Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لإعداد عينات من الحمض النووي من المواد الغذائية والبيئية ميكروبيوميس لكشف متضافرة و subtyping السالمونيلا عن طريق التسلسل كواسيميتاجينوميك. الاستخدام المشترك لإثراء الثقافة والفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتشرد متعددة يسمح التضخيم (MDA) فعالية تركيز الحمض النووي السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية.
Abstract
التسلسل ظاهرياً-ميتاجينوميكس يشير إلى تحليل على أساس التسلسل ميكروبيوميس المعدلة للغذاء والعينات البيئية. ويهدف تعديل ميكروبيومي في هذا البروتوكول، تركيز الحمض النووي من ملوث مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية المستهدفة تيسير الكشف عن و subtyping من مسببات المرض في سير عمل واحد. نشرح هنا، وإظهار خطوات إعداد نموذج لتحليل شبه ميتاجينوميكس انتيريكا السالمونيلا من التمثيل الغذائي والعينات البيئية بما في ذلك براعم البرسيم، فلفل أسود مطحون، الأرض لحوم البقر، الدجاج الثدي ومسحات البيئية. وتخضع عينات أولاً في إثراء الثقافة السالمونيلا لمدة أقصر وقابل للتعديل (ح 4 – 24). ثم بشكل انتقائي خلايا السالمونيلا يتم التقاطها من ثقافة الإثراء بفصل إيمونوماجنيتيك (IMS). وأخيراً، يتم التضخيم التشرد متعددة (MDA) لتضخيم الحمض النووي من الخلايا التي تم الاستيلاء عليها نظام الرصد الدولي. يمكن تسلسل إخراج الحمض النووي لهذا البروتوكول بمنصات تسلسل إنتاجية عالية. يمكن إجراء تحليل PCR كمي اختياري لاستبدال تسلسل للكشف عن السالمونيلا أو تقييم تركيز السالمونيلا الحمض النووي قبل التسلسل.
Introduction
نظرياً يسمح تسلسل Metagenomics كشف متضافرة و subtyping من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية. ومع ذلك، عينات المواد الغذائية تحديات لتحليل العوامل الممرضة حسب التسلسل مباشرة من ميكروبيومي الغذائية. أولاً، مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية غالباً ما تكون الحالي عند مستويات منخفضة في عينات المواد الغذائية. تتطلب معظم الأساليب المتاحة تجارياً الكشف السريع لا يزال ح 8 – 48 استزراع لإثراء الممرض الخلايا إلى مستوى الاكتشاف1. ثانيا، الكثير من الأطعمة تحتوي على خلايا النبت وفيرة و/أو الطعام الحمض النووي، مما يجعل DNA مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية نسبة ضئيلة من المواد الغذائية ميتاجينومي وهدفا بعيد المنال عن الكشف و subtyping مباشرة التسلسل الجينومية.
تم الإبلاغ عن تعديل للمواد الغذائية ميكروبيوميس السماح بتركيز كبير من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الحمض النووي لتسهيل الكشف على أساس تسلسل شيغا السمية المنتجة الإشريكيّة القولونية2،3 و انتيريكا السالمونيلا4. نظراً لأن تعديل المواد الغذائية ميكروبيوميس لا يزال مخاليط أنواع الميكروبية المختلفة، ويطلق على تسلسل شبه الجينومية تحليل4. يمكن إجراء تعديل ميكروبيومي بإثراء الثقافة وحدها2،3 ، أو في تركيبة مع فصل إيمونوماجنيتيك (IMS) ومتعددة التشرد التضخيم (MDA)4،5. يمكن التقاط نظام الرصد الدولي بشكل انتقائي خلايا الممرض من ثقافة الإثراء عن طريق الخرز المغناطيسي المغلفة بالأجسام المضادة. نجمة داود الحمراء يمكن أن تولد كميات كافية من الحمض النووي للتسلسل عن طريق بوليميراز الدنا ɸ29 ذات كفاءة عالية6. نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء أتاح كشف الممرض ثقافة مستقلة من7من العينات السريرية، وتقصير لإثراء الثقافة لكشف شبه الجينومية و subtyping السالمونيلا في الغذاء عينات4.
والهدف العام لهذا الأسلوب إعداد شبه ميتاجينوميك الحمض النووي من عينات الأغذية للسماح بتركيز المستهدفة السالمونيلا المجينية الحمض النووي والكشف عن اللاحقة و subtyping الملوث السالمونيلا بالتسلسل. مقارنة بالأساليب القياسية للكشف عن السالمونيلا 8،9 subtyping10، ونهج كواسيميتاجينوميك يمكن اختصار إلى حد كبير الزمنية اللازمة من الأغذية الملوثة، والعينات البيئية إلى الأنواع الفرعية الجزيئية لمسببات المرض بتوحيد البلدين عادة فصل التحليلات إلى سير عمل واحد. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص للتطبيقات مثل الاستجابة لمقتضيات الفاشية المنقولة وأخرى تتبع التحقيقات مرة أخرى حيث subtyping الممرض قوية مطلوب بالإضافة إلى الكشف عن العوامل الممرضة والتداول التحليلية السريع المهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نموذج
ملاحظة: تعد العينات الغذائية لتخصيب اليورانيوم قبل وفقا لدليل مختبر الميكروبيولوجيا (MLG) من "الإدارة الأميركية لسلامة الأغذية الزراعة" و "دائرة التفتيش" (وزارة الزراعة-فوزية)11 ودليل التحليل البكتريولوجي (BAM) من "الولايات المتحدة للأغذية" و المخدرات الإدارة (FDA)12.
- أسيبتيكالي مكان جزء 25 جرام من عينة غذائية مثل فلفل أسود والدجاج واللحم، وبراعم البرسيم أو مسحه بيئية داخل كيس خلاط مختبر عقيمة مع عامل تصفية مضمن. إعداد مسحه بيئية التي أسيبتيكالي يبلل الأسفنج مع مرق تخصيب اليورانيوم (فاسيلياديس رابابورت، RV). ثم اسحب المسحة على كامل سطح أو منطقة محددة سلفا ووضعه داخل كيس خلاط مختبر.
رقم 1: التمثيل الغذائي والعينات البيئية لكشف شبه ميتاجينوميكس و subtyping من السالمونيلا. توضع العينات في أكياس ستوماتشير تصفية العقيمة جنبا إلى جنب مع مرق RV. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- مزيج دقيق كل عينة ز 25 مع 225 مل إثراء RV مرق باستخدام مختبر خلاط أو من ناحية تدليك لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: يمكن استخدام متغيرات مرق RV حسبما أوصت به MLG وأم تبعاً لأنواع العينات. - احتضان خليط مرق تخصيب عينة في حاضنة مختبر في 42 درجة مئوية ح 4 – 24.
- بعد الحضانة، جمع عينة فرعية 50 مل من مرق الإثراء من الجانب الذي تم تصفيته من الحقيبة في أنبوب الطرد مركزي منفصلة 50 مل.
- الطرد المركزي الأنبوب في 100 غ س لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام الصلبة في هوموجيناتي.
- استعادة المادة طافية بعناية للطرد المركزي جديد 50 مل أنبوب والطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,000 – 6,000 س ز لمدة 10 دقيقة لاستعادة خلية بيليه.
- (اختياري) تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه بإعادة تعليق في 5 مل من الماء ببتون مخزنة (الاتحاد) والطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,000 – 6,000 × ز لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: الاتحاد يمكن إعداد حل 10 غم من ببتون، 5 غ كلوريد الصوديوم، g 3.5 من ثنائي الفوسفات، و 1.5 غرام فوسفات مونوبوتاسيوم في 1 لتر من الماء المقطر. ينبغي تعديل درجة الحموضة نهائياً إلى 7.2 ± 0.2 عند 25 درجة مئوية. يمكن أيضا استخدام اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية عن 15 دقيقة الاتحاد المتاحة تجارياً. - تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 5 مل الاتحاد.
2-الفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتضخيم التشرد متعددة (MDA)
ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل بين العينات، العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء تغيير نصائح الماصة لكل أنبوبة، تجنب لمس الأنبوب مع ماصة ولا تضع أنابيب قريبة من بعضها البعض في موقف المغناطيسي أثناء الخطوة الغسيل.
- ذوبان الجليد المخزن المؤقت الذي عينة ورد فعل المخزن المؤقت من الطقم MDA على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في وقت مبكر.
- بيليه في الاتحاد مع 20 ميكروليتر من مكافحةالسالمونيلا الخرز في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مل 1 ميكس إعادة تعليق خلية ووضعه في خلاط الدورية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: النباتات قادرة على المنافسة والجسيمات الدهون والبروتينات في بيليه ريسوسبينديد يمكن أن تتداخل مع نظام الرصد الدولي. تمييع بيليه إعادة تعليق خلية في الاتحاد مفيدة الحد من الخسائر في المجمعاتالسالمونيلا حبة-من موقف المغناطيسي أثناء الغسيل الخطوات. - إدراج هذه الأنابيب في موقف المغناطيسية والسماح 3 دقيقة لاسترداد الخرز السليم بعكس الرف عدة مرات إلى تركيز الخرز في بيليه على جانب الأنبوب.
- تبقى الأنابيب على الوقوف المغناطيسية. نضح وتجاهل المادة طافية من كل أنبوبة، فضلا عن السائل المتبقي في كاب كل أنبوبة.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم تعكير بيليه حبات IMS على الجدار الجانبي للأنبوب ضد المغناطيس. - إزالة أنبوب حامل من موقف المغناطيسية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% (v/v) بوليسوربيت 20) وعكس عدة مرات لإزالة البكتيريا الملزمة غير تحديداً من المجمع.
- كرر الخطوات من 2، 3 – 2.5 مرتين.
- بعد الغسيل 3rd ، إجراء فصل المغناطيسية النهائي الخرز بتكرار الخطوات 2، 3 – 2.4. إزالة أنابيب من الرف المغناطيسية ووضعها في [ميكروفوج] 1 s تدور أسفل الخرز. ثم، ضع الأنابيب في الرف المغناطيسية لمدة 3 دقائق قبل إزالة أي المخزن المؤقت غسيل المتبقية.
- إعادة تعليق المجمعاتالسالمونيلا حبة-في 9 ميكروليتر من عينة المخزن المؤقت، واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تمسخ.
- بعد التبريد إلى 4 درجات مئوية على الجليد، الجمع بين 9 ميكروليتر من المخزن المؤقت لرد فعل زائد 1 ميكروليتر من إنزيم مزيج والحفاظ على الجليد.
- في cycler حرارية، احتضان أنابيب عند 30 درجة مئوية ح 2 للتضخيم، متبوعاً بتدفئة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط الإنزيم وباردة إلى 4 درجات مئوية على الجليد.
- تقييم كمية ونوعية المنتجات نجمة داود الحمراء بقياس تركيز الحمض النووي والنقاء (260/280 نسبة > 1.8) على صك فلوروسبيكتروميتير.
ملاحظة: بسبب الربط غير محددة من نظام الرصد الدولي الخرز، الحمض النووي من الكائنات الحية عدا السالمونيلا المحتمل أن تكون موجودة في منتجات جمعية نجمة داود الحمراء، ولكن فإنه لا يؤثر على تحليل المتلقين للمعلومات. - تخزين المنتجات النهائية (20 ميكروليتر) في-20 درجة مئوية حتى استخدام PCR الوقت الحقيقي و/أو إعداد المكتبة للتسلسل كواسيميتاجينوميكس.
3. في الوقت الحقيقي بكر
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ل 1) الكشف عن السالمونيلا دون subtyping، و 2) تقييم نوعية العينة قبل التسلسل كواسيميتاجينوميكس.
- إعداد 18 ميكروليتر مزيج PCR كل عينة، تتضمن العالمي بكر سيد مزيج (10 ميكروليتر)، إلى الأمام التمهيدي (2 ميكروليتر، 900 نانومتر)، عكس التمهيدي (2 ميكروليتر، 900 نانومتر)، مسبار (2 ميكروليتر، 250 نانومتر)، والمياه الصف الجزيئية (2 ميكروليتر).
ملاحظة: السالمونيلا-كبسولة تفجير اليغنوكليوتيد محددة (إلى الأمام: كتكاككاجاجاتاكاكاتج، عكس: أجكتكاجاككاااجتجاككاتك) وصممت مسبار لتضخيم تسلسل 94-بي بي داخل الجينات بعد (لا الانضمام إلى بنك الجينات. AF 282268)13. - مزيج المنتج MDA من الخطوة 2.12 بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاًالسالمونيلا مجمعات حبة-جنبا إلى جنب مع سائل لإنشاء تعليق. إضافة 2 ميكروليتر من التعليق إلى 18 ميكروليتر من مزيج PCR.
- تشغيل PCR الوقت الحقيقي استخدام بروتوكول PCR الوقت الحقيقي أمثل، تحديد فترات عقد اثنين، واحد في 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وأخرى عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية ل 60 ثانية.
- حساب عتبة دورة (Ct)، وهو عدد الدورات اللازمة للأسفار من تضخيم الحمض النووي لعبور خط العتبة.
ملاحظة: يتم تعيين عتبة الخط في المرحلة الخطية بين خط الأساس والهضبة قطع التضخيم من العينات. نتائج سلبية تتوافق مع القيم المقطعية أكثر من 40 أو عينات بالأشعة المقطعية قيم أعلى من المراقبة السلبية.
4-المكتبة إعداد تسلسل كواسيميتاجينوميك
ملاحظة: يمكن متسلسلة منتجات جمعية نجمة داود الحمراء بكل قصيرة قراءة وقراءة طويلة (نانوبوري) منصات التسلسل. استخدام أحدث إصدار من الحمض النووي مجموعات المكتبة الإعدادية المقدمة من الشركات المصنعة لمنصات التسلسل. القيام بإعداد مكتبة الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. استخدام بروتوكول الحمض النووي الجينومي 2D المدخلات المنخفضة لإعداد مكتبة ل منصة طويلة-قراءة التسلسل5. لإعداد مكتبة لمنصة قراءة قصيرة التسلسل، وإجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة ترد أدناه.
- اتباع أساليب إعداد المكتبة القياسية بإضافة حلول العازلة والمواد الكاشفة لمنتجات جمعية نجمة داود الحمراء. نقل 40 ميكروليتر من المنتجات MDA التسلسل هيأهم للوحة جديدة وإضافة 20 ميكروليتر من PCR تنقية حبات لكل بئر.
- احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق دون المصافحة.
- أغسل حبات مع الإيثانول 80% وجاف الخرز لمدة 12 دقيقة.
- إعادة تعليق الخرز المجففة في ميكروليتر 53 من المخزن المؤقت لاستثارة واحتضان لمدة 2 دقيقة دون أن تهتز.
- تمييع وتجمع مكتبات اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: 10:00 م المجمعة ومكتبة التشويه والتحريف جاهز الآن لتكون متسلسلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل التسلسل كواسيميتاجينوميك، يمكن تقييم مجمل كمية ونقاء المنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء التي فلوروسبيكتروميتير (الجدول 1).
| وقت التخصيب (ح) | قيمة الأشعة المقطعية | تركيز (نانوغرام/ul) | نقاء (260/280) | |
| العلامة A | 4 | 24.71 | 812.91 | 1.89 |
| 8 | 25.80 | 900.36 | 1.87 | |
| 12 | 15.41 | 753.88 | 1.84 | |
| العلامة التجارية ب | 4 | 20.63 | 872.61 | 1.87 |
| 8 | 22.61 | 993.41 | 1.87 | |
| 12 | 19.08 | 954.44 | 1.87 |
الجدول 1: تقييم نوعية وكمية الحمض النووي من عينات لتسلسل شبه الجينومية. تم تلقيح خلايا السالمونيلا في 25 جرام الدجاج الخام لاثنين من العلامات التجارية في 1 زيمبابوي/غ. إينوكولاتيد تم إثراء عينات في RV 4 و 8 ح 12 قبل نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء.
تقييم الكمية المستهدفة من السالمونيلا الحمض النووي يمكن أن يؤديها PCR الوقت الحقيقي (الجدول 1 و الشكل 2)، الذي يعمل أيضا كبديل للكشف عن السالمونيلا إذا subtyping غير مطلوب.
الشكل 2: PCR الوقت الحقيقي لتقييم السالمونيلا الكشف أو عينة لتسلسل شبه metagenomics. تظهر منحنيات التضخيم من PCR الوقت الحقيقي السالمونيلا الحمض النووي في منتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء بعد ح 4 و 8 و 12 من الوقت تخصيب اليورانيوم. ويرد أيضا عينة بعد تخصيب ح 2 فقط. كانت الزنزانات السالمونيلا (0.27 زيمبابوي/ز) الملقحين 25 جرام من الدجاج الخام من اثنين من العلامات التجارية A و b الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
قراءات فلوروسبيكتروميتير السماح بتقييم أولى لإعداد نموذج. تركيز نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء المنتجات المعدة من السالمونيلا عينات الدجاج الملوثة تتراوح من 701.54 إلى 945.86 نانوغرام/ميليلتر، مما يوحي بأن عينات الحمض النووي قد تم تضخيمها. وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، هو تركيز عينة الحمض النووي الحد الأدنى لفترة قصيرة قراءة وقراءة التسلسل الطويل 0.2 نانوغرام/ميليلتر و 1 ميكروغرام، على التوالي. 260/280 نسبة 1.88 (الجدول 1)، وتراوحت 1.85 عرض درجة نقاء عالية من عينات الحمض النووي مع مستويات منخفضة من التلوث بالبروتين.
قيم أقل من الأشعة المقطعية تشير إلى تركيزات أعلى من الحمض النووي السالمونيلا في العينة. كما هو مبين في الجدول 1 و الشكل 2، إنقاص القيم المقطعية لمنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء كما يزيد الوقت تخصيب اليورانيوم. في أعمالنا السابقة دراسة4، عندما تكون قيم Ct أقل من 25، الغالبية (> 50%) لسراج الدين كان من المحتمل أن يكون التسلسل الجينوم، والتنبؤ بالنمط المصلي المسيطر من يقرأ التسلسل الخام كانت ناجحة.
إثراء ثقافة فاشلة أو نظام الرصد الدولي يمكن أن يؤدي قيم Ct عالية نسبيا مما يشير إلى تركيز منخفض من الحمض النووي السالمونيلا في العينة النهائية كما هو مبين في الشكل 2. يمكن أن يحدث هذا رغم تركيز الحمض النووي عالية ونقاء المنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء كما اقترح القراءات فلوروسبيكتروميتير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بسبب وفرة منخفضة كثيرا ومتجانسة في وجود السالمونيلا في الغذاء والعينات البيئية، إثراء الثقافة أمام جمعية نجمة داود الحمراء--نظام الرصد الدولي ما زال ضروريا للكشف عن السالمونيلا و subtyping؛ ولذلك خطوة حاسمة للبروتوكول. تحديد الشروط المثلى لزيادة الوفرة من السالمونيلا بالنسبة للنباتات خلفية عينة، يمكن تقييم إثراء مختلف وسائط الإعلام لعينات محددة. وفقا MLG وأم، يمكن استخدام المتوسطة انتقائية مثل مرق RV والمتوسطة غير انتقائية مثل مرق الماء واللاكتوز ببتون مخزنة بشكل مؤقت للتخصيب السالمونيلا من العينات الغذائية. تم تقييم استخدام رف في 42 درجة مئوية في أعمالنا السابقة الدراسة4 لإثراء السالمونيلا من لحوم الدجاج الخام وفيض الخس بيبيركورنس الأسود لدعم تحليل كواسيميتاجينوميك لمسببات المرض. ووفقا لإدارة الأغذية والعقاقير بام وأوك9بريكولابوراتيفي8،والدراسات التعاونية14،15، ينصح RV لتحليل الأطعمة عالية الحمولة الميكروبية الميكروبية ومنخفضة.
المدة المثلى لإثراء الثقافة يعتمد على عدة عوامل، مثل نوع العينة ومستوى تلوث السالمونيلا والحالة الفسيولوجية للملوث السالمونيلا . على سبيل المثال، عند مستويات منخفضة السالمونيلا (مثلاً، < 1 زيمبابوي/ز) خلايا موجودة في عينة لحوم وتحت الضغط التبريد، وقت التخصيب أطول (مثلاً، > ح 12) قد تكون مطلوبة لإحياء وإثراء الخلايا السالمونيلا . وفرة كافية من السالمونيلا في ميكروبيومي تم التعديل يؤدي إلى تغطية كافية تسلسل جينوم السالمونيلا الملوث، التي يمكن أن تسمح لمستوى إجهاد النوكليوتيدات واحدة تعدد الأشكال (SNP) كتابة4. إثراء الثقافة أقصر (مثلاً، أقل من 12 ح) ممكن للكشف السريع عن5 أو تنميطا السالمونيلا4.
يمكن أن يؤدي ارتفاع مستويات تلوث السالمونيلا و/أو إثراء الثقافة أطول من عينات الأغذية الملوثة في تركيزات أعلى من الحمض النووي السالمونيلا في الأغذية المعدلة ميكروبيوميس، مما يؤدي إلى انخفاض قيم Ct من تحليل PCR في الوقت الحقيقي. القيم المقطعية عرض علاقة سلبية مع تغطية تسلسل جينوم السالمونيلا الملوث4، وذلك يمكن استخدامها لتحسين وتعديل سير العمل. حسب تجربتنا، هو إثراء الثقافة، خاصة طول، غالباً ما تركيز جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها. على سبيل المثال، كانت قيمة الأشعة المقطعية المنتج نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء من عينة الدجاج خام مرتفعة نسبيا في 35.94 (الشكل 1). هذه العينة تم تلقيح مع زيمبابوي/ز 2.5 SE الخلايا والمحتضنة في فرع الاتحاد في 37 درجة مئوية حاء 2 تسلسل هذه العينة لم تقدم تغطية كافية للجينوم سراج الدين للسماح للتنبؤ بالنمط المصلي المسيطر. وبالمقارنة، كانت جميع العينات الأخرى مع ح 4 أو التخصيب أطول سيروتيبيد بنجاح من كواسيميتاجينوميك تسلسل البيانات (البيانات لا تظهر).
بعد التسلسل، نوصي باستخدام كراكن16 للتعرف على السالمونيلا يقرأ لمزيد من التحليلات المعلوماتية. يمكن استخدام SNP كفسان أنابيب17 و18 من سيقسيرو للحزب الوطني اﻻسكتلندي كتابة وتنميطا التنبؤ من تسلسل الخام على ما يلي، على التوالي.
هذا الأسلوب كواسيميتاجينوميك نقائص عديدة. أولاً، ينبغي استخدام تركيز الحمض النووي ونقاء المنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء التي تقاس فلوروسبيكتروميتير فقط كمؤشر أولى لإعداد نموذج مناسب. نظراً لكفاءة عالية من جمعية نجمة داود الحمراء، يمكن أن تتضاعف كميات ضئيلة من الحمض النووي الإدخال تكفي تسلسل الجينوم كله19. ولذلك، لا يزال يمكن أن تتولد عينات الحمض النووي كمية ونوعية عالية حتى في حالة فشل إثراء الثقافة أو نظام الرصد الدولي فعالية تركز الخلايا السالمونيلا . تحليل PCR الوقت الحقيقي الاختياري يقدم تقييما أكثر هادفة ومفيدة لسير العمل إعداد نموذج كامل. ثانيا، صعوبة الثقافة السالمونيلا الخلايا، مثل قابلة للتطبيق ولكن البكتيريا نونكولتورابل (فبنك) لم لا20، قد تنمو خلال إثراء الثقافة. ولذلك، قد لا يتم الكشف عن هذه الخلايا باسلوبنا.
وباختصار، مقارنة بالأساليب التقليدية، لدينا نموذج إعداد الطريقة والنهج تسلسل شبه ميتوجينوميك يمكن السماح بإجراء تخفيض كبير في تحول التحليلية من السالمونيلا-تلوث الأغذية والعينات البيئية إلى subtyping قوية من الملوثات السالمونيلا . وبالإضافة إلى السالمونيلا، إمكانات هذا الأسلوب يكون الكشف التطبيقية سريعة ومنسقة وسوبتيبينج الأخرى المسببة للأمراض المنقولة عن طريق الأغذية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر مارك هاريسون وهيرش جوين من جامعة جورجيا لتقديم يرجى الضغط البكتيرية وغيرها من أشكال الدعم لهذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4 °C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80 °C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80 °C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80 °C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4 °C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. , Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella. , Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018).
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
