여기, 우리 프로토콜 및 관련 만성 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인을 쥐 모델을 사용 하 여 메 틸 Seq, epigenomic 플랫폼의 구현을 설명 합니다. 결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 쥐에서 스트레스 노출에서 발생 하는 메 틸 화 차이 감지 수를 보여 줍니다.
다양 한 동물의 게놈을 사용할 수 있게,이 동물 모델에 동적 epigenetic 변화를 캡처할 수 있는 도구에 대 한 증가 필요가 있다. 쥐 epigenetic 도구 통찰력 기계 정보를 제공 하는 많은 약리학 및 행동 연구를 보완 수 있는 하나의 특정 모델 동물입니다. 이 위해, 우리는 쥐 쥐 게놈에서 DNA 메 틸 화 수준을 평가할 수 있는 SureSelect 캡처 시스템 (메 틸-Seq 라고 함)를 적응. 쥐 디자인 대상 발기인, CpG 섬, 섬 해안, 및 모든 RefSeq 유전자에서 GC 풍부한 지역.
쥐 실험에는 플랫폼을 구현 하기 위해 남성 Sprague Dawley 쥐 혈액 샘플 게놈 DNA 추출에 대 한 수집 된 후 3 주 동안 만성 변수 스트레스에 노출 되었다. 메 틸-Seq 라이브러리는 전단, 어댑터 결 찰, 대상 농축, 황산 변환 및 멀티플렉싱 하 여 쥐 DNA 견본에서 건설 되었다. 라이브러리는 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 시퀀스 읽기 강조 하 고 강세가 없는 쥐의 DNA 사이 DMRs를 식별 하기 위해 분석 했다. 최고 후보자 DMRs 했다 독립적으로 유효성을 검사 하지 황산 pyrosequencing 플랫폼의 견고성을 확인 하 여.
결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 스트레스에 노출에 의해 유도 된 메 틸 화 변화를 캡처할 수 있는 유용한 epigenetic 도구를 보여 줍니다.
높 처리량 연속에 발전은 다양 한 모델 및 비 모형 유기 체 게놈 시퀀스에 이르렀다. 같은 시퀀스의 여부 유전학, 비교 유전체학, 및 transcriptomics 연구를 촉진 했다. 예를 들어, 사용 가능한 게놈 시퀀스는 매우 풍요롭게 히스톤 수정1또는 황산 시퀀싱와 연결에 따라 DNA 칩 Seq 실험에서 시퀀싱 데이터를 정렬 하는 데 유용는 DNA 메 틸 화에 의해 측정 unmethylated cytosines2의 황산 변환에서 형성 uracil 감지. 그러나, 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있는 종의 규제 시퀀스의 주석된 데이터의 부족 때문에 그들의 디자인에서 사용 가능한 게놈 시퀀싱 데이터를 통합 하는 epigenomic 플랫폼의 구현에서 지연 되었습니다.
특히, DNA 메 틸 화 methylomic 플랫폼을 구축 하기 위한 사용 가능한 게놈 데이터를 활용할 수 있는 DNA에 가장 널리 공부 후 성적인 수정 중 하나입니다. 1 개의 그런 보기는 인간 methylome3, 정신과4,5종양학에서 다양 한 분야에서 널리 사용 되었습니다 배열 기반 플랫폼입니다. 불행 하 게도, 비인간적인 동물 모델에 대 한 비슷한 플랫폼은 거의 아무 널리 사용 플랫폼을 그들의 초기 디자인에서 게놈 시퀀스의 장점을 받아들으로 부족, 있습니다.
비 인간 동물 모델의 methylomic 프리를 평가 하는 일반적인 방법은 이다 감소 표현 황산 시퀀싱 (RRBS)6. 이 접근 방식을 제공 하는 포괄적인 methylomic 풍경, 낮은 읽기-심층 취재 비용 및 게놈2의 큰 유전자 가난한 지역에서 제한 된 기능 정보를 제공 하는 전체 게놈 황산 시퀀싱 비용 극복 . RRBS 제한 다이제스트 및 일반적으로 유전자 발기인 근처 발견 하 고 유전자 규칙7에 역할을 생각 하는 CpG 섬 등 매우 다양 한 GC 시퀀스에 대 한 풍부 하 게 genomic DNA의 크기 선택 포함 한다. 중요 한 연구의 숫자에 RRBS 메서드를 사용 하는 동안 제한 효소에 의존이 아니다 주목할 만한 도전과 한계 없이. 예를 들어, GC 풍부한 시퀀스 RRBS의 농축은 전기 이동 법에 의해 제한 효소와 후속 크기 선택에 의해 인식 하는 특정 순서의 존재에 전적으로 의존. 즉, 이러한 금지 사이트를 포함 하지 않는 모든 게놈 영역 크기 선택 시 제외 됩니다. 또한, 크로스-종 비교 동일한 제한 사이트는 다른 종 중 동일한 loci에 존재 하지 않는 도전 하.
RRBS의 한계를 극복 하는 한 가지 방법은 사용 하는 플랫폼의 설계에 게시 된 게놈 시퀀스를 활용 하는 농축 방법. 어레이 기반 인간 플랫폼 뇌관 프로브 대립 유전자 특정 (황산 변환 후 TG 대 CG) 대상 어 닐 링 및 뇌관 확장을 위한 특정 cpgs 내 겠에 대 한 설계를 사용 합니다. 그것의 디자인 뿐만 아니라 사용할 수 있는 인간 게놈 시퀀스, 하지만 실험적으로 확인 된 규제 영역 문의 인코딩 및 합8등의 여러 줄에서 인수를 반영 한다. 인간 methylomic 조사에 그것의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 비슷한 플랫폼 모델 동물에 대 한 존재 하지 않습니다. 또한, 배열 기반 형식 프로브 배치에 사용할 수 있는 영역에 중요 한 제약 조건을 배치합니다. 지난 몇 년 동안, 노력 캡처 프로브 설계 및 차세대 시퀀싱의 높은 처리량 기능 제공 대상-특이성 결합 되었습니다. 이러한 노력 결과 마우스 게놈 (마우스 메 틸-Seq), 메 틸 화9,10에 두뇌 또는 glucocorticoid 유발 차이 식별 하는 데 사용 했다의 시퀀싱 기반 대상 농축 시스템입니다. 다른 모델과 아닌 모델 동물에 대 한 비슷한 플랫폼이이 동물에 epigenomic 연구를 촉진 하기 위하여 필요 합니다.
여기, 우리는 쥐에 methylomic 분석을 소설이 플랫폼의 구현 방법을 보여 줍니다. 쥐는 약리학, 신진 대사, 내분비학, 동작에 중요 한 동물 모델을 역임 했다. 예를 들어 약물 독성, 비만, 스트레스 반응, 또는 마약 중독을 기본 메커니즘을 이해 하는 증가 필요가 있다. 이러한 조건과 관련 된 methylomic 변경 캡처 수 있는 높은 처리량 플랫폼 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 증가할 것입니다. 쥐 게놈은 아직 규제 지역에 대 한 주석 부족, 이후 비 중복 발기인, CpG 섬, 섬 해안11, 통합 하 고 이전 쥐 메 틸-Seq 플랫폼12GC 풍부한 시퀀스를 식별 합니다.
쥐 게놈에 대 한 SureSelect 대상 농축 (일반적으로 메 틸-Seq 라고도 함) 플랫폼의 성공적인 설계 및 구현 평가, 우리는 만성 변수 스트레스 (CVS)13 차동 methylated 식별 하의 쥐 모델 고용 강세와 스트레스 동물 사이의 영역입니다. 우리의 플랫폼, 프로토콜, 디자인과 구현 체 누구의 게놈 시퀀스는 이미 사용할 수 있지만 제대로 주석이 남아에 포괄적이 고 편견 후 조사를 실시 하 고 싶은 수 있습니다 수사에 대 한 유용할 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 설계 및 쥐 게놈에 대 한 메 틸-Seq 플랫폼 구현. 스트레스의 쥐 모델의 유틸리티를 시연 함으로써 우리는 실험 및 분석 파이프라인 두 비교 그룹 사이 차동 갠 영역을 제공할 수 있습니다 설명 했다.
플랫폼의 성공적인 구현을 보장 하기 위해, 몇 가지 중요 한 단계를 관찰 해야 합니다. 첫 번째, 초기 DNA 품질 및 수량 최종 메 틸-Seq 라이브러리의 양과 품질에 큰 영향을 있다. 우리는 fluorometer 보다는 분 광 광도 계, 우리의 DNA 측정 현재 이중 가닥 DNA의 수량을 반영 되도록 사용. 분자 크기와 어댑터 결 찰 후 전단에 따라 DNA의 수량을 측정 하는 bioanalyzer 사용 되었다. 분자 크기 다음이 단계 사이 “변화”를 확인 하는 것은 후속 단계에서 PCR 어댑터 중재를 받게 될 것 이다 각 DNA 파편의 끝에 어댑터의 존재를 확인 중요 합니다. DNA는 어댑터 결 찰 단계의 끝에 남은 수량 또한 중요 하다, 적어도 100부터 ng 라이브러리 제품의 충분 한 수량 대상 농축 황산 변환 단계 후 사용할 수 있도록 하려면이 단계에서 필요 하다. 최종 높은 감도 측정 라이브러리는 제대로 다음-세대 시퀀서에 후속 클러스터링에 대 한 희석 수 있도록 생성 된 메 틸-Seq 라이브러리에서 수행 되었다. 마지막으로, 황산 pyrosequencing 높은 양적, 독립적인 방법으로 분석 파이프라인의 정확도 평가 하기 위해 고용 되었다. 원래 샘플 및 추가적인 동물을 사용 하 여 복제를 사용 하 여 최종 검증은 실험 DNA 메 틸 화에 생물학적으로 상당한 변화를 감지할 수 있도록 중요 한 단계입니다.
우리는 또한 프로토콜에서 편차 또는 경우 문제 발생 시 몇 가지 지침을 포함 합니다. 첫째, 그것은 최종 수리, 어댑터 결 찰, 또는 자석 구슬 정화 단계 동안 너무 많은 DNA를 잃을 수입니다. 시작 하는 양의 DNA 작은 수 또는 (< 200 ng) 제한 된 조직/DNA 가용성 또는 형광 활성화 된 세포 분류 등 다양 한 농축 방법의 구현. DNA의 과도 한 손실에 대 한 보상을 수 또는 도서관 건설 프로토콜에 걸쳐 DNA 양을 시작 낮은 사이클 수를 증가 하는 두 개의 라이브러리 증폭 단계 수 있습니다. 그러나, 더 이상 추가 2-3 주기는 권장, 과도 한 템플릿 증폭 시퀀싱 되 고 중복 읽기의 증가를 끌 것입니다. 이러한 중복 백분율 메 틸 화 계산에 바이어스를 방지 하기 위해 맞춤 단계에서 제외 됩니다. 둘째, 평균 DNA 크기 30 bps 이상으로 증가 하지 않습니다, 경우는 시 약은 새로운 T4 DNA 중 합 효소, Klenow, 또는 T4로 리가 나이가 있을 수 있습니다 있는지 확인 합니다. 상업적으로 이용 가능한 대체 시 약을 사용할 수 있습니다.
또한, 예측된 DMRs pyrosequencing, DNA 메 틸 화 차이 존재 하지 않는 또는 분석에 의해 예측 보다 훨씬 적은 있다 의해 확인 하지 수도 가능 하다. 후보 지역 가난한 정품 확인은 너무 때 pyrosequencing 결과 차동 메 틸 화를 확인 하지 않습니다 같은 많은 게놈 넓은 분석에 대 한 일반적인 문제 또는 효과 크기는 분석에 의해 예측 보다 훨씬 작습니다. BSmooth 여러 cpgs 내 겠 창 한 분석 패키지는 “부드럽게” 메 틸 화 수준입니다. 현재 실험에 대 한 BSmooth 연루는 DMR의 메 틸 화 수준의 황산 pyrosequencing에 의해 확인 되었다. 그러나, 거기 있을 것 이다 메 틸 화 수준 예측 BSmooth와 pyrosequencing에 의해 확인 사이의 불일치. 모든 연속 DNA 메 틸 화에 50% 이상 차이가 날 수 있습니다 cpgs 내 겠 또는 메 틸 화 값으로 인해 제외 된 cpgs 내 겠은 DMR 내 cpgs 내 겠 평균 메 틸 화 값을 추정 다듬기 기능에서 발생 하는 불일치 하위 임계값 깊이 읽기. R-패키지 MethylKit24 cpgs 내 겠 또는 심지어 단일 cpgs 내 겠 그 메 틸 화 수준 연관 강하게 pyrosequencing의 유효성을 검사 하는 그의 작은 윈도우를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 패키지를 구현 하 고 pyrosequencing에 의해 그들의 예측된 영역 또는 차동 메 틸 화의 cpgs 내 겠 테스트 데이터의 안정성을 보장 합니다. 또는, 원래 메 틸-Seq 라이브러리 resequenced 하 고 읽기 깊이 증가 읽기 파일에 추가 될 수 있습니다. 때문에 메 틸 화 수준의 결정 반 양적 및 구술 읽기 수로 [(# of CpGs) / (TpGs + cpgs 내 겠 #)], 주어진된 포장 소비재의 백분율 메 틸 화 값의 정확도 높일 것에 대 한 읽기 깊이 증가. 이 연구에서 우리 메 틸 화 값 적어도 10 읽기에 의해 결정 되었다 고 각 포장 소비재에 대 한 19 x의 전체 읽기 범위 달성 cpgs 내 겠 고려.
쥐 메 틸-Seq 플랫폼의 제한 없이 아니다. 전체 게놈 황산 시퀀싱 보다 비용 효과적인 동안, 그것은 상당히 다른 방법 보다 더 비싸다입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비용의 대부분을 캡처 시스템 그리고 시퀀서에 차선을 구매 했다. 크로스-조직 비교 덜 큰 (25-70%) 차이12 DNA 메 틸 화에 따른 요구와 필요한 읽기 깊이 따라 레인 당 더 많은 샘플을 멀티플렉싱 높은 용량 플랫폼을 사용 하 여 비용을 줄일 수 있습니다. 또한, 샘플 준비는 다른 방법 보다 더 많은 시간이 걸리는. 차세대 시퀀싱을 통합 하는 다른 풀 다운 방식와 마찬가지로, 하는 동안 추가 황산 변환 및 정화 단계 작업 부하를 추가 합니다. 전반적으로, 메 틸-Seq 플랫폼 전체 게놈 시퀀싱에 대 한 비용 효율적인 대안 이며 상당히 microarray 기반 플랫폼 분석 보다 더 이상의 2.3 백만 cpgs 내 겠에서 기본적인 쌍 해상도 제공. 날짜 하려면, 상용 인간과 마우스 메 틸-Seq 플랫폼 알코올 의존 변화 원숭이 뇌25,26, 마우스 뇌9, 및 혈액 neurodevelopmental 유전자를 사용 되었습니다. 스테로이드 제제10대상 또한, 제한 효소에 의해 시퀀스 인식에 특정 영역을 대상으로 기능 그것은 종 간 비교에 대 한 이상적인 플랫폼을 통해 있습니다. 이 연구를 위해 우리는 많은 약리학, 대사, 행동 실험 게놈 넓은 methylomic 도구의 이점 없이 수행 되는 쥐에 대 한 메 틸-Seq 플랫폼을 설계 되었습니다. 우리의 데이터는 스트레스의 쥐 모델에서 DMRs를 검색 하기 위해 사용할 수 있습니다을 전체 플라즈마 CORT 수준 같은 다른 생리 적인 매개 변수 상관을 보여준다.
메 틸-Seq 플랫폼 규제 영역을 문서화 하는 충분 한 실험적 증거를 없을 수 있습니다 시퀀스 유전자와 동물에 있는 후 성적인 실험에 이상적입니다. 이러한 영역은 사용할 수 있습니다 때 추가 지역 맞춤형 고 현재 버전에 연결 된 수 있습니다. 또한, 플랫폼 대상 농축 제한 효소 인식에 의해 제약 되지 않습니다 때문에, 비교 유전체학에 이상적입니다. 예를 들어, 그것은 특정 제한 사이트를 비호 하는 여부에 관심사의 어떤 유전자의 발기인 지구를 캡처할 수 있습니다. 마찬가지로, 마우스 또는 관심의 게놈에 보존은 인간에서 확인 된 그들과 같은 어떤 규제 영역을 캡처할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIH 그랜트 MH101392 (RSL) 및 다음 수상 및 재단에서 지원에 의해 투자 되었다: NARSAD 젊은 수 사관 상, 마가렛 앤 가격 조사 기금, 찰스 T. 바 우 어 재단, 베이커를 통해 제임스 Wah 기분 장애 학자 기금 재단, 그리고 프로젝트 일치 재단 (RSL).
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |