Denne artikel præsenterer en kvæg mælkekirtlen biopsi ved hjælp af kerne og nål biopsi værktøjer. Høstede væv kan bruges til cellekultur eller at vurdere brystkirtler fysiologi og metabolisme, herunder Gen-ekspression, protein udtryk, protein ændringer, immunhistokemi og metabolitten koncentrationer.
Kvæg mælkekirtlen biopsier giver forskere til at indsamle vævsprøver for at studere cellebiologi herunder genekspression, histologiske analyse, signalering veje og protein oversættelse. Denne artikel beskriver to teknikker til biopsi fra kvæg mælkekirtler (MG). Tre sunde Holsten malkekøer var emnerne. Før biopsier, blev køerne malket og efterfølgende tilbageholdende i en kvæg sliske. En smertestillende (flunixin meglumine, 1.1 til 2,2 mg/kg legemsvægt) blev administreret via jugularis intravenøs [IV] injektion 15-20 min før til biopsi. For stående sedation, xylazinhydrochlorid (0,01-0,05 mg/kg kropsvægt) blev sprøjtet via de halebenshvirvel fartøjer 5-10 min før proceduren. Når tilstrækkeligt bedøvet, biopsi webstedet var aseptisk forberedt og lokalt bedøvet med 6 mL 2% lidocain hydrochlorid via subkutan injektion. Ved hjælp af aseptisk teknik, foregik en 2 til 3 cm lodret snit ved hjælp af en række 10 skalpel. Kerne og nål biopsi værktøjer blev brugt. Core biopsi værktøj var knyttet til en Akku boremaskine og indsat i MG væv gennem incisionen ved hjælp af handlingen clock-wise boremaskine. Værktøjet nål biopsi blev manuelt indsættes i indsnit site. Umiddelbart efter proceduren anvendes en assistent pres på indsnit stedet for 20-25 min. ved hjælp af en steril håndklæde for at opnå hæmostase. Rustfrit stål kirurgisk hæfteklammer blev brugt til at modsætte sig hud indsnittet. Hæfteklammer blev fjernet 10 dage efter indgrebet. De vigtigste fordele ved kerne og nål biopsier er, at begge tilgange er minimalt invasive procedurer, der kan udføres sikkert i sunde køer. Mælkeydelse efter biopsi var upåvirket. Disse procedurer kræver en kort restitutionstid og resultere i færre risici for komplikationer. Specifikke begrænsninger kan omfatte blødning efter biopsi og infektion på webstedet biopsi. Anvendelser af disse teknikker omfatter væv samling for klinisk diagnose og forskningsmæssige formål, såsom primær cellekultur.
En biopsi er en procedure til at høste en core afsnit af væv fra fag til medicinske eller forskningsmæssige formål. Det er en minimalt invasiv og udbredt teknik til at indsamle væv som et alternativ til dødshjælp1 for at tillade analyse af væv svar til behandling eller andre faktorer af interesse. Prøver af kvæg mælkekirtlen (MG) væv er afgørende for mejeri forskning til at studere gen- og protein udtryk, histologi, organisation af cellulære organeller, signaling veje og metaboliske processer som svar på ændringer i ledelse eller den miljø. Derudover MG væv er nødvendig for at diagnosticere og forskning visse smitsomme sygdomme, såsom kvæg mastitis forårsaget af bakterielle infektioner2.
Yveret af kvæg indeholder fire separate kirtler og hver kirtel indeholder en uafhængig mælk sekretoriske system kollektivt kaldet parenkym. Alveolerne, kanalerne og bindevæv er til stede i den mammary parenkym. Alveolerne er mikroskopiske sfæriske hule strukturer, der er sammensat af epitelceller i den indre overflade (luminale) og specialiserede myoepithelial celler på den ydre overflade (basal). Alveolerne er ansvarlig for syntese og sekretion af mælk. Fibrøst bindevæv væv til stede i parenkym kan adskille en gruppe af alveolerne fra andre grupper af alveolerne, og hver gruppe kaldes en lobule3. Flere faktorer kan påvirke udvikling og funktion af en MG, herunder animalske fysiologi, ernæring, management, genetik og miljø4. Mastitis er også en kritisk faktor, der negativt påvirker MG funktion og mælk kvalitet5. De giftstoffer, der frigives ved mastitic patogener kan beskadige alveolerne og fremkalde nekrose resulterer i biokemiske og histologiske forandringer i MG væv6. Således, histologi og metaboliske processer i hver alveolerne eller lobule i en MG kan være betydeligt forskellige fra andre. Som sådan, er biopsier, der er repræsentative prøver af hele mælkekirtlen ønskeligt. Små biopsier kan kun fange en enkelt lobule eller individuelle alveolus, begrænse den resulterende videnskabelige eller diagnostiske oplysninger. Til forskningsformål, er det nødvendigt at være opmærksom på, at en brystkirtler biopsi giver en ‘snapshot’ af væv egenskaber men en biopsi ikke tilstrækkeligt karakterisere samlede brystkirtler funktion i mangel af skøn over samlede mælkekirtlen masse.
Flere biopsi værktøjer er blevet udviklet over de sidste 30 år til human brug. I øjeblikket, er tilpasninger af disse instrumenter tilgængelige til brug med dyr. For malkekvæg, er prøver af MG væv opnået ved hjælp af forskellige teknikker herunder kirurgisk excision (stumpe dissektion)7og biopsi nåle1,8core biopsi instrumenter9,10. Således har MG biopsi teknikker i ammende malkekøer skiftet fra procedurer ved hjælp af liggende sedation med kirurgisk dissektion bruger Elektrokauterisation hæmostase i 19927 til samling af core biopsier under stående sedation9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi er en invasiv metode, som kan være dyrt og har en højere forekomst af komplikationer f.eks hæmatom, sår problemer, og tumor sprede13. I øjeblikket, er core biopsi og nål biopsi (også kendt som en tru-cut biopsi) blevet bredt vedtaget som alternativer til kirurgisk biopsi. Fordelene ved core og nål biopsier i forhold til kirurgisk biopsi omfatter: proceduren er minimalt invasiv; større komplikationer er sjældne. generel anæstesi er ikke påkrævet; proceduren er relativley hurtig; restitutionstid er kort; der er minimal negative virkninger på yveret sundhed og kun kortsigtede effekter på mælk udbytte og sammensætning8,9,10; og prisen er mindre end kirurgisk biopsi13.
Én kerne biopsi procedure beskrevet i 1996 bruges en steril, rustfrit stål kanyle med en aftagelig løftbare blade til at fjerne en repræsentativ mængde væv fra kvæg MG uden generel anæstesi9,10,11 ,12. Under proceduren, var instrumentet knyttet til en Akku boremaskine til at skabe en lav hastighed, roterende bevægelse, som rent skåret en væv kerne, mens værktøjet var rykkede ind i vævet. Fordelen var en større væv prøve (70 mm x 4 mm i diameter, omkring 0,75 til 1 g) 9. En nylig undersøgelse10 viste, at den biopsi procedure beskrevet af V. C. Farret al. 9 kan bruges til at udføre gentagne MG væv samlinger uden negativ indvirkning på performance og yveret sundhed af ammende malkekøer. Senest har blev en undersøgelse14 udført i malkekøer at evaluere gentagne biopsier for MG ved hjælp af en større trokar (31 cm lang, ydre diameter på 9,5 mm, indvendig diameter 8 mm) med vakuum påføres en indre rustfrit stål kanyle til at indsamle biopsi . Denne metode anvendes sedation (xylazin) og lokal bedøvelse (2% lidocain hydrochlorid).
Nål biopsi er en anden teknik til at indsamle brystkirtler væv. Flere undersøgelser har vedtaget denne teknik. Én undersøgelse1 brugt sedation (detomidin) og lokalbedøvelse (1% lidocain) i proceduren. Efter biopsi modtaget køerne en profylaktisk antibiotisk behandling. Mælkekirtlen var manuelt masseres, før og efter malkning. Blod i mælken blev observeret for op til 84 h efter biopsi. Mængden og sammensætningen af mælken blev berørt i en kort periode. For nylig bruges en undersøgelse en biopsi nål til at udføre gentagne MG biopsier i malkekøer8. Sedation (1% Acepromazin, intramuskulært) og lokal bedøvelse (2% lidocain hydrochlorid, subkutan) blev administreret til dyrene. Dyrene fik ikke Intramammare narkotika eller antibiotika, før eller efter proceduren, og der var ingen tegn på infektion på webstedet biopsi i den postoperative periode. I denne undersøgelse havde gentagne bovin MG biopsier ved hjælp af en nål en mindre negativ indvirkning på mælk produktion og yveret sundhed af malkekøer. Generelt, synes nål biopsi at være en mindre invasiv metode end core biopsi instrument. Som nævnt tidligere, er det imidlertid afgørende for biopsi teknik til at høste et repræsentativt udsnit af MG væv. Begrænsning af en nål biopsi er at en lille mængde af kvæg MG væv er opnået (ca. 20 til 25 mg)8,15.
Næsten alle undersøgelser anvendes en kombination af α-2 agonist sedation og lokalbedøvelse8,9,10, hvorvidt biopsi var via en nål eller en større kerne. I den bovin MG er de fleste nerveender forbundet med huden. Innervation til parenkymalt væv er i vid udstrækning via stræk receptorer med sparsom Type en nerve fibre at opdage skarp kirurgisk smerte. Som et resultat, fysiologiske mekanismer af smerter på grund af kirurgisk manipulation af en MG er via hud og subkutane væv3 og ikke dyb væv såsom parenkymalt væv. Derfor, til biopsi procedurer, det er kun nødvendigt at lokalt bedøver huden og det subkutane væv, som infiltration af lokalbedøvelse ind i dybere væv, ikke reducere kirurgiske smerte. Efter en passende forberedelse af området biopsi, ønsker animalske ubehag er primært tilknyttet tilbageholdenhed.
Samling af større kerne prøver kan øge hæmatom dannelse og øge risikoen for infektion i MG parenkym. Derfor, peri-operative protokoller ofte omfatte administration af parenteral antibiotika7, selv om der ikke er universals8. At opnå hæmostase er også en vigtig faktor for at mindske ko sygelighed. I den førnævnte undersøgelse ved hjælp af en stor kerne biopsi instrument14, manuel pres blev anvendt til webstedet biopsi og en ko BH blev brugt til at anvende is til sår i mindst 2 timer efter proceduren. Trods den store mængde af væv høstet, kun lille reduktion af feed indtag og mælk udbytte blev observeret, og proceduren blev gentaget hver tre uger uden negative virkninger på ko sundhed.
Forskere udfører MG biopsi i malkekøer skal overveje den resulterende biopsi diagnostiske eller analytiske kvalitet, nem teknik, og ko sygelighed. Nøjagtige og forudplanlagte kirurgiske teknikker er bydende nødvendigt at nå disse mål. Til dato, MG biopsi undersøgelser har fokuseret på at beskrive biopsi resultater, i modsætning til beskriver biopsi teknikken, sig selv, og beskrivelser for ammende malkekøer mangler tilstrækkelig detaljerede til at muliggøre replikering. Således er var formålet med dette arbejde at beskrive både nål biopsi og større core biopsi teknikker i tilstrækkelig detaljerede til at muliggøre sikker og human replikering af MG biopsi af kvæg.
Kerne og nål biopsi metoder blev beskrevet i denne protokol9,16. En detaljeret evaluering af dyrs sundhed og forekomsten af mastitis14 før biopsi er nødvendig for begge procedurer. Til forskningsformål, bør udfører teknikken i dyr med tydelige tegn på betændelse eller smitsomme sygdomme undgås. Dette vil reducere risikoen for komplikationer under og efter en biopsi. Alle biopsi instrumenter og anordninger skal være ren, desinficeret og steriliseret at undgå kontaminering af biopsi webstedet. Før proceduren er det nødvendigt at minimere operationssår (SSI). I almindelighed, er SSI forbundet med animalsk sygelighed, tabt ydeevne og højere produktionsomkostninger i malkekøer. Undersøgelser rapporteret tidligere metoder til at forhindre, at SSI på grund af biopsi herunder klipning af hår omkring den indsnit site, vaske området biopsi for at fjerne forurening9,14, og ved hjælp af antiseptiske agenter (70% alkohol, jod kirurgisk krat9, 2% klorhexidin acetat løsning14, 10% povidon-jod8) til klargøring af huden. I nogle undersøgelser, blev administration af antibiotika vedtaget under7 eller umiddelbart efter biopsi9; dog, antibiotika profylakse blev ikke brugt i det nuværende arbejde, og ingen infektioner af biopsi webstedet blev observeret. For at forhindre forurening af biopsi sår, skal halen beskyttes for at forhindre kontakt med webstedet biopsi indtil aerosol forbinding er blevet anvendt. I denne protokol fjernet hæfteklammer omkring 10 til 14 d efter biopsi.
Før en core biopsi er det vigtigt at ordentligt konfigurere værktøjet og tillægger drill; Vælg en langsom rotationshastighed, Vælg fremadrettet rotation, og brug ikke den omvendte tilstand af boret. Under proceduren er det vigtigt at bruge digital pres på begge sider af indsnittet at holde huden kanter fra hinanden og har en lang nok snit til at tillade værktøj post uden at kontakte hud eller bindevæv. Hvis denne procedure ikke gør det, kan et træk på indsnit kanter under rotation af core biopsi instrument opstå og forårsage yderligere hud væv traumer, som vil øge risikoen for infektion og kan forsinke sårheling. De nuværende biopsi procedurer, der beskrives i denne protokol blev udført af en Board-certificeret store dyr kirurg. Procedurerne, der blev udført med succes (figur 5). Begge teknikker er relativt nemt og hurtigt at udføre i forhold til kirurgisk excision procedure.
Blødning fra webstedet biopsi er fælles efter MG biopsi i malkekøer8,9,10,14. I denne protokol, blødning observeret var minimal (figur 4), hvilket kan skyldes anvendelsen af passende (stærk) pres på såret umiddelbart efter indgrebet. Stærkt pres i mindst 20 min. er påkrævet, og det kan være påkrævet i mere end 30 min i nogle tilfælde. Hvis moderat til svær blødning er observeret efter anvendelse af pres på webstedet biopsi, anbefales det at fortsætte pres, og straks kontakte en dyrlæge.
Som hæmostase er en vigtig faktor for at mindske ko sygelighed, pakket en undersøgelse hæmostatisk puder til biopsi webstedet for at kontrollere blødning9. Brug af hæmostatisk puder på en sådan måde har dog en høj potentiel risiko for mikrobiologisk kontamination i malkekvægsbedrift miljø. En anden undersøgelse14 anvendes manuel pres på biopsi webstedet mellem gentagne biopsier og efter biopsi og hud lukning og anvendes is til webstedet i mindst 2 timer efter biopsi. I denne protokol var stærk pression til biopsi webstedet for 20 til 25 min tilstrækkelig til at kontrollere blødning.
En vellykket biopsi teknik bør resultere i minimum blod i mælken, som fortsætter i en kort periode efter proceduren. For at undgå en afbrydelse af mælk sekretion under mælk skuffelse og mastitis infektioner, bør Intramammare blodpropper fjernes ved håndkraft stripning fra den biopsi kvarter10,14. I denne protokol, blev blod observeret i mælken op til 48 timer efter biopsi. Men i en undersøgelse, som benyttede et større antal dyr, blod i mælken blev observeret i størstedelen af køer til mindre end 6 dage. Få dyr viste blod i mælken efter 6 dage8. Af denne grund er daglig observation af mælk udseende nødvendige for 6 d efter proceduren. Dyr ikke udviser nogen tegn på mastitis infektion, når en stor vævsprøve blev opnået14. Tidligere forskning, som udføres gentagne biopsier på de samme dyr ved hjælp af en nål fandt imidlertid, at mastitis infektion forekomsten var ca. 12% efter procedure8. I denne protokol havde hverken dyret visuelle tegn på klinisk mastitis infektion efter indgrebet. Der er også en lille chance for, at webstedet snit kan blive smittet efter biopsi.
Tolazoline hydrochlorid, et stof, der tilbagefører virkningerne af sedation, bør være til rådighed i tilfælde af en overdosis fra xylazin. En overdreven dosis af xylazin kan forårsage lungeødem. Kliniske tegn på lungeødem omfatter respirationsbesvær, svær dyspnø, åndedrætsbesvær, hoste og skummende spyt. Hvis tegn på lungeødem er observeret, anbefales det at bruge tolazine (2-4 mg/kg legemsvægt) til at tilbageføre xylazin effekter.
Denne protokol beskriver teknik til at udføre både en nål biopsi og core biopsi. I almindelighed, er fordelen ved en core biopsi i forhold til nål biopsi større væv prøve (0,75 til 1 g)9 med minimum negative virkning på yveret sundhed. Nål biopsi er en mindre invasiv metode end core biopsi instrument. Men flere biopsi forsøg at opnå en større mængde væv ved hjælp af en nål biopsi procedure kan øge risikoen for store blødninger efter proceduren, samt blodpropper i mælken. Begge teknikker forårsaget minimal ko sygelighed og var nemt at opnå med minimal træning af kirurgiske personale. En kortsigtet ændring i daglige mælkeydelse (8-10% fald) og dens sammensætning9 og foderoptagelse reduktion14 forventes efter de kerne og nål biopsier, henholdsvis. Begrænsninger af nål biopsi procedure er den lille mængde af væv fjernes med nålen. Instrumentet skal aktiveres kun når nålen er inden for det væv at være biopsi og flere forsøg ofte er nødvendige for at opnå tilstrækkelige mængder af væv, hvilket øger risikoen for blod i mælk og mastitis efter indgrebet. Begrænsninger af core biopsi omfatter en højere risiko for blødning efter indgrebet, hvis en stor mængde af væv (> 200 mg) er opnået. Derudover er værktøjet biopsi sværere at samle, der kræver passende uddannelse før brug.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af National Animal Nutrition Program og Virginia Tech. Den tekniske bistand fra Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage og Dr. Izabelle Teixeira anerkendes taknemmeligt.
70% Isopropyl alcohol | Walmart | 565106257 | 1 L |
Aerosol spray to kill and repel flies | MWI | 14339 | 1 bottle (if necessary) |
Biopsy needles, 12 G × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
Butterfly infusion set (18 G needle) | Fisher | 22-258087 | 1 |
Cell culture dishes | Fisher | 08-772E | 4 |
Cordless drill (low speed) | Hitachi | DS10DFL | 1 |
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) | 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors. | ||
Cows | cattle healthy | ||
Flunixin meglumine | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight |
Folding table | Amazon | 1 | |
Forceps | Fisher | 09-753-50 | 1 |
Gloves non-sterile | Fisher | 17-200-845 | 9, size dependent |
Hard brush | Sullivan Supply | 18270 | 1, to wash the cows |
Head gate | 1, customized for dairy cows | ||
Lidocaine hydrochloride 2% injectable | MWI/VetOne | 510212 | 6 mL was used, from 3 to 8 mL |
Livestock body wash | eZall Technologies | 39384 | 1, to wash the cows |
Needle 18 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
Needle 20 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
Phosphate buffered saline (0.9%) | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
Povidone Iodine ointment | Jeffers | #VED1A | 500 g (if necessary) |
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
Reusable biopsy instrument | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
Rope halter | Nasco farm and ranch | C10852 | 2, cow size |
Scalpel blades (#10) | MWI | 033870 | 2 |
Scalpel holders (#3) | MWI | 602008 | 1 |
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. | Fisher | 19-130-0038 | 1 case of 800 |
Sterile cotton gauze sponges | Fisher | 22-037-986 | 4 |
Sterile gauze pads | Fisher | 19-090-735 | 4 |
Sterile surgical gloves | Surgical gloves | 19-166-679 | 3, size dependent |
Sterile surgical towels | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
Stethoscope | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
Surgical clipper | Oster A5 | 078005-010-003 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical clipper blades (#40 ) | Oster | 78919-016 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical staple remover | MWI | 541 | 1 |
Surgical stapler pre-loaded | MWI | 17713 | 5 |
Syringes of 10 mL | Fisher | 14-823-224 | 3 |
Syringes of 2 mL | Fisher | 22-028854 | 3 |
Syringes of 20 mL | Fisher | 22-034507 | 3 |
Syringes of 5 mL | Fisher | 22-028855 | 3 |
Thermometer | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
Tolazine hydrochloride | Akorn Animal Health | 61311-486-10 | 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary) |
Tweezer | Fisher | 14-955-025 | 1, for handle the tissue sample |
Water hose | Miracle-Gro, Walmart | 554990501 | 1, to wash the cows |
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) | MWI | 010728 | 1 bottle |
Xylazine hydrochloride | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight |