Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Boviene melkklier biopsie technieken

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

Dit artikel presenteert een biopsie van de boviene melkklier hulpprogramma's core en naald biopsie. Geoogste weefsel kan worden gebruikt voor celkweek of borstklier fysiologie en metabolisme met inbegrip van genexpressie, eiwit expressie, eiwit wijzigingen, immunohistochemistry en metaboliet concentraties te beoordelen.

Abstract

Boviene melkklier biopten kunnen onderzoekers weefselmonsters om te bestuderen van de celbiologie met inbegrip van genexpressie, histologisch analyse, signalering trajecten en eiwit vertaling te verzamelen. Dit artikel beschrijft twee technieken voor biopsie van de boviene melkklier (MG). Drie gezonde Holstein melkkoeien waren de onderwerpen. Voordat biopsieën, waren de koeien gemolken en vervolgens op een vee-parachute gefixeerd. Pijnstiller (flunixin meglumine, 1.1 tot 2,2 mg/kg lichaamsgewicht) werd toegediend via jugular intraveneuze [IV] injectie 15-20 min voorafgaande aan biopsie. Voor staande sedatie, xylazine hydrochloride (0.01-0,05 mg/kg lichaamsgewicht) werd geïnjecteerd via de coccygeal schepen 5-10 min voordat de procedure. Zodra voldoende verdoofd, was de biopsie site aseptisch bereid en lokaal verdoofd met 6 mL 2% lidocaïne hydrochloride via subcutane injectie. Met behulp van aseptische techniek, werd een verticale incisie van 2 tot 3 cm gemaakt met behulp van een scalpel nummer 10. Kern en naald biopsie hulpmiddelen werden gebruikt. Het basisprogramma voor biopsie was gekoppeld aan een cordless drill en ingevoegd in het weefsel van de MG via de incisie met een Clockwise boor-actie. De naald biopsie tool is handmatig ingevoegd in de plaats van de incisie. Onmiddellijk na de ingreep, een assistent toegepast druk op de site van de incisie voor 20 tot 25 min met behulp van een steriele handdoek om hemostase. RVS chirurgische nietjes dienden zich te verzetten tegen de huid incisie. De nietjes waren verwijderd 10 dagen na procedure. De belangrijkste voordelen van core en naald biopsieën is dat beide benaderingen zijn minimaal invasieve procedures die veilig kunnen worden uitgevoerd bij gezonde koeien. Melkopbrengst na de biopsie was onaangetast. Deze procedures vereisen een korte hersteltijd en leiden tot minder risico van complicaties. Specifieke beperkingen kunnen waaronder: bloeden na de biopsie en van besmetting op de site van de biopsie. Toepassingen van deze technieken omvatten weefsel-collectie voor de klinische diagnose en onderzoeksdoeleinden, zoals primaire celculturen.

Introduction

Een biopsie is een procedure om de oogst een deel van de kern van weefsel van de onderwerpen voor medische of onderzoeksdoeleinden. Het is een minimaal invasieve en meest gebruikte techniek om het verzamelen van weefsel als alternatief voor euthanasie1 zodat de analyse van weefsel reacties op behandeling of andere factoren van belang. Monsters van weefsels van runderen melkklier (MG) zijn essentieel voor zuivel onderzoek te bestuderen van de gen- en eiwit expressie, histologie, de organisatie van cellulaire organellen, signaalroutes en metabole processen in reactie op veranderingen in het beheer of de milieu. Bovendien is MG weefsel nodig voor het opsporen en onderzoeken van bepaalde besmettelijke ziekten, zoals boviene mastitis veroorzaakt door bacteriële infecties2.

De uier van vee bevat vier afzonderlijke klieren en elke klier bevat een onafhankelijke melk secretoire systeem collectief genaamd parenchym. De longblaasjes, buizen en bindweefsel zijn aanwezig in de borstklier parenchym. De longblaasjes zijn microscopische sferische holle structuren die zijn samengesteld uit epitheliale cellen in de binnenkant (luminal) en gespecialiseerde myoepithelial cellen op het buitenoppervlak (basale). De longblaasjes zijn verantwoordelijk voor de synthese en secretie van melk. De vezelig verbindende weefsel aanwezig in de parenchym kan een groep van longblaasjes scheiden van andere groepen van de longblaasjes en elke groep heet een lobule3. Verschillende factoren kunnen invloed op de ontwikkeling en de functie van de met inbegrip van dierlijke fysiologie, voeding, beheer, genetica en de milieu-4MG. Mastitis is ook een kritieke factor die negatief MG functie en melk kwaliteit5 beïnvloedt. De toxinen die zijn vrijgegeven door mastitic pathogenen kunnen leiden tot schade aan de longblaasjes en necrose resulterend in biochemische en histologische veranderingen in het weefsel MG6veroorzaken. Dus, de histologie en metabole processen van elke longblaasjes of lobule in de MG mogelijk beduidend verschillend van anderen. Als zodanig, zijn biopten dat representatieve monsters van de gehele melkklier wenselijk. Kleine biopten kunnen alleen een enkele lobule of individuele alveolus, beperking van de resulterende wetenschappelijke of diagnostische gegevens vastleggen. Voor onderzoeksdoeleinden, is het noodzakelijk zich bewust zijn dat een borstklier biopsie beschikt over een 'momentopname' van weefsel kenmerken maar een biopsie kan niet adequaat borstklier functie bij gebrek aan schattingen van de totale melkklier totaal karakteriseren massa.

Verschillende biopsie gereedschappen zijn ontwikkeld in de afgelopen 30 jaar voor menselijk gebruik. Aanpassingen van deze instrumenten zijn momenteel beschikbaar voor gebruik met dieren. Voor melkvee, zijn monsters van MG weefsel verkregen met behulp van verschillende technieken en chirurgische excisie (botte dissectie)7, biopsie naalden1,8, core biopsie instrumenten9,10. Dus, MG biopsie technieken in zogende melkkoeien zijn overgestapt van procedures ligfiets sedatie met chirurgische dissectie gebruiken elektrocauterisatie hemostase in 1992,7 aan collectie van core biopsieën onder staande sedatie9, 10,11,12. Chirurgische biopsie is een invasieve methode, die kan worden duur en hebben een hogere incidentie van complicaties zoals hematoom, wond problemen en tumor verspreid13. Op dit moment zijn kern biopsie en naald biopsie (ook bekend als een tru-cut biopsie) wijd goedgekeurd als alternatieven voor chirurgische biopsie. De voordelen van core en naald biopsieën vergeleken met chirurgische biopsie omvatten: de procedure is minimaal invasieve; grote complicaties zijn zeldzaam; narcose is niet vereist; de procedure is verwant snelle; de hersteltijd is kort; Er is minimale negatieve effecten op de gezondheid van de uier en alleen op korte termijn gevolgen voor melk opbrengst en samenstelling8,9,10; en de kosten is minder dan chirurgische biopsie13.

Een core biopsie beschreven procedure in 1996 gebruikt een steriele, RVS canule met een verwisselbare intrekbaar mes om een representatieve hoeveelheid weefsel van de boviene MG zonder narcose9,10,11 ,12. Tijdens de procedure, werd het instrument vastgemaakt aan een cordless drill maken een lage snelheid, de roterende beweging die netjes een kern van weefsel, gesneden zoals het hulpprogramma was gevorderd in het weefsel. Het voordeel was een grotere weefsel proeven (70 mm x 4 mm diameter, ongeveer 0,75 tot 1 g) 9. Een recente studie10 toonde aan dat de procedure van de biopsie beschreven door V. C. Farret al. 9 kan worden gebruikt voor het uitvoeren van herhaalde MG weefsel collecties zonder negatieve impact op de gezondheid van de prestaties en uier van zogende melkkoeien. Onlangs werd een studie14 uitgevoerd in melkkoeien te beoordelen van herhaalde Biopten van de MG gebruiken een grotere trocar (31 cm lange, buitenste diameter van 9.5 mm, binnendiameter van 8 mm) met vacuüm toegepast op een canule interne roestvrij staal voor het verzamelen van de biopsie . Deze methode gebruikt sedatie (xylazine) en plaatselijke verdoving (2% lidocaïne hydrochloride).

De naald biopsie is een andere techniek voor het verzamelen van de borstklier weefsel. Verschillende studies hebben deze techniek aangenomen. Één studie1 sedatie (detomidine) en plaatselijke verdoving (lidocaïne 1%) in de procedure worden gebruikt. Na de biopsie ontving de koeien een profylactische behandeling met antibiotica. De melkklier was handmatig gemasseerd vóór en na het melken. Bloed in de melk werd waargenomen voor maximaal 84 h na de biopsie. De hoeveelheid en de samenstelling van de melk werden getroffen voor een korte periode van tijd. Onlangs, een studie gebruikt een naald biopsie uit te voeren van herhaalde MG biopsieën in melkkoeien8. Sedatie (1% acepromazine, intramusculaire) en plaatselijke verdoving (2% lidocaïne hydrochloride, subcutaan) werden toegediend aan de dieren. De dieren niet ontving intramammaire drugs of antibiotica vóór of na de ingreep, en er waren geen tekenen van infectie op de site van de biopsie na chirurgische deperiode. In deze studie had herhaalde boviene MG biopsieën met behulp van een naald een klein negatief effect op melk productie en uier gezondheid van melkkoeien. In het algemeen, lijkt de naald biopsie een minder invasieve methode dan de belangrijkste biopsie instrument. Zoals eerder opgemerkt, is het echter essentieel voor de biopsie techniek om te oogsten van een representatieve steekproef van de MG-weefsel. De beperking van een naald biopsie is dat een kleine hoeveelheid boviene MG weefsel wordt verkregen (ongeveer 20 tot 25 mg)8,15.

Bijna alle studies gebruikt een combinatie van α-2 agonist sedatie en plaatselijke verdoving8,9,10, of de biopsie via een naald of een grotere kern was. In de boviene MG worden de meeste zenuwuiteinden geassocieerd met de huid. Innervatie van de arm aan het parenchymal weefsel is grotendeels via stretch receptoren met sparse Type een zenuwvezels te detecteren scherpe chirurgische pijn. Dientengevolge is de fysiologische mechanismen van pijn als gevolg van chirurgische manipulatie van de MG via huid en subcutane weefsels3 en niet diepe weefsels zoals parenchymal weefsel. Daarom voor biopsie procedures is het alleen nodig om lokaal anesthetize van de huid en de subcutane weefsels, zoals infiltratie van lokale verdoving in de diepere weefsels chirurgische pijn niet aanzienlijk vermindert. Na een passende voorbereiding van de biopsie gebied, dierlijke ongemak is, voornamelijk, terughoudendheid is gekoppeld.

Grotere kern monsters kan verhogen hematoom vorming en verhogen het risico van besmetting binnen het parenchym MG. Peri-operatieve protocollen bevatten daarom vaak toediening van parenterale antibiotica7, hoewel dat niet Universalia8. Het bereiken van hemostase is ook een belangrijke factor voor de vermindering van de morbiditeit van de koe. In de bovengenoemde studie met behulp van een grote kern biopsie instrument14, manuele druk werd toegepast op de site van de biopsie en een koe beha werd gebruikt om het ijs op de wonden voor ten minste 2 uur volgens de procedure van toepassing. Ondanks de grote hoeveelheid weefsel geoogst, slechts in geringe mate reducties in diervoeders inname en melk opbrengst werden waargenomen, en de procedure elke drie weken zonder negatieve effecten op de gezondheid van de koeien werd herhaald.

Onderzoekers MG biopsie uitvoeren in melkkoeien moeten nadenken over de diagnostische of analytische kwaliteit van de resulterende biopsie, gemak van techniek en koe morbiditeit. Nauwkeurige en vooraf geplande chirurgische technieken zijn noodzakelijk om deze doelen te bereiken. Tot op heden MG biopsie studies hebben gericht op het beschrijven van de resultaten van de biopsie, in tegenstelling tot het beschrijven van de techniek van de biopsie zelf, en beschrijvingen voor zogende melkkoeien gebrek aan voldoende gedetailleerd zijn om replicatie mogelijk te. Dus, het doel van dit werk was zowel naald biopsie en grotere kern biopsie technieken voldoende gedetailleerd zijn om veilige en humane replicatie van MG biopsie van vee mogelijk te beschrijven.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven zijn door de Virginia Tech institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) goedgekeurd.

1. personeel

  1. Ten minste twee assistenten met chirurgische en koe aangestuurde ervaring heb.
  2. Train alle assistenten ten minste driemaal, indien mogelijk met behulp van dode foetussen materiaal, vóór het uitvoeren van de procedures die verband houden met dit protocol op levende dieren.
    Opmerking: Opleiding moet plaatsvinden door een instructeur die al eerder getraind en uitgevoerd van de techniek.
  3. Hebben een grote dierlijke dierenarts voor u klaar voor de FDA en in het geval dat dringende medische verzorging tijdens de procedure noodzakelijk wordt. Noodsituaties die zich tijdens deze procedure voordoen kunnen omvatten maar zijn niet beperkt tot: bloeding, α-2 agonist overdosis en longoedeem, regurgitatie en aspiratie van voedsel materiaal, pijn en patiënt verzet waarvoor verdere sedatie.

2. voorbereiding van de chirurgische instrumenten, leveringen en faciliteit

  1. Inventaris en aankoop alle materiaal en voorraden (Zie Tabel van materialen).
  2. Schoon en autoclaaf afdeklakens, biopsie instrumenten, scalpel houders, chirurgische handdoeken en pincet.
  3. Hebben een juiste afmeting squeeze parachute en hoofd gate te bedwingen van de koeien.
  4. Vast een werkplek met een tabel in de buurt van de parachute squeeze.
  5. Zorg ervoor dat het werkgebied schoon is en een koe door-verkeer beperkte heeft.
  6. Organiseren en benodigdheden in de werkruimte voor gemakkelijke toegang.
  7. Juiste verlichting binnenin het werkruimte heb.

3. voorbereiding van de dieren

  1. Één dag vóór de geplande biopsie, wassen en schrobben van het dier, met name de uier om mest en verontreinigde materialen te verwijderen.
  2. Volgt u de procedures voor veilige en humane terughoudendheid van vee.
  3. Vóór de biopsie en opnieuw ten tijde van de biopsie, beoordelen de gezondheid, de fysieke conditie en het gedrag van het dier.
    Opmerking: Een minimumeisen voor het examen bevat temperatuur, pols, en respiratoire tarieven, alsmede onderzoek naar dermatitis ten opzichte van de voorgestelde chirurgische site of andere gebieden van een bacteriële infectie. Verzamelen van melkmonsters van elk kwartaal en controleer op mastitis.
  4. Gebruik alleen gezonde koeien.
  5. Volledig melk de koe.
  6. Verplaats het dier naar de squeeze parachute, idealiter binnen 2 uur na het melken om te minimaliseren van melk aanwezig in de klieren.
  7. Beperken van het dier met een hoofd-gate.

4. analgesie en sedatie

  1. Plaats een halster touw op het hoofd van de koe te voorkomen achteruit en doorsturen beweging.
  2. Trek van het dier hoofd aan de ene kant, en bind het touw aan de parachute van de squeeze een knoop snelsluiter met het hoofd op zijn plaats houden.
  3. Reinig het gebied van injectie met een 70% isopropyl alcohol doekje en flunixin meglumine (1.1-2.2 mg/kg lichaamsgewicht) intraveneus beheren via de halsslagader 15-20 min voorafgaande aan de biopsie.
    Opmerking: In sommige protocollen, steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen worden toegediend na de biopsie als anti-inflammatoire geneesmiddelen zal niet van invloed op de resultaten van het onderzoek.
    1. Zoek de halsslagader.
    2. De halsslagader verhogen door toepassing van druk aan de voet van de jugular groef.
    3. Controleren om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit.
    4. De naald in de verhoogde halsslagader, invoegen en 0,5 mL bloed te trekken in de spuit tweemaal en meng met de inhoud. Als geen bloed in de spuit toont, verplaatsen de naald. Als de naald woonachtig in de ader is, injecteren de inhoud.
    5. Verwijder voorzichtig de naald.
    6. Gaas met zachte druk van toepassing op de injectieplaats te voorkomen bloeden.
  4. Xylazine hydrochloride intraveneus beheren (0.01 aan 0,05 mg/kg lichaamsgewicht) in het coccygeal schip ongeveer 5-10 min vóór de biopsie aan om voldoende tijd voor de oprichting van sedatie.
    Let op: Controleer het dier voor tekenen van longoedeem. Klinische symptomen van longoedeem omvatten respiratoire nood, ernstige kortademigheid, ademhalingsproblemen, hoesten, schuimend sputum en blauwe tong. Symptomen van longoedeem zijn waargenomen, wordt het aanbevolen om als tolazine (2 tot 4 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt om te keren van de effecten van de xylazine.
    1. Hef de staart en reinig het gebied van injectie met een 70% isopropyl alcohol doekje.
    2. Controleren om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit.
    3. Plaats de naald in het schip van de staart, 0.2 mL bloed te trekken in de spuit en meng met de inhoud om ervoor te zorgen dat de naald is woonachtig in het schip. Als de naald woonachtig in het schip is, injecteren de inhoud van de spuit.
    4. Verwijder voorzichtig de naald.
    5. Gaas met zachte druk van toepassing op de injectieplaats.

5. bereiding van de biopsie site

  1. Hebt een assistent vastbinden aan de staart voor de procedure.
  2. Selecteer de site van de biopsie op de uier (meestal in een bovenste gedeelte om te minimaliseren van de collectie van bindweefsel en om te voorkomen dat penetratie in de klier cisterne, Figuur 1) en bevuilde materiaal of mest uit de geselecteerde biopsie-site verwijderen.

Figure 1
Figuur 1 . Afbeelding van de boviene uier ter illustratie van de biopsie site. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

  1. Observeren en palperen van de huid met speciale aandacht voor het identificeren van een grote onderhuidse bloedvaten om te voorkomen dat deze schepen tijdens de biopsie.
  2. Knippen van het haar van een gebied van 15 x 15 cm rond de biopsie-site.
  3. Het gebied van de biopsie met Povidon-jodium (0,75% beschikbare jodium) of chloorhexidine gluconaat scrub voor te bereiden. Afgewisseld met 70% isopropyl alcohol ten minste driemaal te verwijderen van alle zichtbare en onzichtbare puin. De aseptische scrub oplossing en isopropyl alcohol in een draaiende beweging met behulp van binnenstebuiten aanpak toepassen. Ervoor zorgen dat de antiseptische scrub oplossing in contact met de huid voor minstens 5 min blijft.
  4. Gebruik een infusie van de vlinder instellen met een naald 18 G 6 mL 2% lidocaïne hydrochloride subcutaan storten op de site van de snede te maken van een lijn-blok. Niet doordringen in de diepere weefsels.
    Opmerking: Dosering van lidocaïne varieert tussen de 3 en 8 mL.
  5. De plaatselijke verdoving te verspreiden voor 3 tot 5 min. uitvoeren een andere herhaling van scrub oplossing en alcohol voorafgaand aan incisie toestaan. Terwijl we wachten, bereiden de biopsie instrumenten.

6. biopsie procedure

  1. Gebruik aseptische technieken bij het verwerken van de biopsie gereedschappen en voor de incisie.
  2. Het wassen van handen verwijderen alle zichtbare verontreiniging en steriele chirurgische handschoenen toe te passen.
  3. Schik de chirurgische instrumenten in een steriele omgeving in volgorde van gebruik. Hebben een nummer 10 scalpel, steriel gaas, een instrument van de geassembleerde biopsie en een steriele handdoek voor hemostase.
    Opmerking: Volg 1 van de Procedure voor het uitvoeren van een Core biopsie of Procedure 2 voor het uitvoeren van een naald biopsie.

Figure 2
Figuur 2 . Schematische weergave van montage en installatie van het basisprogramma van de biopsie beschreven door V. C. Farr, et al. 9 schaal bar is 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Belangrijkste biopsie Instrument (Farr et al.9)
    1. Monteren het kern biopsie instrument met behulp van steriele handschoenen (Figuur 2).
      1. Leg de 7 steriele stukjes op een steriele gordijn (figuur 2A).
      2. Het mes (1 stuk) invoegen in de dokkende systeem op stuk 2 (figuur 2B ).
        Let op: Plaats geen vingers rechtstreeks in de blade-lijn.
      3. Invoegen stuk 3 op de top van stuk 2 (figuur 2C) ervoor te zorgen dat het docking station wordt uitgelijnd.
        Opmerking: Observeren een dokkende systeem in het interieur wand van stuk 4 (figuur 2D).
      4. De definitieve rand van het blad (1 stuk) betrekken in het dokkende systeem van stuk 4 (figuur 2D).
      5. Duw voorwaarts stuk 4 en observeren als stuk 4 naast stuk 3 (figuur 2E is).
      6. Invoegen stuk 5 op het apparaat (mes + stuk 2) (figuur 2F).
      7. Zorgen dat het docking station wordt uitgelijnd (Figuur 2 g).
      8. Stuk 6 invoegen boven aan stuk 2 (tegenover kant van het blad) (Figuur 2 H)
      9. Zorgen dat het docking station wordt uitgelijnd (Figuur 2 H).
      10. Plaats de vergrendeling schroef (stuk 7) in het docking station (figuur 2I).
      11. Duw voorwaarts stuk 3 (zwart) ter dekking van de vergrendeling schroef.
        Let op: Plaats geen vingers op de afrit blade.
      12. Activeren van het gereedschap duwen voorwaarts stuk 4 en observeren van het blad buiten het gereedschap.
      13. Pull stuk 4 terug naar het intrekken van het mes in het hulpprogramma (klaar voor gebruik).
        Opmerking: Het mes moet worden alleen geactiveerd wanneer het hulpprogramma doorgedrongen de gewenste afstand in het weefsel tot is worden biopsied.
    2. Ervoor zorgen dat de koe is voldoende verdoofd en de biopsie site voldoende is verdoofd. Het knijpen van de huid om ervoor te zorgen geen reactie.
    3. Het maken van een verticale incisie van 2 tot 3 cm door de huid en de subcutane weefsels van proximaal naar DISTAAL met behulp van een scalpel nummer 10.
    4. De biopsie instrument hechten aan een draadloze boormachine met behulp van steriele techniek.
    5. Plaats de boor tegen de biopsie tool en gecontroleerd als het hulpprogramma stevig is aangesloten op de boor.
    6. Zorgen voor voldoende terughoudendheid door het hebben van een individu de staart verheffen tijdens alle procedure.
    7. Inschakelen van de boor met rechtsom draaien en een lage snelheid.
      Opmerking: De boor is niet steriel, en de exploitant blijft niet steriele bij het gebruik van de boor.
    8. Verder het hele biopsie gereedschap (ongeveer 7,5 cm) in de uier door middel van de incisie, terwijl de boor is de tol draaien.
    9. Uitschakelen van de boor en stuk 4 van het hulpprogramma handmatig uit te breiden.
    10. Inschakelen van de boor met rechtsom draaien en lage snelheid.
    11. Verwijder het instrument met de kern van het weefsel van de uier.
    12. Onmiddellijk van toepassing zijn sterke druk op de wond met een steriele handdoek voor minstens 20 min.
      Opmerking: Hebt een assistent die uitvoeren met behulp van hun vuist om ervoor te zorgen dat voldoende druk wordt toegepast.
    13. Verwijder het weefsel van biopsie tool met pincet.
    14. Houden van het monster in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing en evalueren van de hoeveelheid weefsel.
    15. Neem de koemelk vital signs elke 10 min na de biopsie voor minstens 30 min.
    16. Selectievakje voor bloeden na 20 min van druk op de site van de biopsie. Als er druppels bloed blijven toe te passen druk voor een extra 5-10 min.
    17. Sluit de insnijdingen RVS nietjes met tussenpozen van 5 mm immers bloeden is gestopt. Gebruik tussen 5 en 8 nietjes.
    18. Toepassing een aërosol pleister op het gebied van de biopsie.
    19. Observeer het dier gedurende 50 minuten na de ingreep.
  2. Naald biopsie Instrument
    1. Volg de instructies van de fabrikant voor het apparaat.
    2. Verwijder de naald biopsie uit het pakket met behulp van steriele technieken.
    3. Gooi de naald als schade wordt waargenomen.
    4. De naald wordt aan het apparaat koppelen.
    5. Sluit de klep en pik van het apparaat.
    6. Ervoor zorgen dat de koe is voldoende verdoofd en de biopsie site voldoende is verdoofd. Het knijpen van de huid om ervoor te zorgen geen reactie.
    7. Het maken van een 1 tot 2 cm verticale incisie door de huid en de subcutane weefsels van proximaal naar DISTAAL met behulp van een scalpel nummer 10.
      Opmerking: De incisie voor het instrument van de naald biopsie kunnen kleinere (1-2 cm) dan die voor het instrument van de biopsie kern.
    8. Zet de naald biopsie op de site van de incisie (ongeveer 10 tot en met 13 cm van de huid).
    9. Activeren het apparaat naald biopsie voor het verzamelen van het weefsel.
    10. Verwijder de naald uit de uier.
    11. Onmiddellijke en sterke druk uitoefenen op de wond met een steriele handdoek voor minstens 20 min.
    12. Verwijder het weefsel van de naald van de biopsie met pincet.
    13. Houden van het monster in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing en evalueren van de hoeveelheid weefsel.
    14. Neem vital signs elke 10 min na de biopsie voor minstens 30 min.
    15. Selectievakje voor bloeden na 20 min van druk op de site van de biopsie.
    16. Sluit de insnijdingen met RVS nietjes immers bloeden is gestopt.
    17. Toepassing een aërosol pleister op het gebied van de biopsie.
    18. Observeer het dier gedurende 50 minuten na de ingreep.

7. Na biopsie dierenverzorgers

  1. Documenteer alle drugs toegediend aan dieren.
    Opmerking: Melk werd verwijderd tijdens een periode van 36 uur na de ingreep; vlees terugtrekking was 4 d. wachttijden voor melk en vlees kunnen variëren afhankelijk van het land of jurisdictie en de drugs gebruikt. Controleer de lokale wet- en regelgeving.
  2. Controleren op de aanwezigheid van bloed in de melk voor 7 tot en met 10 d na de biopsie.
  3. Hand van bloedstolsels strip van de biopsied wijk in latere melkingen en ervoor te zorgen dat volledige melk verwijdering plaatsvindt.
    Opmerking: De aanwezigheid van bloedstolsels van de biopsied kwart voor 1-3 melkingen na de procedure wordt verwacht. Bloed in de melk kan worden waargenomen voor 1 tot en met 6 d na de biopsie.
  4. Observeren van melk opleveren, en indien mogelijk de individuele dagelijkse voederopname totdat chirurgische nietjes zijn verwijderd.
  5. Toezicht op het dier twee keer per dag voor lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag en houding totdat chirurgische nietjes zijn verwijderd.
  6. Controleer de biopsie site tweemaal daags voor zwelling, tederheid, en geen symptomen van drainage totdat de chirurgische nietjes zijn verwijderd. Als deze worden waargenomen, Raadpleeg een dierenarts.
    Opmerking: De biopsie site schoon te houden en opnieuw het aërosol verband elke één tot drie dagen indien nodig.
  7. Verwijder de nietjes van de incisie site 10 tot en met 14 d na de biopsie, afhankelijk van de genezing tarief.
  8. Raadpleeg een dierenarts indien symptomen van lokale of systemische infectie worden waargenomen.

Representative Results

In het huidige protocol, de kern biopsie techniek geproduceerd weefsel monster van 200 tot 600 mg, terwijl de naald biopsie geproduceerd monsters van 10 tot 30 mg per biopsie. De dieren werden twee keer per dag voor 10 d waargenomen na de ingreep. Geen complicaties heeft plaatsgevonden tijdens de procedure of in de postoperatieve periode, met vitale parameters van de koeien blijven binnen normale grenzen (respiratoire gemiddelde 31.4 ± 7.04 (SD) = ademhalingen per min, gemiddelde hartslag = 75,9 ± 8,9 slagen per min, en gemiddelde rectale temperatuur = 38.2 ± 0.68 GC, Figuur 3).

Na manuele druk op het gebied van de biopsie om hemostase (ongeveer 25 min), toonde de open wond minimale bloeden (Figuur 4). De koeien werden gevoed ad libitum hetzelfde dieet en de dieren werden gehouden in de zelfde faciliteit van de huisvesting in de postoperatieve periode. De dieren vertonen geen tekenen van infectie op de site van de biopsie; Er was geen pijn, bloeden, zwelling, drainage, of verhoogde temperatuur (Figuur 5). De wond genezen binnen 8 tot 10 d van de biopsie (figuur 5C).

Één dier ontwikkeld kleine huidirritatie verschuldigd om de wond wrijven op dag 8 na de ingreep. Die koe werd behandeld door het reinigen van de site van de biopsie met Povidon-jodium oplossing en 70% isopropylalcohol. De RVS nietjes werden verwijderd zodat drainage en Povidon jodium zalf (1%) werd tweemaal per dag toegepast op de site van de biopsie voor 2 tot 3 d. De irritatie van de huid 2 d verdwenen na het toepassen van Povidon-Jood zalf en de wond genezen met geen verdere complicaties.

Bloedstolsels zijn verwijderd met de hand strippen van melk van de biopsied kwartaal voorafgaand aan machine melken. In het huidige protocol, werd de aanwezigheid van bloedstolsels in de melk waargenomen voor maximaal drie melkingen (ongeveer 36 h) na de biopsie. Bloed verontreiniging van de melk werd waargenomen gedurende maximaal 48 uur na de biopsie. Er waren geen visuele verschillen waargenomen tussen kern en naald biopsieën ten opzichte van de hoeveelheid bloed in de melk. De dieren vertonen geen een significante afname van de melkproductie na de ingreep (Figuur 6). Gemiddelde melk compositie was 4.37% vet, 3,34% eiwit en 4,64% lactose. De gemiddelde melk celgetal (SCC) is minder dan 200.000 cellen per mL.

De MG-weefsel dat verkregen kan worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden zoals primaire celculturen (Figuur 7).

Figure 3
Figuur 3 . Evaluatie van dierlijke gezondheidsindicatoren na de biopsie boviene melkklier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 . Biopsie site uiterlijk na manuele druk werd toegepast op het gebied van de biopsie om hemostase. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Foto van de site's biopsie. (A) biopsie site 3 d na de ingreep. (B) biopsie site 6 d na de ingreep. (C) biopsie site 10 d na de ingreep illustreren dat de wond voldoende genezen was. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Dagelijkse productie van de melk vóór en na de biopsie boviene melkklier (n = 3 koeien). Een lineair model geschat dat tien dagen vóór de biopsie de dieren geproduceerd 23.35 kg melk per dag. De melkgift veranderde niet significant (P > 0,05) vanaf 10 dagen voor tot 10 dagen na de biopsie hoewel een lichte stijging melkopbrengst werd waargenomen (toename van 0.0005 kg/d van melk voor elke dag vanaf 10 dagen voor de biopsie). Drie dieren werden gebruikt in dit protocol; één dier werd tweemaal biopsied (dier 1: kern biopsie aan de linkerzijde van de uier en naald biopsie aan de rechterkant van de uier) en twee dieren vroeger biopsied (dier 2 en 3: alleen aan de rechterkant van de uier met de kern of naald). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 . Representatieve beelden van primaire boviene borstklier epitheliale cellen cultuur. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Kern en naald biopsie methoden werden beschreven in dit protocol9,16. Een gedetailleerde evaluatie van de diergezondheid en de incidentie van mastitis14 vóór de biopsie is vereist voor beide procedures. Voor onderzoeksdoeleinden, moet uitvoeren van de techniek in dieren met duidelijke tekenen van ontsteking of besmettelijke ziekten worden vermeden. Dit zal het risico van complicaties tijdens en na een biopsie. Alle biopsie instrumenten en apparaten moet schoon, ontsmet en gesteriliseerd om verontreiniging van de biopsie site te voorkomen. Voordat de procedure is het noodzakelijk om te minimaliseren van de chirurgische site infecties (SSI). In het algemeen, wordt SSI geassocieerd met dierlijke morbiditeit, verloren prestaties en hogere productiekosten in melkkoeien. Studies gerapporteerd eerder methoden ter voorkoming van SSI als gevolg van de biopsie inclusief knippen van de haren rond de site van de incisie, wassen van de biopsie gebied als u wilt verwijderen van verontreiniging9,14, en het gebruik van antiseptische agenten (70% alcohol, jodium chirurgische schrobben9, 2% chloorhexidine acetaat oplossing14, 10% Povidon-jodium8) voor de voorbereiding van de huid. In sommige studies, werd toediening van antibiotica aangenomen tijdens de7 of onmiddellijk na de biopsie9; echter antibiotica profylaxe werd niet gebruikt in het huidige werk, en geen infecties van de biopsie site werden waargenomen. Om te voorkomen dat besmetting van de biopsie wond, moet de staart worden beveiligd om te voorkomen dat contact met de biopsie site totdat de aërosol bandage is vereffend. In dit protocol worden nietjes ongeveer 10 tot en met 14 d verwijderd na de biopsie.

Voorafgaand aan een biopsie van de kern is het belangrijk om goed de tool instellen en deze koppelen aan de boor; kiezen van een langzame rotatiesnelheid, de voorwaartse rotatie en gebruik niet de omgekeerde modus van de boor. Tijdens de procedure is het belangrijk met digitale druk aan beide zijden van de snede te houden de huid randen apart en hebben een lang genoeg incisie voor het gereedschap invoeren zonder het contact met de huid of bindweefsel. Als deze procedure niet wordt gedaan, kan een belemmering voor de randen van de incisie tijdens rotatie van het instrument van de biopsie kern optreden en veroorzaken extra huid weefseltrauma die vergroot het risico van infectie en kan onmiddellijk wondgenezing. De huidige biopsie procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd door een board-gecertificeerde grote dierlijke chirurg. De procedures werden met succes uitgevoerd (Figuur 5). Beide technieken zijn relatief gemakkelijk en snel uit te voeren ten opzichte van de chirurgische excisie procedure.

Bloeden uit de biopsie site gelden na MG biopsie in melkkoeien8,9,10,14. In het huidige protocol, bloeden waargenomen was minimaal (Figuur 4), die kan worden veroorzaakt door de toepassing van adequate (sterk) druk op de wond onmiddellijk na de ingreep. Sterke druk gedurende ten minste 20 minuten is vereist, en het nodig kan zijn voor meer dan 30 min in sommige gevallen. Matige tot ernstige bloeding wordt waargenomen na toepassing van druk op de site van de biopsie, wordt het aanbevolen om als blijven druk, en onmiddellijk contact op met een dierenarts.

Zoals hemostase een belangrijke factor is voor de vermindering van de morbiditeit van de koe, verpakt een studie hemostatische pads in de site van de biopsie bepalen bloeden9. Gebruik voor hemostatische pads op zodanige wijze heeft echter een hoog potentieel risico voor de microbiologische verontreiniging in de omgeving van de melkveehouderij. Een andere studie14 handmatige druk toegepast op de site van de biopsie tussen herhaalde biopsieën en na biopsie en huid kunnen worden afgesloten, en ijs op de site gedurende minstens 2 uur na de biopsie toegepast. In het huidige protocol was sterke druk uitgeoefend op de site van de biopsie voor 20 tot 25 min voldoende om te controleren bloeden.

Minimale bloed in de melk die langer voor een korte periode na de ingreep aanhoudt moet leiden tot een succesvolle biopsie techniek. Om te voorkomen dat een onderbreking van de secretie van melk tijdens melk teleurstelling en mastitis infecties, moeten intramammaire bloedklonters worden verwijderd met de hand strippen van de biopsied kwartaal10,14. In het huidige protocol, werd bloed waargenomen in de melk tot 48 uur na de biopsie. Echter, in een studie waarmee een groter aantal dieren, bloed in de melk werd waargenomen in de meerderheid van de koeien minder dan 6 dagen. Enkele dieren bleek bloed in de melk na 6 dagen8. Om deze reden is dagelijkse observatie van melk verschijning noodzakelijk voor 6 d na de ingreep. Dieren deed niet vertonen tekenen van mastitis infectie wanneer een grote weefsel monster14was verkregen. Echter vond vorige onderzoek dat herhaalde biopsieën uitgevoerd op hetzelfde dier met behulp van een naald dat die mastitis infectie incidentie was ongeveer 12% na de procedure8. In het huidige protocol had noch dier visuele tekenen van klinische mastitis infectie na de ingreep. Er is ook een kleine kans dat de insnijding site na de biopsie besmet kan raken.

Tolazoline hydrochloride, een drug die de effecten van sedatie keert, moet beschikbaar zijn in het geval van een overdosis van xylazine. Een hoge dosis xylazine kan longoedeem veroorzaken. Klinische symptomen van longoedeem omvatten respiratoire nood, ernstige kortademigheid, ademhalingsproblemen, hoesten en schuimend sputum. Symptomen van longoedeem zijn waargenomen, wordt het aanbevolen om als tolazine (2 tot 4 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt om te keren van de effecten van de xylazine.

Dit protocol beschrijft de techniek voor het uitvoeren van zowel een naald biopsie en core biopsie. Het voordeel van een biopsie van de kern ten opzichte van de naald biopsie is in het algemeen, de grotere weefsel monster (0,75 tot 1 g)9 met minimale negatief effect op de gezondheid van de uier. De naald biopsie is een minder invasieve methode dan de belangrijkste biopsie instrument. Echter meerdere biopsie geprobeerd te verkrijgen van een grotere hoeveelheid weefsel met behulp van die een naald biopsie procedure het risico verhogen kan van grote bloeden na de procedure, alsmede de bloedstolsels in de melk. Beide technieken minimale koe morbiditeit veroorzaakt en waren gemakkelijk bereikt met minimale opleiding van chirurgische personeel. Een korte termijn verandering in dagelijkse melkopbrengst (8 tot 10% afname) en haar samenstelling9 en voeropname vermindering van14 naar verwachting na de kern en naald biopsieën, respectievelijk. Beperkingen van de naald biopsie procedure zijn het kleine volume van weefsel verwijderd met de naald. Het instrument moet worden geactiveerd, alleen wanneer de naald binnen het weefsel is als biopsied en vaak meerdere pogingen nodig zijn om voldoende hoeveelheden weefsel, dat het risico van bloed in de melk en mastitis na de ingreep verhoogt. Beperkingen van de kern biopsie omvatten een hoger risico van bloeden na de ingreep als een grote hoeveelheid weefsel (> 200 mg) wordt verkregen. Bovendien, is de biopsie tool moeilijker te monteren vereisen adequate opleiding vóór gebruik.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de nationale Animal Nutrition Program en Virginia Tech. De technische bijstand van Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage en Dr. Izabelle Teixeira dankbaar zijn erkend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khatun, M., Sorensen, P., Ingvartsen, K. L., Bjerring, M., Rontved, C. M. Effects of combined liver and udder biopsying on the acute phase response of dairy cows with experimentally induced E. coli mastitis. Animal. 7, (10), 1721-1730 (2013).
  2. Buitenhuis, B., Rontved, C. M., Edwards, S. M., Ingvartsen, K. L., Sorensen, P. In depth analysis of genes and pathways of the mammary gland involved in the pathogenesis of bovine Escherichia coli-mastitis. BMC Genomics. 12, 130 (2011).
  3. Nickerson, S. C., Akers, R. M. Mammary Gland | Anatomy. Fuquay JW, Fox PF and McSweeney PLH (eds.), Encyclopedia of Dairy Sciences, Second Edition. 3, Academic Press. San Diego. 328-337 (2011).
  4. Akers, R. M. A 100-Year Review: Mammary development and lactation. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10332-10352 (2017).
  5. Ruegg, P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention1. Journal of Dairy Science. 100, (12), 10381-10397 (2017).
  6. Zhao, X., Lacasse, P. Mammary tissue damage during bovine mastitis: Causes and control. Journal of Animal Science. 86, (13), 57-65 (2008).
  7. Knight, C. H., Hillerton, J. E., Teverson, R. M., Winter, A. Biopsy of the bovine mammary gland. British Veterinary Journal. 148, (2), 129-132 (1992).
  8. Lima, J. A., et al. Effects of bovine mammary gland biopsy and increased milking frequency on post-procedure udder health, histology, and milk yield. Animal. 10, (5), 838-846 (2016).
  9. Farr, V. C., et al. An improved method for the routine biopsy of bovine mammary tissue. Journal of Dairy Science. 79, (4), 543-549 (1996).
  10. Weng, X., et al. Short communication: Repeated mammary tissue collections during lactation do not alter subsequent milk yield or composition. Journal of Dairy Science. 100, (10), 8422-8425 (2017).
  11. Peterson, D. G., Matitashvili, E. A., Bauman, D. E. Diet-induced milk fat depression in dairy cows results in increased trans-10, cis-12 CLA in milk fat and coordinate suppression of mRNA abundance for mammary enzymes involved in milk fat synthesis. Journal of Nutrition. 133, (10), 3098-3102 (2003).
  12. Baumgard, L. H., Matitashvili, E., Corl, B. A., Dwyer, D. A., Bauman, D. E. trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid decreases lipogenic rates and expression of genes involved in milk lipid synthesis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 85, (9), 2155-2163 (2002).
  13. Kasraeian, S., Allison, D. C., Ahlmann, E. R., Fedenko, A. N., Menendez, L. R. A comparison of fine-needle aspiration, core biopsy, and surgical biopsy in the diagnosis of extremity soft tissue masses. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468, (11), 2992-3002 (2010).
  14. de Lima, L. S., et al. A new technique for repeated biopsies of the mammary gland in dairy cows allotted to Latin-square design studies. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne De Recherche Veterinaire. 80, (3), 225-229 (2016).
  15. Ollier, S., et al. Whole intact rapeseeds or sunflower oil in high-forage or high-concentrate diets affects milk yield, milk composition, and mammary gene expression profile in goats. Journal of Dairy Science. 92, (11), 5544-5560 (2009).
  16. Soberon, F., et al. Effects of increased milking frequency on metabolism and mammary cell proliferation in Holstein dairy cows. Journal of Dairy Science. 93, (2), 565-573 (2010).
Boviene melkklier biopsie technieken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter