Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvæg mælkekirtlen biopsi teknikker

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

Denne artikel præsenterer en kvæg mælkekirtlen biopsi ved hjælp af kerne og nål biopsi værktøjer. Høstede væv kan bruges til cellekultur eller at vurdere brystkirtler fysiologi og metabolisme, herunder Gen-ekspression, protein udtryk, protein ændringer, immunhistokemi og metabolitten koncentrationer.

Abstract

Kvæg mælkekirtlen biopsier giver forskere til at indsamle vævsprøver for at studere cellebiologi herunder genekspression, histologiske analyse, signalering veje og protein oversættelse. Denne artikel beskriver to teknikker til biopsi fra kvæg mælkekirtler (MG). Tre sunde Holsten malkekøer var emnerne. Før biopsier, blev køerne malket og efterfølgende tilbageholdende i en kvæg sliske. En smertestillende (flunixin meglumine, 1.1 til 2,2 mg/kg legemsvægt) blev administreret via jugularis intravenøs [IV] injektion 15-20 min før til biopsi. For stående sedation, xylazinhydrochlorid (0,01-0,05 mg/kg kropsvægt) blev sprøjtet via de halebenshvirvel fartøjer 5-10 min før proceduren. Når tilstrækkeligt bedøvet, biopsi webstedet var aseptisk forberedt og lokalt bedøvet med 6 mL 2% lidocain hydrochlorid via subkutan injektion. Ved hjælp af aseptisk teknik, foregik en 2 til 3 cm lodret snit ved hjælp af en række 10 skalpel. Kerne og nål biopsi værktøjer blev brugt. Core biopsi værktøj var knyttet til en Akku boremaskine og indsat i MG væv gennem incisionen ved hjælp af handlingen clock-wise boremaskine. Værktøjet nål biopsi blev manuelt indsættes i indsnit site. Umiddelbart efter proceduren anvendes en assistent pres på indsnit stedet for 20-25 min. ved hjælp af en steril håndklæde for at opnå hæmostase. Rustfrit stål kirurgisk hæfteklammer blev brugt til at modsætte sig hud indsnittet. Hæfteklammer blev fjernet 10 dage efter indgrebet. De vigtigste fordele ved kerne og nål biopsier er, at begge tilgange er minimalt invasive procedurer, der kan udføres sikkert i sunde køer. Mælkeydelse efter biopsi var upåvirket. Disse procedurer kræver en kort restitutionstid og resultere i færre risici for komplikationer. Specifikke begrænsninger kan omfatte blødning efter biopsi og infektion på webstedet biopsi. Anvendelser af disse teknikker omfatter væv samling for klinisk diagnose og forskningsmæssige formål, såsom primær cellekultur.

Introduction

En biopsi er en procedure til at høste en core afsnit af væv fra fag til medicinske eller forskningsmæssige formål. Det er en minimalt invasiv og udbredt teknik til at indsamle væv som et alternativ til dødshjælp1 for at tillade analyse af væv svar til behandling eller andre faktorer af interesse. Prøver af kvæg mælkekirtlen (MG) væv er afgørende for mejeri forskning til at studere gen- og protein udtryk, histologi, organisation af cellulære organeller, signaling veje og metaboliske processer som svar på ændringer i ledelse eller den miljø. Derudover MG væv er nødvendig for at diagnosticere og forskning visse smitsomme sygdomme, såsom kvæg mastitis forårsaget af bakterielle infektioner2.

Yveret af kvæg indeholder fire separate kirtler og hver kirtel indeholder en uafhængig mælk sekretoriske system kollektivt kaldet parenkym. Alveolerne, kanalerne og bindevæv er til stede i den mammary parenkym. Alveolerne er mikroskopiske sfæriske hule strukturer, der er sammensat af epitelceller i den indre overflade (luminale) og specialiserede myoepithelial celler på den ydre overflade (basal). Alveolerne er ansvarlig for syntese og sekretion af mælk. Fibrøst bindevæv væv til stede i parenkym kan adskille en gruppe af alveolerne fra andre grupper af alveolerne, og hver gruppe kaldes en lobule3. Flere faktorer kan påvirke udvikling og funktion af en MG, herunder animalske fysiologi, ernæring, management, genetik og miljø4. Mastitis er også en kritisk faktor, der negativt påvirker MG funktion og mælk kvalitet5. De giftstoffer, der frigives ved mastitic patogener kan beskadige alveolerne og fremkalde nekrose resulterer i biokemiske og histologiske forandringer i MG væv6. Således, histologi og metaboliske processer i hver alveolerne eller lobule i en MG kan være betydeligt forskellige fra andre. Som sådan, er biopsier, der er repræsentative prøver af hele mælkekirtlen ønskeligt. Små biopsier kan kun fange en enkelt lobule eller individuelle alveolus, begrænse den resulterende videnskabelige eller diagnostiske oplysninger. Til forskningsformål, er det nødvendigt at være opmærksom på, at en brystkirtler biopsi giver en 'snapshot' af væv egenskaber men en biopsi ikke tilstrækkeligt karakterisere samlede brystkirtler funktion i mangel af skøn over samlede mælkekirtlen masse.

Flere biopsi værktøjer er blevet udviklet over de sidste 30 år til human brug. I øjeblikket, er tilpasninger af disse instrumenter tilgængelige til brug med dyr. For malkekvæg, er prøver af MG væv opnået ved hjælp af forskellige teknikker herunder kirurgisk excision (stumpe dissektion)7og biopsi nåle1,8core biopsi instrumenter9,10. Således har MG biopsi teknikker i ammende malkekøer skiftet fra procedurer ved hjælp af liggende sedation med kirurgisk dissektion bruger Elektrokauterisation hæmostase i 19927 til samling af core biopsier under stående sedation9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi er en invasiv metode, som kan være dyrt og har en højere forekomst af komplikationer f.eks hæmatom, sår problemer, og tumor sprede13. I øjeblikket, er core biopsi og nål biopsi (også kendt som en tru-cut biopsi) blevet bredt vedtaget som alternativer til kirurgisk biopsi. Fordelene ved core og nål biopsier i forhold til kirurgisk biopsi omfatter: proceduren er minimalt invasiv; større komplikationer er sjældne. generel anæstesi er ikke påkrævet; proceduren er relativley hurtig; restitutionstid er kort; der er minimal negative virkninger på yveret sundhed og kun kortsigtede effekter på mælk udbytte og sammensætning8,9,10; og prisen er mindre end kirurgisk biopsi13.

Én kerne biopsi procedure beskrevet i 1996 bruges en steril, rustfrit stål kanyle med en aftagelig løftbare blade til at fjerne en repræsentativ mængde væv fra kvæg MG uden generel anæstesi9,10,11 ,12. Under proceduren, var instrumentet knyttet til en Akku boremaskine til at skabe en lav hastighed, roterende bevægelse, som rent skåret en væv kerne, mens værktøjet var rykkede ind i vævet. Fordelen var en større væv prøve (70 mm x 4 mm i diameter, omkring 0,75 til 1 g) 9. En nylig undersøgelse10 viste, at den biopsi procedure beskrevet af V. C. Farret al. 9 kan bruges til at udføre gentagne MG væv samlinger uden negativ indvirkning på performance og yveret sundhed af ammende malkekøer. Senest har blev en undersøgelse14 udført i malkekøer at evaluere gentagne biopsier for MG ved hjælp af en større trokar (31 cm lang, ydre diameter på 9,5 mm, indvendig diameter 8 mm) med vakuum påføres en indre rustfrit stål kanyle til at indsamle biopsi . Denne metode anvendes sedation (xylazin) og lokal bedøvelse (2% lidocain hydrochlorid).

Nål biopsi er en anden teknik til at indsamle brystkirtler væv. Flere undersøgelser har vedtaget denne teknik. Én undersøgelse1 brugt sedation (detomidin) og lokalbedøvelse (1% lidocain) i proceduren. Efter biopsi modtaget køerne en profylaktisk antibiotisk behandling. Mælkekirtlen var manuelt masseres, før og efter malkning. Blod i mælken blev observeret for op til 84 h efter biopsi. Mængden og sammensætningen af mælken blev berørt i en kort periode. For nylig bruges en undersøgelse en biopsi nål til at udføre gentagne MG biopsier i malkekøer8. Sedation (1% Acepromazin, intramuskulært) og lokal bedøvelse (2% lidocain hydrochlorid, subkutan) blev administreret til dyrene. Dyrene fik ikke Intramammare narkotika eller antibiotika, før eller efter proceduren, og der var ingen tegn på infektion på webstedet biopsi i den postoperative periode. I denne undersøgelse havde gentagne bovin MG biopsier ved hjælp af en nål en mindre negativ indvirkning på mælk produktion og yveret sundhed af malkekøer. Generelt, synes nål biopsi at være en mindre invasiv metode end core biopsi instrument. Som nævnt tidligere, er det imidlertid afgørende for biopsi teknik til at høste et repræsentativt udsnit af MG væv. Begrænsning af en nål biopsi er at en lille mængde af kvæg MG væv er opnået (ca. 20 til 25 mg)8,15.

Næsten alle undersøgelser anvendes en kombination af α-2 agonist sedation og lokalbedøvelse8,9,10, hvorvidt biopsi var via en nål eller en større kerne. I den bovin MG er de fleste nerveender forbundet med huden. Innervation til parenkymalt væv er i vid udstrækning via stræk receptorer med sparsom Type en nerve fibre at opdage skarp kirurgisk smerte. Som et resultat, fysiologiske mekanismer af smerter på grund af kirurgisk manipulation af en MG er via hud og subkutane væv3 og ikke dyb væv såsom parenkymalt væv. Derfor, til biopsi procedurer, det er kun nødvendigt at lokalt bedøver huden og det subkutane væv, som infiltration af lokalbedøvelse ind i dybere væv, ikke reducere kirurgiske smerte. Efter en passende forberedelse af området biopsi, ønsker animalske ubehag er primært tilknyttet tilbageholdenhed.

Samling af større kerne prøver kan øge hæmatom dannelse og øge risikoen for infektion i MG parenkym. Derfor, peri-operative protokoller ofte omfatte administration af parenteral antibiotika7, selv om der ikke er universals8. At opnå hæmostase er også en vigtig faktor for at mindske ko sygelighed. I den førnævnte undersøgelse ved hjælp af en stor kerne biopsi instrument14, manuel pres blev anvendt til webstedet biopsi og en ko BH blev brugt til at anvende is til sår i mindst 2 timer efter proceduren. Trods den store mængde af væv høstet, kun lille reduktion af feed indtag og mælk udbytte blev observeret, og proceduren blev gentaget hver tre uger uden negative virkninger på ko sundhed.

Forskere udfører MG biopsi i malkekøer skal overveje den resulterende biopsi diagnostiske eller analytiske kvalitet, nem teknik, og ko sygelighed. Nøjagtige og forudplanlagte kirurgiske teknikker er bydende nødvendigt at nå disse mål. Til dato, MG biopsi undersøgelser har fokuseret på at beskrive biopsi resultater, i modsætning til beskriver biopsi teknikken, sig selv, og beskrivelser for ammende malkekøer mangler tilstrækkelig detaljerede til at muliggøre replikering. Således er var formålet med dette arbejde at beskrive både nål biopsi og større core biopsi teknikker i tilstrækkelig detaljerede til at muliggøre sikker og human replikering af MG biopsi af kvæg.

Protocol

Alle metoder beskrevet blev godkendt af Virginia Tech institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).

1. det personel

  1. Har mindst to assistenter med kirurgisk og ko-håndtering oplevelse.
  2. Træne alle assistenter mindst tre gange, hvis det er muligt ved hjælp af dødt materiale, før du udfører procedurer i forbindelse med denne protokol på levende dyr.
    Bemærk: Uddannelsen skulle dirigeres af en instruktør, der har været tidligere uddannet og udført teknikken.
  3. Har en stor dyr dyrlæge på-hånd for drug administration og i tilfælde at akut behandling bliver nødvendig under proceduren. Nødsituationer, som kan opstå under denne procedure omfatter, men er ikke begrænset til: blødning, α-2 agonist overdosis og lungeødem, opstød og aspiration af fødevarer materiale, smerte og patient modstand kræver yderligere sedation.

2. forberedelse af kirurgiske instrumenter, forsyninger og facilitet

  1. Opgørelse og køber alt udstyr og forsyninger (Se Tabel af materialer).
  2. Ren og autoklave kirurgisk gardiner, biopsi instrumenter, skalpel indehavere, kirurgisk håndklæder og pincet.
  3. Har en korrekt størrelse klemme sliske og hoved gate til at begrænse køerne.
  4. Skabe en arbejdsplads med et bord i nærheden klemme sliske.
  5. Sikre at arbejdsområdet er rent og har begrænset ko gennem-trafik.
  6. Organisere udstyr og forsyninger i arbejdsplads for nem adgang.
  7. Have ordentlig belysning inde i arbejdsområdet.

3. forberedelse af dyrene

  1. Én dag før den planlagte biopsi, vask og skrub dyr, især yver til at fjerne gødning og snavset materiale.
  2. Følg procedurerne for sikker og human tilbageholdenhed af kvæg.
  3. Forud for biopsi og igen på tidspunktet, biopsi, vurdere sundhed, fysisk tilstand og adfærd af dyret.
    Bemærk: En minimumseksamenskravene omfatter temperatur, puls, og respiratorisk satser samt undersøgelse for dermatitis over den foreslåede operationsstedet eller andre områder af bakteriel infektion. Indsamle mælkeprøver fra hvert kvartal og tjekke for mastitis.
  4. Brug kun sunde køer.
  5. Helt mælk koen.
  6. Flytte dyret i klemme sliske, ideelt inden for 2 timer efter malkningen til at minimere mælk tilstedeværelse i kirtler.
  7. Dy dyret med en hoved gate.

4. analgesi og sedation

  1. Placere et reb grime på hovedet af ko til at forhindre bagud og fremadgående bevægelse.
  2. Trække dyrets hoved til den ene side, og binde reb at klemme sliske ved hjælp af en hurtig frigivelse knude for at holde hovedet på plads.
  3. Rense området af injektion med en 70% isopropylalkohol svaber og administrere flunixin meglumine (1.1 til 2,2 mg/kg legemsvægt) intravenøst via halsfedt 15-20 min før til biopsi.
    Bemærk: I nogle protokoller, non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler er administreret efter biopsi, hvis anti-inflammatoriske lægemidler ikke vil påvirke forskningsresultater.
    1. Find halsfedt.
    2. Hæve halsfedt ved anvendelse af pres på bunden af den jugularis groove.
    3. Du kontrollere, at der er ingen bobler i sprøjten.
    4. Indsætte nålen i den hævede halsfedt og trække 0,5 mL blod i sprøjten to gange og bland med indholdet. Viser ingen blod i sprøjten, Flyt nålen. Hvis nålen har bopæl i venen, injicere indholdet.
    5. Forsigtigt fjerne nålen.
    6. Anvende gaze med blide tryk på injektionsstedet at forhindre blødning.
  4. Administrere xylazinhydrochlorid intravenøst (0,01 til 0,05 mg/kg legemsvægt) i halebenshvirvel fartøjet ca 5-10 min. før biopsi at give tilstrækkelig tid til etablering af sedation.
    Forsigtig: Kontrollere dyr for tegn på lungeødem. Kliniske tegn på lungeødem omfatter respirationsbesvær, svær dyspnø, åndedrætsbesvær, hoste, skummende spyt og blå tunge. Hvis tegn på lungeødem er observeret, anbefales det at bruge tolazine (2-4 mg/kg legemsvægt) til at tilbageføre xylazin effekter.
    1. Rejse halen og rense området af injektion med en 70% isopropylalkohol vatpind.
    2. Du kontrollere, at der er ingen bobler i sprøjten.
    3. Indsætte nålen i hale skibet, trække 0,2 mL blod i sprøjten og bland med indholdet til sikre nålen er bosiddende i fartøjet. Hvis nålen har bopæl i fartøjet, injicere sprøjte indholdet.
    4. Forsigtigt fjerne nålen.
    5. Anvende gaze med blide tryk på injektionsstedet.

5. forberedelse af biopsi webstedet

  1. Have en assistent, binde op hale under proceduren.
  2. Vælg webstedet biopsi på yveret (typisk i et øvre område at minimere samling af bindevæv og undgå indtrængen i kirtel cisternen, figur 1), og fjerne enhver snavset materiale fra webstedet valgte biopsi.

Figure 1
Figur 1 . Billede af kvæg yveret illustrerer biopsi webstedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

  1. Observere og palpere huden med særlig vægt på at identificere eventuelle store subkutane blodkar for at undgå disse fartøjer under biopsi.
  2. Klip håret fra en 15 cm x 15 cm området omkring biopsi webstedet.
  3. Forberede biopsi område med povidon-jod (0,75% tilgængelige jod) eller klorhexidin gluconat krat. Skiftevis med 70% isopropylalkohol mindst tre gange til at fjerne alle synlige og usynlige snavs. Anvend aseptisk krat løsning og isopropylalkohol i en cirkulær bevægelse ved hjælp af inside-out tilgang. Sikre, at den antiseptiske krat løsning forbliver i kontakt med huden i mindst 5 min.
  4. Bruge en sommerfugl infusion sæt med en 18 G nåle til at deponere 6 mL 2% lidocain hydrochlorid subkutant på indsnit stedet for at oprette en linje-blok. Ikke trænge ind i dybere væv.
    Bemærk: Dosering af lidocain varierer mellem 3 og 8 mL.
  5. Tillad lokalbedøvelse til diffuse for 3-5 min. udføre en anden gentagelse af krat løsning og alkohol før indsnit. Mens vi venter, forberede biopsi instrumenter.

6. biopsi procedure

  1. Bruge aseptisk teknik, når du håndterer biopsi værktøjer og snit.
  2. Vaske hænder for at fjerne alle synlige forurening og anvende steril kirurgiske handsker.
  3. Arrangere de kirurgiske instrumenter i en steril område anvendes i flg. Har et nummer 10 skalpel, steril gaze, en samlet biopsi instrument og en steril håndklæde for hæmostase.
    Bemærk: Følg Procedure 1 til at udføre en Core biopsi eller Procedure 2 til at udføre en nål biopsi.

Figure 2
Figur 2 . Skematisk fremstilling af montage og opsætning af værktøjet core biopsi beskrives af V. C. Farr, et al. 9 skalalinjen er 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Core biopsi Instrument (Farr et al.9)
    1. Samle core biopsi instrument bruger sterile handsker (figur 2).
      1. Placer de 7 sterile stykker på en steril drapere (figur 2A).
      2. Indsæt blade (stykke 1) i docking-systemet på stykke 2 (figur 2B ).
        Advarsel: Anbring ikke fingrene direkte i linjen blade.
      3. Indsæt stykke 3 på toppen af stykke 2 (figur 2 c) at sikre at docking-stationen vil justere.
        Bemærk: Observere et docking-system i den indre væg af stykke 4 (figur 2D).
      4. Engagere den endelige kanten af bladene (stykke 1) ind i docking-systemet af stykke 4 (figur 2D).
      5. Skub stykke 4 og observere hvis stykke 4 er ved siden af stykke 3 (figur 2E).
      6. Indsæt stykke 5 på enheden (blade + stykke 2) (figur 2F).
      7. Sikre at dockingstationen er justeret (fig. 2 g).
      8. Indsæt stykke 6 i toppen af stykke 2 (modsatte side af vingen) (figur 2 H)
      9. Sikre at dockingstationen er justeret (figur 2 H).
      10. Indsæt låsning skruen (stykke 7) i docking-stationen (figur 2I).
      11. Skub stykke 3 (sort) til at dække låsning skruen.
        Advarsel: Anbring ikke fingrene på afkørslen blade.
      12. Aktivere værktøjet skubber fremad stykke 4 og observere klinge uden for værktøjet.
      13. Trække stykke 4 tilbage for at trække kniven ind i værktøjet (klar til brug).
        Bemærk: Klingen bør aktiveres kun når værktøjet har gennemtrænges den ønskede afstand inde i vævet skal biopsi.
    2. Sikre, at koen er tilstrækkeligt bedøvet og biopsi webstedet er tilstrækkeligt bedøvede. Knivspids hud for at sikre ingen reaktion.
    3. Lave en 2 til 3 cm lodret snit gennem hud og subkutane væv fra proksimalt for distale ved hjælp af en række 10 skalpel.
    4. Tillægge en Akku boremaskine med steril teknik biopsi instrument.
    5. Placere boret mod værktøjet biopsi og kontrollere, hvis værktøjet er solidt fastgjort til boret.
    6. Sikre tilstrækkelig tilbageholdenhed ved at have en individuel løfte halen under alle procedure.
    7. Drej på boret ved hjælp af uret og en lav hastighed.
      Bemærk: Boret er ikke sterilt, og operatøren forbliver ikke sterile, når du bruger boret.
    8. Rykke hele biopsi værktøj (omkring 7,5 cm) ind i yveret gennem incisionen, mens boret roterer vejafgiften.
    9. Slå rutinen og manuelt udvide stykke 4 af værktøjet.
    10. Drej på boret ved hjælp af uret og lav hastighed.
    11. Fjern det instrument, der indeholder væv kernen fra yveret.
    12. Anvende stærkt pres straks at såret ved hjælp af en steril håndklæde i mindst 20 min.
      Bemærk: Har assistent udføre dette ved hjælp af deres næve for at sikre tilstrækkelig tryk anvendes.
    13. Fjern væv fra biopsi værktøj med pincet.
    14. Hold prøven i 1 x phosphat bufferet saltvand og vurdere mængden af væv.
    15. Tage koens vitale tegn hver 10 min efter biopsi i mindst 30 min.
    16. Kontroller, om blødning efter 20 min for pres på webstedet biopsi. Hvis der er drypper af blod fortsat pres for en yderligere 5-10 min.
    17. Luk de indsnit ved hjælp af rustfrit stål hæfteklammer med 5 mm mellemrum efter alle blødningen er stoppet. Bruge mellem 5 og 8 hæfteklammer.
    18. Anvende en aerosol bandage til området biopsi.
    19. Observere dyr for 50 min. efter indgrebet.
  2. Nål biopsi Instrument
    1. Følg producentens vejledning til enheden.
    2. Fjerne biopsi nålen fra pakken med steril teknik.
    3. Kassér nålen, hvis nogen skader er observeret.
    4. Vedhæfte nålen til enheden.
    5. Luk dækslet og pik enheden.
    6. Sikre, at koen er tilstrækkeligt bedøvet og biopsi webstedet er tilstrækkeligt bedøvede. Knivspids hud for at sikre ingen reaktion.
    7. Lave en 1 til 2 cm lodret snit gennem hud og subkutane væv fra proksimalt for distale ved hjælp af en række 10 skalpel.
      Bemærk: Snit for biopsi nål instrument kan være mindre (1-2 cm) end for core biopsi instrument.
    8. Indsætte biopsi nålen i snit websted (omkring 10 til 13 cm fra hud).
    9. Aktivere enheden biopsi nål for at indsamle væv.
    10. Fjern nålen fra yveret.
    11. Anvende umiddelbare, stærkt pres på såret ved hjælp af en steril håndklæde i mindst 20 min.
    12. Fjern væv fra biopsi nålen med pincet.
    13. Hold prøven i 1 x phosphat bufferet saltvand og vurdere mængden af væv.
    14. Tage vitale tegn hver 10 min efter biopsi i mindst 30 min.
    15. Kontroller, om blødning efter 20 min for pres på webstedet biopsi.
    16. Luk de indsnit ved hjælp af rustfrit stål hæfteklammer jo blødningen er stoppet.
    17. Anvende en aerosol bandage til området biopsi.
    18. Observere dyr for 50 min. efter indgrebet.

7. efter biopsi dyrs pleje

  1. Dokumentere alle lægemidler til dyr.
    Bemærk: Mælk blev kasseret i en periode på 36 h efter procedure; kød tilbagetrækningen var 4 d. tilbageholdelsestider for mælk og kød kan variere afhængigt af landet eller jurisdiktion og de lægemidler, der anvendes. Tjek venligst lokale regler og bestemmelser.
  2. Check for tilstedeværelse af blod i mælk for 7 til 10 d efter biopsi.
  3. Hånd strip blodpropper fra biopsi kvartal på efterfølgende malkninger og sikre komplet mælk fjernelse opstår.
    Bemærk: Forekomst af blodpropper ved den biopsi kvartal for 1-3 malkninger efter proceduren, der er forventet. Blod i mælken kan observeres for 1 til 6 d efter biopsi.
  4. Observere mælk udbytte, og om muligt den individuelle daglige foder indtag indtil kirurgisk hæfteklammer er blevet fjernet.
  5. Overvåge dyret to gange om dagen til kropstemperatur, respiration og hjerte satser og opførsel, indtil kirurgisk hæfteklammer er blevet fjernet.
  6. Kontrollere biopsi webstedet to gange dagligt til hævelse, ømhed, og eventuelle tegn på dræning, indtil de kirurgiske hæfteklammer er blevet fjernet. Hvis disse er observeret, konsultere en dyrlæge.
    Bemærk: Holde biopsi webstedet ren og genanvende aerosol bandage hver en til tre dage efter behov.
  7. Fjerne hæfteklammer fra webstedet indsnit 10 til 14 d efter biopsi, afhængigt af den helbredende sats.
  8. Konsultere en dyrlæge, hvis nogen tegn på lokal eller systemisk infektion observeres.

Representative Results

I denne protokol, core biopsi teknik udarbejdet vævsprøve af 200 til 600 mg mens nål biopsi produceret prøver af 10-30 mg pr. biopsi. Dyrene blev observeret to gange om dagen for 10 d efter proceduren. Ingen komplikationer opstået under proceduren eller i perioden efter operationen med vitale parametre af køerne resterende inden for normale grænser (gennemsnitlig respirationsfrekvens = 31,4 ± 7,04 (SD) vejrtrækninger pr. min, gennemsnitspuls = 75.9 ± 8,9 slag pr. min, og den gennemsnitlige rektal temperatur = 38,2 ± 0,68 ° C, figur 3).

Efter manuel pres på området biopsi at opnå hæmostase (ca 25 min), viste det åbne sår, minimal blødning (figur 4). Køer blev fodret den samme kost ad libitum, og dyrene blev holdt i den samme bolig facilitet i den postoperative periode. Dyrene ikke viser tegn på infektion ved biopsi webstedet; der var ingen smerter, blødning, hævelse, dræning, eller forhøjet temperatur (figur 5). Sår helet inden for 8-10 d af biopsi (figur 5 c).

Et dyr udviklet mindre hudirritation grund til sår gnide på dag 8 efter indgrebet. Denne ko blev behandlet af rengøring biopsi webstedet ved hjælp af povidon-jodopløsning og 70% isopropylalkohol. Rustfrit stål hæfteklammer blev fjernet for at tillade dræning og povidon jod salve (1%) blev anvendt to gange om dagen på webstedet biopsi for 2 til 3 d. Irritation af huden er forsvundet 2 d efter anvender povidon-jod salve og såret helede uden yderligere komplikationer.

Blodpropper blev fjernet ved hånd stripning af mælk fra den biopsi kvartal før maskinen malkning. I denne protokol, blev forekomst af blodpropper i mælken observeret for op til tre malkninger (ca 36 h) efter biopsi. Blod kontaminering af mælken blev observeret i op til 48 timer efter biopsi. Der var ingen visuelle forskelle observeret mellem kerne og nål biopsier i forhold til mængden af blod i mælken. Dyrene udviste ikke en betydelig nedgang i mælkeydelse efter procedure (figur 6). Gennemsnitlige mælk sammensætning var 4.37% fedt, 3,34% protein og 4,64% lactose. Den gennemsnitlige mælk celletal (SCC) var mindre end 200.000 celler pr. mL.

MG væv fremstillet kan anvendes til forskellige formål som primære cellekulturer (figur 7).

Figure 3
Figur 3 . Vurdering af dyrs sundhedsindikatorer efter kvæg mælkekirtlen biopsi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 . Biopsi webstedet udseende efter Manuel pres blev anvendt til området biopsi at opnå hæmostase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Biopsi webstedet fotografier. (A) biopsi webstedet 3 d efter proceduren. (B) biopsi site 6 d efter proceduren. (C) biopsi webstedet 10 d efter den procedure, der illustrerer, at såret var tilstrækkeligt helet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Daglige produktion af mælk før og efter kvæg mælkekirtlen biopsi (n = 3 køer). En lineær model anslået, at 10 dage før biopsi dyrene produceret 23.35 kg mælk pr. dag. At mælkeydelse ændrede ikke signifikant (P > 0,05) fra 10 dage før til 10 dage efter biopsi selvom en svag stigning i mælkeydelse blev observeret (stigning på 0.0005 kg/d mælk hver dag fra 10 dage før biopsi). Tre dyr blev brugt i denne protokol; et dyr var biopsi to gange (dyr 1: core biopsi på venstre side af yveret og nål biopsi på højre side af yveret) og to dyr engang var biopsi (dyr 2 og 3: kun på højre side af yveret ved hjælp af den kerne eller nål procedure). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Repræsentative billeder af primære bovine brystkirtler epitelceller kultur. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kerne og nål biopsi metoder blev beskrevet i denne protokol9,16. En detaljeret evaluering af dyrs sundhed og forekomsten af mastitis14 før biopsi er nødvendig for begge procedurer. Til forskningsformål, bør udfører teknikken i dyr med tydelige tegn på betændelse eller smitsomme sygdomme undgås. Dette vil reducere risikoen for komplikationer under og efter en biopsi. Alle biopsi instrumenter og anordninger skal være ren, desinficeret og steriliseret at undgå kontaminering af biopsi webstedet. Før proceduren er det nødvendigt at minimere operationssår (SSI). I almindelighed, er SSI forbundet med animalsk sygelighed, tabt ydeevne og højere produktionsomkostninger i malkekøer. Undersøgelser rapporteret tidligere metoder til at forhindre, at SSI på grund af biopsi herunder klipning af hår omkring den indsnit site, vaske området biopsi for at fjerne forurening9,14, og ved hjælp af antiseptiske agenter (70% alkohol, jod kirurgisk krat9, 2% klorhexidin acetat løsning14, 10% povidon-jod8) til klargøring af huden. I nogle undersøgelser, blev administration af antibiotika vedtaget under7 eller umiddelbart efter biopsi9; dog, antibiotika profylakse blev ikke brugt i det nuværende arbejde, og ingen infektioner af biopsi webstedet blev observeret. For at forhindre forurening af biopsi sår, skal halen beskyttes for at forhindre kontakt med webstedet biopsi indtil aerosol forbinding er blevet anvendt. I denne protokol fjernet hæfteklammer omkring 10 til 14 d efter biopsi.

Før en core biopsi er det vigtigt at ordentligt konfigurere værktøjet og tillægger drill; Vælg en langsom rotationshastighed, Vælg fremadrettet rotation, og brug ikke den omvendte tilstand af boret. Under proceduren er det vigtigt at bruge digital pres på begge sider af indsnittet at holde huden kanter fra hinanden og har en lang nok snit til at tillade værktøj post uden at kontakte hud eller bindevæv. Hvis denne procedure ikke gør det, kan et træk på indsnit kanter under rotation af core biopsi instrument opstå og forårsage yderligere hud væv traumer, som vil øge risikoen for infektion og kan forsinke sårheling. De nuværende biopsi procedurer, der beskrives i denne protokol blev udført af en Board-certificeret store dyr kirurg. Procedurerne, der blev udført med succes (figur 5). Begge teknikker er relativt nemt og hurtigt at udføre i forhold til kirurgisk excision procedure.

Blødning fra webstedet biopsi er fælles efter MG biopsi i malkekøer8,9,10,14. I denne protokol, blødning observeret var minimal (figur 4), hvilket kan skyldes anvendelsen af passende (stærk) pres på såret umiddelbart efter indgrebet. Stærkt pres i mindst 20 min. er påkrævet, og det kan være påkrævet i mere end 30 min i nogle tilfælde. Hvis moderat til svær blødning er observeret efter anvendelse af pres på webstedet biopsi, anbefales det at fortsætte pres, og straks kontakte en dyrlæge.

Som hæmostase er en vigtig faktor for at mindske ko sygelighed, pakket en undersøgelse hæmostatisk puder til biopsi webstedet for at kontrollere blødning9. Brug af hæmostatisk puder på en sådan måde har dog en høj potentiel risiko for mikrobiologisk kontamination i malkekvægsbedrift miljø. En anden undersøgelse14 anvendes manuel pres på biopsi webstedet mellem gentagne biopsier og efter biopsi og hud lukning og anvendes is til webstedet i mindst 2 timer efter biopsi. I denne protokol var stærk pression til biopsi webstedet for 20 til 25 min tilstrækkelig til at kontrollere blødning.

En vellykket biopsi teknik bør resultere i minimum blod i mælken, som fortsætter i en kort periode efter proceduren. For at undgå en afbrydelse af mælk sekretion under mælk skuffelse og mastitis infektioner, bør Intramammare blodpropper fjernes ved håndkraft stripning fra den biopsi kvarter10,14. I denne protokol, blev blod observeret i mælken op til 48 timer efter biopsi. Men i en undersøgelse, som benyttede et større antal dyr, blod i mælken blev observeret i størstedelen af køer til mindre end 6 dage. Få dyr viste blod i mælken efter 6 dage8. Af denne grund er daglig observation af mælk udseende nødvendige for 6 d efter proceduren. Dyr ikke udviser nogen tegn på mastitis infektion, når en stor vævsprøve blev opnået14. Tidligere forskning, som udføres gentagne biopsier på de samme dyr ved hjælp af en nål fandt imidlertid, at mastitis infektion forekomsten var ca. 12% efter procedure8. I denne protokol havde hverken dyret visuelle tegn på klinisk mastitis infektion efter indgrebet. Der er også en lille chance for, at webstedet snit kan blive smittet efter biopsi.

Tolazoline hydrochlorid, et stof, der tilbagefører virkningerne af sedation, bør være til rådighed i tilfælde af en overdosis fra xylazin. En overdreven dosis af xylazin kan forårsage lungeødem. Kliniske tegn på lungeødem omfatter respirationsbesvær, svær dyspnø, åndedrætsbesvær, hoste og skummende spyt. Hvis tegn på lungeødem er observeret, anbefales det at bruge tolazine (2-4 mg/kg legemsvægt) til at tilbageføre xylazin effekter.

Denne protokol beskriver teknik til at udføre både en nål biopsi og core biopsi. I almindelighed, er fordelen ved en core biopsi i forhold til nål biopsi større væv prøve (0,75 til 1 g)9 med minimum negative virkning på yveret sundhed. Nål biopsi er en mindre invasiv metode end core biopsi instrument. Men flere biopsi forsøg at opnå en større mængde væv ved hjælp af en nål biopsi procedure kan øge risikoen for store blødninger efter proceduren, samt blodpropper i mælken. Begge teknikker forårsaget minimal ko sygelighed og var nemt at opnå med minimal træning af kirurgiske personale. En kortsigtet ændring i daglige mælkeydelse (8-10% fald) og dens sammensætning9 og foderoptagelse reduktion14 forventes efter de kerne og nål biopsier, henholdsvis. Begrænsninger af nål biopsi procedure er den lille mængde af væv fjernes med nålen. Instrumentet skal aktiveres kun når nålen er inden for det væv at være biopsi og flere forsøg ofte er nødvendige for at opnå tilstrækkelige mængder af væv, hvilket øger risikoen for blod i mælk og mastitis efter indgrebet. Begrænsninger af core biopsi omfatter en højere risiko for blødning efter indgrebet, hvis en stor mængde af væv (> 200 mg) er opnået. Derudover er værktøjet biopsi sværere at samle, der kræver passende uddannelse før brug.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af National Animal Nutrition Program og Virginia Tech. Den tekniske bistand fra Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage og Dr. Izabelle Teixeira anerkendes taknemmeligt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khatun, M., Sorensen, P., Ingvartsen, K. L., Bjerring, M., Rontved, C. M. Effects of combined liver and udder biopsying on the acute phase response of dairy cows with experimentally induced E. coli mastitis. Animal. 7, (10), 1721-1730 (2013).
  2. Buitenhuis, B., Rontved, C. M., Edwards, S. M., Ingvartsen, K. L., Sorensen, P. In depth analysis of genes and pathways of the mammary gland involved in the pathogenesis of bovine Escherichia coli-mastitis. BMC Genomics. 12, 130 (2011).
  3. Nickerson, S. C., Akers, R. M. Mammary Gland | Anatomy. Fuquay JW, Fox PF and McSweeney PLH (eds.), Encyclopedia of Dairy Sciences, Second Edition. 3, Academic Press. San Diego. 328-337 (2011).
  4. Akers, R. M. A 100-Year Review: Mammary development and lactation. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10332-10352 (2017).
  5. Ruegg, P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention1. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10381-10397 (2017).
  6. Zhao, X., Lacasse, P. Mammary tissue damage during bovine mastitis: Causes and control. Journal of Animal Science. 86, (13), 57-65 (2008).
  7. Knight, C. H., Hillerton, J. E., Teverson, R. M., Winter, A. Biopsy of the bovine mammary gland. British Veterinary Journal. 148, (2), 129-132 (1992).
  8. Lima, J. A., et al. Effects of bovine mammary gland biopsy and increased milking frequency on post-procedure udder health, histology, and milk yield. Animal. 10, (5), 838-846 (2016).
  9. Farr, V. C., et al. An improved method for the routine biopsy of bovine mammary tissue. Journal of Dairy Science. 79, (4), 543-549 (1996).
  10. Weng, X., et al. Short communication: Repeated mammary tissue collections during lactation do not alter subsequent milk yield or composition. Journal of Dairy Science. 100, (10), 8422-8425 (2017).
  11. Peterson, D. G., Matitashvili, E. A., Bauman, D. E. Diet-induced milk fat depression in dairy cows results in increased trans-10, cis-12 CLA in milk fat and coordinate suppression of mRNA abundance for mammary enzymes involved in milk fat synthesis. Journal of Nutrition. 133, (10), 3098-3102 (2003).
  12. Baumgard, L. H., Matitashvili, E., Corl, B. A., Dwyer, D. A., Bauman, D. E. trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid decreases lipogenic rates and expression of genes involved in milk lipid synthesis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 85, (9), 2155-2163 (2002).
  13. Kasraeian, S., Allison, D. C., Ahlmann, E. R., Fedenko, A. N., Menendez, L. R. A comparison of fine-needle aspiration, core biopsy, and surgical biopsy in the diagnosis of extremity soft tissue masses. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468, (11), 2992-3002 (2010).
  14. de Lima, L. S., et al. A new technique for repeated biopsies of the mammary gland in dairy cows allotted to Latin-square design studies. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne De Recherche Veterinaire. 80, (3), 225-229 (2016).
  15. Ollier, S., et al. Whole intact rapeseeds or sunflower oil in high-forage or high-concentrate diets affects milk yield, milk composition, and mammary gene expression profile in goats. Journal of Dairy Science. 92, (11), 5544-5560 (2009).
  16. Soberon, F., et al. Effects of increased milking frequency on metabolism and mammary cell proliferation in Holstein dairy cows. Journal of Dairy Science. 93, (2), 565-573 (2010).
Kvæg mælkekirtlen biopsi teknikker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter