
6. 在注射部位涂上温和压力的纱布, 以防止出血。
在活检前大约5-10 在尾骨血管中静脉注射盐酸盐酸盐酸盐酸木拉嗪 (0.01 至 0.05 mg kg), 以便有足够的时间建立镇静剂。
注意: 检查动物是否有肺水肿的迹象。肺水肿的临床症状包括呼吸窘迫、严重呼吸困难、呼吸困难、咳嗽、痰霜和舌头发蓝。如果观察到肺水肿的迹象, 建议使用托拉嗪 (2 至 4 mg"体重) 来扭转西拉津的影响。
1. 提高尾巴和清洁注射面积与70% 异丙醇擦拭。
2. 检查以确保注射器中没有气泡。
3. 将针头插入尾血管, 将0.2 毫升的血液放入注射器中, 并与内装物混合, 以确保针头驻留在血管中。如果针头驻留在容器中, 请注射注射器内装物。
4. 轻轻取下针头。
5. 在注射部位涂上压力温和的纱布。

5. 活检部位的准备

让一个助手把手术的尾巴系好。
选择乳房上的活检部位 (通常在上部区域, 以尽量减少结缔组织的收集, 并避免插入腺体蓄水池,图 1), 并从选定的活检部位取出任何弄脏的材料或粪便。

图 1.牛乳房的图像说明活检部位. 请点击这里查看此图的较大版本.

观察和触诊皮肤, 特别注意识别任何大型皮下血管, 以避免在活检过程中这些血管。
将头发从活检部位周围的15厘米 x 15 厘米区域剪下。
用聚维酮碘 (0.75 可用于碘) 或葡萄糖酸氯己定擦洗准备活检区域。替代与70% 异丙醇至少三次, 以消除所有可见和无形的碎片。采用内出法, 在圆周运动中应用无菌擦洗液和异丙醇。确保防腐擦洗溶液与皮肤保持接触至少5分钟。
使用带 18 g 针的蝴蝶输液装置, 在切口部位皮下沉积6毫升盐酸利多卡因, 形成一个线块。不要渗透到更深的组织中。
注: 利多卡因的剂量在3至8毫升之间。
让局部麻醉剂扩散 3至5分钟, 在切口前再重复擦洗液和酒精。在等待时, 准备活检仪器。

6. 活检程序

在处理活检工具和切口时使用无菌技术。
洗手以去除所有可见的污染, 并使用无菌的手术手套。
按使用顺序将手术器械安排在无菌区域。有一个10号手术刀, 无菌纱布, 组装活检仪器, 和无菌毛巾止血。
注: 按照步骤1执行核心活检或过程2执行针活检。

图 2.v. c. farr 等人描述的核心活检工具的组装和设置示意图.⁹刻度栏为1厘米. 请点击此处查看此图的较大版本.

核心活检仪 (farr 等人⁹)
1. 使用无菌手套组装核心活检仪器 (图 2)。
  1. 将7个无菌件放在无菌悬垂上 (图 2 a)。
  2. 将刀片 (片 1) 插入第2块 (图 2b ) 上的对接系统。
    注意: 不要将手指直接放置在刀片线上。
  3. 在片 2 (图 2c) 的顶部插入3块, 确保坞站将对齐。
    注: 观察4块 (图 2d) 内壁中的对接系统。
  4. 将刀片的最后边缘 (片 1) 连接到块4的对接系统中 (图 2d)。
  5. 向前推4片, 观察4片是否在第3块旁边 (图 2e)。
  6. 在设备上插入片 5 (刀片 + 片 2) (图 2f)。
  7. 确保坞站对齐 (图 2g)。
  8. 将一块6插入2块的顶部 (刀片的另一侧) (图 2h)
  9. 确保坞站对齐 (图 2h)。
  10. 将锁紧螺钉 (部分 7) 插入坞站 (图 2i)。
  11. 向前推一块 3 (黑色) 以覆盖锁定螺钉。
    注意: 不要将手指放在刀片出口上。
  12. 激活向前推进的工具 4, 并观察工具外部的刀片。
  13. 将刀片4拉回工具中 (可随时使用)。
    注: 只有当工具已穿透组织内所需的距离进行活检时, 才应激活刀片。
2. 确保奶牛有足够的镇静剂, 活检部位被充分麻醉。收缩皮肤, 确保无反应。
3. 用10刀在从近端到远端的皮肤和皮下组织中进行2到3厘米的垂直切口。
4. 使用无菌技术将活检仪器连接到无绳钻头上。
5. 将钻头放在活检工具上, 并检查该工具是否牢固地固定在钻头上。
6. 在所有手术过程中, 让个人抬起尾巴, 以确保充分的克制。
7. 使用顺时针旋转和低速打开钻头。
  注: 钻头不是无菌的, 操作人员在使用钻头时不会保持无菌状态。
8. 当钻头旋转收费时, 将整个活检工具 (约7.5 厘米) 通过切口进入乳房。
9. 关闭钻头, 手动扩展工具的一块4。
10. 使用顺时针旋转和低速打开钻头。
11. 从乳房上取下含有组织芯的仪器。
12. 用无菌毛巾立即对伤口施加强烈的压力至少20分钟。
  注: 让助手使用拳头执行此操作, 以确保施加足够的压力。
13. 使用推子从活检工具中取出组织。
14. 将样品保存在1x 磷酸盐缓冲盐水中, 并评估组织的数量。
15. 活检后每 1 0分钟服用一次牛的生命体征, 至少 3 0分钟。
16. 检查活检部位20分钟后是否出血。如果有滴落的血液继续施加压力5-10。
17. 在所有出血停止后, 每隔5毫米使用不锈钢订书针关闭切口。使用5到8个订书针。
18. 将气雾剂绷带应用于活检区域。
19. 手术后观察动物50分钟。
针活检仪
1. 按照制造商的设备说明进行操作。
2. 使用无菌技术从包装中取出活检针。
3. 如果观察到任何损坏, 请丢弃针头。
4. 将针头连接到设备。
5. 关闭机盖并旋塞设备。
6. 确保奶牛有足够的镇静剂, 活检部位被充分麻醉。收缩皮肤, 确保无反应。
7. 用10刀在从近端到远端的皮肤和皮下组织中进行1到2厘米的垂直切口。
  注: 活检针仪的切口可以小于核心活检仪器的切口 (1-2 厘米)。
8. 将活检针插入切口部位 (距离皮肤约 1 0 至 1 3 厘米)。
9. 激活活检针装置以收集组织。
10. 从乳房上取下针头。
11. 立即, 强烈的压力, 使用无菌毛巾至少20分钟的伤口。
12. 用推拿器从活检针上取下组织。
13. 将样品保存在1x 磷酸盐缓冲盐水中, 并评估组织的数量。
14. 活检后每10分钟取一次生命体征至少30分钟。
15. 检查活检部位20分钟后是否出血。
16. 所有出血停止后, 使用不锈钢订书针关闭切口。
17. 将气雾剂绷带应用于活检区域。
18. 手术后观察动物50分钟。

7. 活检后动物护理

记录所有给动物服用的药物。
注: 牛奶在手术后36小时内被丢弃;提取肉类的时间为 4d. 牛奶和肉类的提取期可能因国家或司法管辖区和所使用的药物而异。请查看当地的规章制度。
活检后7至10天检查牛奶中是否有血液。
在随后的挤奶时, 从活检区的手条血凝块, 并确保完全去除牛奶。
注: 在手术后, 预计1克挤奶区存在血块。活检后1至6天可以观察到牛奶中的血液。
观察产奶量, 如果可能的话, 观察个人每日摄入的饲料, 直到手术钉被取出。
每天两次监测动物的体温、呼吸和心率, 以及举止, 直到手术钉被摘除。
每天检查活检部位两次, 检查是否有肿胀、压痛和任何引流迹象, 直到手术钉被取出。如果观察到这些信息, 请咨询兽医。
注: 保持活检部位清洁, 并根据需要每一到三天重新使用气雾剂绷带。
活检后10至14天从切口部位取出订书针, 具体取决于愈合率。
如果发现任何局部或全身感染的迹象, 请咨询兽医。

Representative Results

在目前的方案中, 核心活检技术产生了200至600毫克的组织样本, 而针头活检产生了每次活检10至30毫克的样本。手术后, 每天对这些动物进行两次观察, 时间为10天。手术期间或术后期间没有发生并发症, 奶牛的重要参数保持在正常范围内 (平均呼吸率 = 平均每分钟31.4 ±7. 04 (sd), 平均心率 = 75±8.9 8.9/分钟, 和平均直肠温度 = 38.2±0.68°c,图 3)。

在活检区域的手动压力下实现止血 (约 25分钟) 后, 开放性伤口显示出血最小 (图 4)。在手术后的时间里, 给奶牛喂同样的饮食和脂肪, 把动物关在同一个住房设施里。这些动物在活检部位没有发现感染迹象;没有疼痛、出血、肿胀、引流或体温升高 (图 5)。伤口在活检的8至10d 内愈合 (图 5c)。

在手术后的第8天, 由于伤口摩擦, 一种动物出现了轻微的皮肤刺激。这头奶牛是通过使用 povidone-iodine 溶液和70% 异丙醇清洗活检部位来治疗的。将不锈钢钉取出, 以便引流, 每天在活检部位使用两次聚维酮碘软膏 (1%), 时间为2至3d。应用聚维酮-碘软膏后, 皮肤刺激消失 2 d, 伤口愈合后无进一步并发症。

在机器挤奶前, 用手从活检区取下牛奶的方法去除血块。在目前的协议中, 活检后观察到牛奶中存在的血块长达3英里 (约 3 3小时)。活检后观察到牛奶的血液污染长达48小时。在核心活检和针头活检之间没有观察到相对于牛奶中的血量的视觉差异。这些动物在手术后的产奶量没有显著下降 (图 6)。平均牛奶成分为4.37 脂肪, 3.34 蛋白质, 4.37 乳糖。平均牛奶体细胞计数 (scc) 低于每毫升 200, 000个细胞。

获得的 mg 组织可用于不同的研究目的, 如原代细胞培养 (图 7)。

图 3.动物健康指标的评估在牛乳腺活检后请点击这里查看此图的较大版本.

图 4.在活检区域应用人工压力后的活检部位外观, 以实现止血.请点击这里查看此图的较大版本.

图 5.活检现场照片.(a) 手术后的活检部位为 3天.(b) 手术后6点活检部位.(c) 活检部位 10 d 后的程序, 说明伤口已充分愈合。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6.牛乳腺活检前后的每日产奶 (n = 3 头牛).一个线性模型估计, 在活检前 10天, 这些动物每天生产 23, 23.35 公斤牛奶。虽然观察到产奶量略有增加 (从活检前10天起每天增加0.0005 公斤/), 但产奶量从活检前10天的10天到活检后10天均无明显变化 (p > 0.05)。本协议中使用了三种动物;一种动物被活检了两次 (动物 1: 核心活检在乳房的左侧和针活检在乳房的右边) 和二动物被活检一次 (动物2和 3: 仅在乳房的右边使用核心针做法)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 7.有代表性的牛乳腺上皮细胞培养的代表图像.刻度栏为 100μm. 请点击此处查看此图的较大版本.

Discussion

核心和针活检方法在^{这个协议 9}^,¹⁶中描述了。在这两个程序进行活检之前, 需要对动物健康和乳腺炎¹⁴的发病率进行详细评估。为了研究的目的, 应避免在有明显炎症或传染病迹象的动物身上实施这项技术。这将减少活检期间和之后出现并发症的风险。所有活检仪器和装置都应清洁、消毒和消毒, 以避免对活检部位造成污染。在手术前, 有必要尽量减少手术部位感染 (ssi)。一般来说, ssi 与奶牛的动物发病率、性能损失和较高的生产成本有关。此前报告的预防性传播感染的方法包括在切口部位周围剪掉头发, 清洗活检区域以清除污染⁹^、^{14, 以及}使用消毒剂 (70% 的酒精, 碘手术)擦洗⁹, 2% 醋酸氯己定溶液¹⁴, 10% 聚维酮^-碘 8) 用于皮肤制备。在一些研究中, 抗生素的给药采用在⁷或活检^后立即 9;然而, 在目前的工作中没有使用抗生素预防, 也没有观察到活检部位的感染。为了防止活检伤口受到污染, 应固定尾巴, 以防止与活检部位接触, 直到使用气雾剂绷带。在这个协议中, 订书针在活检后大约 1 0 到 1 4 d 被取出。

在进行核心活检之前, 正确设置工具并将其连接到钻头是很重要的;选择慢速旋转速度, 选择正向旋转, 不要使用钻头的反向模式。在这个过程中, 重要的是要使用数字压力两侧的切口, 以保持皮肤边缘分开, 并有一个足够长的切口, 允许工具进入, 而无需接触皮肤或结缔组织。如果不这样做, 在核心活检仪器旋转过程中, 切口边缘可能会出现阻力, 并导致额外的皮肤组织创伤, 这将增加感染的风险, 并可能延迟伤口愈合。该方案中描述的目前的活检程序是由一名经委员会认证的大型动物外科医生进行的。这些过程已成功执行 (图 5)。与手术切除手术相比, 这两种技术都相对容易和快速地执行。

在奶牛⁸^、⁹^、¹⁰^、^{14 的}mg 活检后, 活检部位的出血很常见。在本议定书中, 观察到的出血很少 (图 4), 这可能是由于在手术后立即对伤口施加了足够的 (强) 压力。需要至少20分钟的强大压力, 在某些情况下可能需要30分钟以上的压力。如果在活检部位施加压力后观察到中度至重度出血, 建议继续施压, 并立即与兽医联系。

由于止血是降低奶牛发病率的重要因素, 一项研究将止血垫包装到活检部位, 以控制出血 9.然而, 以这种方式使用止血垫, 在奶牛场环境中具有很高的微生物污染风险。另一项研究¹⁴在反复活检和活检后以及皮肤闭合之间对活检部位施加手动压力, 并在活检后对活检部位施加至少2小时的冰。在目前的方案中, 对活检部位施加 2 0 至 2 5分钟的强压力足以控制出血。

成功的活检技术应导致最低血液在牛奶持续很短的时间后, 手术后。为避免牛奶分泌中断, 在牛奶下降和乳腺炎感染, 玛丽腔内血块应通过手剥离从活检季度¹⁰^,14。在目前的方案中, 活检后48小时内就在牛奶中观察到血液。然而, 在一项使用大量动物的研究中, 大多数奶牛在不到6天的时间里观察到牛奶中的血液。在6天后^{8 后,}很少有动物在牛奶中显示血液。因此, 每天观察牛奶的外观是必要的 6 d 后的程序。当获得一个大的组织样本14时, 动物没有表现出任何乳腺炎感染的迹象。然而, 此前使用针头对同一动物进行反复活检的研究发现, 在手术⁸后, 乳腺炎的感染率约为12%。在目前的方案中, 两种动物在手术后都没有临床乳腺炎感染的视觉迹象。还有一个轻微的可能性, 切口部位可能会成为感染后活检。

盐酸托拉唑啉是一种逆转镇静作用的药物, 在西拉津过量的情况下应该可以使用。过量服用木拉嗪可能会导致肺水肿。肺水肿的临床症状包括呼吸窘迫、严重呼吸困难、呼吸困难、咳嗽和痰霜。如果观察到肺水肿的迹象, 建议使用托拉嗪 (2 至 4 mg"体重) 来扭转西拉津的影响。

目前的协议描述了执行针活检和核心活检的技术。一般来说, 与针活检相比, 核心活检的优势是组织样本较大 (0.75 至 1 g)⁹ , 对乳房健康的负面影响最小。针活检是一种比核心活检仪器侵入性较低的方法。然而, 多次活检尝试获得更多的组织使用针活检程序可能会增加手术后大出血的风险, 以及牛奶中的血块。这两种技术都能将奶牛发病率降至最低, 只需对手术人员进行最少的培训, 就能很容易地实现这两种技术。在进行核心活检和针头活检后, 预计每日产奶量 (下降 8 % 至 1 0%) 及其成分9和饲料摄入^量将分别减少14。针头活检程序的局限性是用针头切除的小体积组织。只有当针头在组织内进行活检, 并且通常需要多次尝试才能获得足够数量的组织时, 才需要激活该仪器, 这会增加手术后牛奶和乳腺炎中血液的风险。核心活检的局限性包括, 如果获得大量组织 (gt;200 毫克), 手术后出血的风险较高。此外, 活检工具更难以组装, 需要在使用前进行适当的培训。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了国家动物营养计划和弗吉尼亚理工的支持。感谢 tara pilonero 女士、julie settlage 博士和 itabelle Teixeira 博士的技术援助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Isopropyl alcohol	Walmart	565106257	1 L
Aerosol spray to kill and repel flies	MWI	14339	1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm	C. R. Bard	MN1216	2
Butterfly infusion set (18 G needle)	Fisher	22-258087	1
Cell culture dishes	Fisher	08-772E	4
Cordless drill (low speed)	Hitachi	DS10DFL	1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996)			2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows			cattle healthy
Flunixin meglumine	MWI/VetOne	501018	1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table	Amazon		1
Forceps	Fisher	09-753-50	1
Gloves non-sterile	Fisher	17-200-845	9, size dependent
Hard brush	Sullivan Supply	18270	1, to wash the cows
Head gate			1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable	MWI/VetOne	510212	6 mL was used, from 3 to 8 mL
Livestock body wash	eZall Technologies	39384	1, to wash the cows
Needle 18 G (1 to 1/5“)	Fisher	14-821-15A	6
Needle 20 G (1 to 1/5“)	Fisher	14-815-526	6
Phosphate buffered saline (0.9%)	Fisher	20-012-043	1 L
Povidone Iodine ointment	Jeffers	#VED1A	500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine)	MWI/VetOne	510094	1 L
Reusable biopsy instrument	C. R. Bard	MG1522	1
Rope halter	Nasco farm and ranch	C10852	2, cow size
Scalpel blades (#10)	MWI	033870	2
Scalpel holders (#3)	MWI	602008	1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in.	Fisher	19-130-0038	1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges	Fisher	22-037-986	4
Sterile gauze pads	Fisher	19-090-735	4
Sterile surgical gloves	Surgical gloves	19-166-679	3, size dependent
Sterile surgical towels	Fisher	50-118-0339	6
Stethoscope	Littmann Master Classic II	1392	1
Surgical clipper	Oster A5	078005-010-003	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 )	Oster	78919-016	1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover	MWI	541	1
Surgical stapler pre-loaded	MWI	17713	5
Syringes of 10 mL	Fisher	14-823-224	3
Syringes of 2 mL	Fisher	22-028854	3
Syringes of 20 mL	Fisher	22-034507	3
Syringes of 5 mL	Fisher	22-028855	3
Thermometer	Agri-Pro Enterprises Inc	72000	1
Tolazine hydrochloride	Akorn Animal Health	61311-486-10	2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer	Fisher	14-955-025	1, for handle the tissue sample
Water hose	Miracle-Gro, Walmart	554990501	1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg)	MWI	010728	1 bottle
Xylazine hydrochloride	MWI/VetOne	510650	0.01 to 0.05 mg/kg of body weight