여기, 선물이 공동된 검색 및 quasimetagenomic 시퀀싱을 통해 살 모 넬 라의 동등에 대 한 음식과 환경 microbiomes에서 DNA 샘플을 준비 하는 프로토콜. 사용 문화 농축, immunomagnetic 분리 (IMS), 및 다중 변위 증폭 (MDA) 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA의 효과적인 농도 하실 수 있습니다.
준 metagenomics 시퀀싱 음식과 환경 샘플의 수정 된 microbiomes의 시퀀싱 기반 분석을 말합니다. 이 프로토콜에서 미생물 수정 대상 foodborne 병원 체 오염 물질의 탐지를 촉진 하기 위하여 genomic DNA와 단일 워크플로에 병원 체의 동등을 집중 하도록 설계 되었습니다. 여기, 우리가 설명 대표 음식과 알 팔 파 콩나물을 포함 하 여 환경 샘플에서 살 모 넬 라 enterica 준 metagenomics 분석에 대 한 샘플 준비 단계 지상 검은 후추, 갈은 쇠고기, 닭고기 가슴 보여주는 그리고 환경 면봉입니다. 샘플 먼저 동안 단축 및 조절 (4-24 h) 살 모 넬 라 의 문화 강화를 받게 됩니다. 살 모 넬 라 셀 다음 선택적으로 캡처됩니다 농축 문화에서 immunomagnetic 분리 (IMS)에 의해. 마지막으로, 다중 변위 증폭 (MDA)는 IMS 캡처한 세포에서 DNA를 증폭 하는 수행 됩니다. 이 프로토콜의 DNA 출력 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼으로 시퀀싱 될 수 있습니다. 살 모 넬 라 검출에 대 한 시퀀싱을 대체 하거나 시퀀싱 전에 살 모 넬 라 DNA의 농도 평가 하는 선택적 정량 PCR 분석을 수행할 수 있습니다.
Metagenomics 시퀀싱은 이론적으로 공동된 탐지 및 foodborne 병원 체의 동등 수 있습니다. 그러나, 음식 샘플 식품 미생물의 직접적인 연속 병원 체 분석 과제를 제시합니다. 첫째, foodborne 병원 체 들은 현재 수준 낮은 음식 샘플에 있습니다. 여전히 상용 신속한 검출 방법의 대부분 8-48 h 감지 레벨1로 병원 체 세포를 풍부 하 게 재배 해야 합니다. 둘째, 풍부한 microflora 셀 및 음식 만들기 foodborne 병원 체 DNA 음식 metagenome 및 애매 한 대상의 극히 metagenomic 시퀀싱 직접 검색 및 동등에 대 한 DNA 포함 하는 많은 음식.
음식 microbiomes의 foodborne 병원 체 시가 독 소 생산 대장균2,3 , 의 시퀀싱 기반 탐지를 촉진 하기 위하여 DNA의 내용이 풍부한 농도 수 있도록 보고 되었습니다. 살 모 넬 라 enterica4. 변형 식품 때문에 microbiomes는 여전히 다른 미생물 종의 혼합물, 그들의 시퀀싱은 준 metagenomic 분석4으로 불린다. 미생물 수정 문화 농축 혼자2,3 또는 다중 변위 증폭 (MDA)4,5immunomagnetic 분리 (IMS)와 함께에서 수행할 수 있습니다. IMS는 선택적으로 항 체-코팅 된 자석 구슬을 통해 농축 문화에서 병원 체 세포를 캡처할 수 있습니다. MDA는 고효율 ɸ29 DNA 중 합 효소6시퀀싱에 대 한 게놈 DNA의 충분 한 양을 생성할 수 있습니다. IMS-MDA는 임상 샘플7, 준 metagenomic 검색 문화 농축의 단축 및 식품 샘플4 살 모 넬 라 의 동등에서 문화권 병원 체 탐지를 허용 했다.
이 방법의 전반적인 목표 음식 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA와 후속 검색의 타겟된 농도 및 시퀀싱에 의해 살 모 넬 라 오염 물질의 동등 하 준 metagenomic DNA를 준비 하는 것입니다. 살 모 넬 라 검출8,9 에 대 한 표준 방법에 비해와10동등, quasimetagenomic 접근 실질적으로 오염 된 음식과 환경 샘플에서 처리 시간을 단축 수 있습니다. 일반적으로 두 가지를 통합 하 여 병원 체의 분자 하위 단일 워크플로우로 분석을 분리. 이 메서드는 식중독 발발 응답 및 다른 추적 다시 조사 병원 체 검출 이외에 필요한은 강력한 병원 체 동등 그리고 신속한 분석 처리 중요 한 특히 유용 합니다.
종종 로우 풍부 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 동질적인 존재 때문에, IMS MDA 전에 문화 농축은 여전히 살 모 넬 라 검출 및 동등; 따라서 프로토콜의 중요 한 단계 이다. 샘플 배경 식물을 기준으로 살 모 넬 라 를 풍부 하 게 증가 하는 최적의 조건을 식별 하기 위해 다른 농축 미디어 특정 샘플에 대 한 평가 될 수 있습니다. MLG와 BAM, 음식 샘플에서 살 모 넬 라 농축…
The authors have nothing to disclose.
저자 마크 해리슨과 세균성 긴장 및 다른 지원이이 연구에 친절 하 게 제공에 대 한 조지아 대학의 그웬 허쉬 감사 하 고 싶습니다.
Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |