在这里, 我们描述了同道平台甲基 Seq 的协议和实现, 使用老鼠模型来识别与慢性应力暴露相关的表观变化。结果表明, 大鼠甲基序列平台能够检测大鼠应力暴露引起的甲基化差异。
随着各种动物的基因组变得可用, 越来越多的工具需要能够捕捉这些动物模型中的动态表观变化。鼠是一种特殊的模型动物, 表观遗传学工具可以补充许多药理学和行为研究, 提供有见地的机械信息。为此, 我们对大鼠的用水靶捕获系统 (称为甲基序列) 进行了调整, 可以评估整个大鼠基因组的 DNA 甲基化水平。大鼠设计有针对性的促进者、CpG 岛、海岛海岸和所有磁铁基因的富 GC 区域。
为实现大鼠实验平台, 雄性杜勒大鼠在3周内暴露于慢性变应激中, 采集血液标本进行基因组 DNA 提取。采用剪切、转接头、靶向富集、亚硫酸氢盐转化、多路复用等方法, 建立了大鼠 DNA 样品的甲基序列文库。在下一代测序平台上对库进行了排序, 并对测序读数进行了分析, 以确定压力和非重读大鼠 DNA 之间的 DMRs。采用亚硫酸氢盐磷酸测序对候选 DMRs 进行了独立验证, 以确认平台的鲁棒性。
结果表明, 大鼠甲基 Seq 平台是一种有用的表观遗传工具, 可捕获受应力影响的甲基化变化。
高通量测序的进展导致了模型和非模型生物体的大量基因组序列。这些序列的可用性促进了遗传学、比较基因组学和转录组学的研究。例如, 可用的基因组序列对于将序列数据与基于其与组蛋白修饰1或亚硫酸氢盐测序相结合的芯片 Seq 实验进行排列, 是非常有用的, 后者可测量 dna 甲基化未甲基化胞嘧啶2的亚硫酸氢盐转化形成的尿嘧啶检测。然而, 由于缺乏可影响基因功能的特定物种调控序列的注解数据, 在同道平台的实施中出现了延迟, 将可用的基因组测序数据纳入其设计中。
特别是, dna 甲基化是对 dna 的最广泛研究的表观遗传修饰之一, 可以利用可用的基因组数据构建 methylomic 平台。一个这样的例子是人类甲基化3的基于阵列的平台, 它已广泛应用于各种学科, 从肿瘤学到精神病学4,5。不幸的是, 与非人类动物模型相似的平台是稀缺的, 因为几乎没有广泛使用的平台在最初的设计中利用了基因组序列。
评估非人类动物模型 methylomic 景观的常用方法是降低亚硫酸氢盐测序 (RRBS)6。这种方法克服了全基因组亚硫酸氢盐测序的成本, 在提供全面的 methylomic 景观的同时, 在基因组的大基因贫乏区域中, 由于成本和有限的功能信息, 提供了较低的读深覆盖率2.RRBS 涉及限制消化和基因组 DNA 的大小选择, 以丰富高 GC 丰富的序列, 如 CpG 岛, 通常在基因促进者附近发现, 并认为在基因调控7中发挥作用。虽然 RRBS 方法已经在许多重要研究中得到了应用, 但它对限制性酶的依赖并不是没有显著的挑战和局限性。例如, RRBS 中富含 GC 的序列的富集完全依赖于由限制性酶识别的特定序列的存在和电泳后的大小选择。这意味着在选择大小时, 不包含这些限制站点的任何基因组区域都将被排除在外。此外, 跨物种比较是具有挑战性的, 除非相同的限制地点存在于不同物种之间相同的位置。
克服 RRBS 局限性的一种方法是使用在平台设计中利用已发布的基因组序列的富集方法。基于阵列的人类平台使用专为特定 CpGs 设计的引物探针, 用于在亚硫酸氢盐转化后进行靶向退火和底漆扩展。它的设计不仅反映了现有的人类基因组序列, 而且还体现了经过实验验证的监管区域从多行查询中获得, 例如编码和 ENSEMBL8。尽管在人类 methylomic 调查中广泛使用, 但模型动物并不存在类似的平台。此外, 基于阵列的格式在可用于探测放置的表面区域上放置了显著的约束。在过去的几年中, 我们已经努力将捕获探针设计所提供的目标特异性与下一代测序的高通量特性相结合。这种努力导致了基于序列的小鼠基因组 (小鼠甲基 Seq) 的靶向浓缩系统, 用于识别脑特异性或糖皮质激素诱导的甲基化9、10的差异。对于其他模型和非模型动物, 需要类似的平台来促进这些动物的同道研究。
在这里, 我们演示了这个新平台的实施, 对大鼠进行 methylomic 分析。鼠是药理学、代谢、神经内分泌学和行为的重要动物模型。例如, 越来越需要了解引起药物毒性、肥胖、压力反应或吸毒成瘾的潜在机制。能够捕获与这些条件相关的 methylomic 变化的高通量平台将增加我们对这些机制的理解。由于大鼠基因组仍缺乏对监管区域的注释, 我们将非冗余启动子、CpG 岛、海岛海岸11和以前确定的富 GC 序列纳入大鼠甲基 Seq 平台12。
为了评估成功的设计和实施用水目标浓缩 (一般称为甲基 Seq) 平台的大鼠基因组, 我们采用了大鼠慢性变应激 (CVS)13模型, 以确定差异甲基化不重读和强调动物之间的区域。我们的平台设计、协议和实施对于那些可能希望对基因组序列已经可用但仍未标注注释的有机体进行全面、无偏见的表观遗传学调查的调查人员可能很有用。
在本研究中, 我们设计并实现了大鼠基因组的甲基 Seq 平台。通过对大鼠应力模型的研究表明, 实验和分析管道可以在两个比较组之间提供不同的甲基化区域。
为了确保平台的成功实施, 需要遵守几个关键步骤。首先, 初始 DNA 质量和数量对最终的甲基序列库的质量和数量有显著的影响。我们使用荧光计, 而不是分光光度计, 以确保我们的 dna 测量反映了双链 dna 存在的数量。bioanalyzer 用于测量剪切后和适配器结扎后 DNA 的分子大小和数量。验证这些步骤之间的分子尺寸 “移位” 对于确认在后续步骤中将接受适配器介导的 PCR 的每个 DNA 片段的末端是否存在适配器至关重要。在适配器结扎步骤结束时剩余的 DNA 数量也很重要, 因为此步骤需要至少 100 ng 的库产品, 以确保在目标富集和亚硫酸氢盐转化步骤之后有足够数量。在构造的甲基 Seq 库上进行了最后的高灵敏度测量, 以便在下一代音序器上对库进行适当稀释以进行后续聚类。最后, 采用亚硫酸氢盐磷酸测序作为一种高定量、独立的方法来评估分析管道的精度。使用原始样本和使用其他动物进行复制的最终验证是确保实验能够检测 DNA 甲基化的生物显著变化的关键步骤。
我们还包括在偏离协议或遇到问题的情况下的若干准则。首先, 在末端修复、适配器结扎或磁珠纯化步骤中, 可能会丢失过多的 DNA。或者, 由于组织/DNA 的可用性有限或各种浓缩方法 (如荧光活化细胞分类) 的实施, DNA 的起始量可能小 (< 200 ng)。在两个库的放大步骤中增加循环数可能能够弥补整个图书馆建设协议中 dna 的过量损失或低起始 dna 量。但是, 建议不要超过一个额外的的, 因为过多的模板放大可能会导致序列化重复读取的数量增加。在对齐步骤中排除这些重复项, 以防止甲基化百分比计算中的偏差。其次, 如果平均 DNA 大小不增加超过 30 bps, 检查以确保试剂是新的, 因为 T4 DNA 聚合酶, 克列诺和/或 T4 连接可能是旧的。可使用市面上可用的替代试剂。
此外, 预测的 DMRs 可能无法通过磷酸测序验证, 其中 DNA 甲基化差异不存在或显著低于分析预测的。对候选区域的验证较差是许多基因组分析的一个非常普遍的问题, 例如当磷酸测序结果不确认差异甲基化或效果大小比分析预测的要小得多时。BSmooth 是一个分析包, “平滑” 在多个 CpGs 窗口的甲基化水平。对于目前的实验, BSmooth 牵连到一个 DMR, 其甲基化水平由亚硫酸氢盐磷酸测序验证。但是, BSmooth 和磷酸测序验证的甲基化水平之间可能存在差异。差异产生的平滑函数, 估计在一个 DMR 中的所有 CpGs 的平均甲基化值, 包括连续 CpGs, 可能不同的 DNA 甲基化超过50% 或 CpGs 其甲基化值被排除由于子阈值读取深度。R 封装 (如 MethylKit24 ) 可用于识别 CpGs 或甚至单个 CpGs 的较小窗口, 其甲基化水平与磷酸测序验证的那些更紧密相关。通过磷酸测序实现不同的包并测试其预测区域或 CpGs 差异甲基化, 将确保数据的鲁棒性。或者, 可以用原始的甲基 Seq 库, 并将其添加到读取文件中, 以增加读取深度。由于甲基化水平的测定是半定量的, 由读取次数 [(CpGs)/(TpGs + CpGs 的 #)] 决定, 增加给定 CpG 的读取深度将提高其甲基化值的准确度。在本研究中, 我们只考虑了 CpGs, 其甲基化值由至少十次读数确定, 并达到每个 CpG 的总读覆盖率19x。
大鼠甲基 Seq 平台是没有它的局限性。虽然它比全基因组亚硫酸氢盐测序更具成本效益, 但它比其他方法昂贵得多。然而, 大部分的成本是在音序器上购买车道, 而不是捕获系统。根据所需的读取深度, 在 DNA 甲基化中, 由于大 (25–70%) 差异12而需要较少的跨组织比较, 可以通过多路采样和使用更高容量的平台来减少成本。此外, 样品制备比其他方法更耗时。虽然类似于其他下拉方法, 包括下一代测序, 添加亚硫酸氢盐转化和纯化步骤增加工作负荷。总的来说, 甲基 Seq 平台是一种经济高效的替代全基因组测序的方法, 可提供超过 230万 CpGs 的基对分辨率, 比基于微阵列的平台所测定的多。到目前为止, 商业上可用的人类和小鼠甲基序列平台已经被用来记录在猕猴大脑中的酒精依赖性变化25,26, 神经发育基因在小鼠脑9和血脑糖皮质激素10的目标。此外, 无论通过限制性酶的顺序识别, 定位特定区域的能力都使其成为跨物种比较的理想平台。在这项研究中, 我们设计了大鼠的甲基 Seq 平台, 在没有基因组范围的 methylomic 工具的情况下, 进行了许多药理学、代谢和行为实验。我们的数据表明, 它可用于检测大鼠应力模型中的 DMRs, 并关联其他生理参数, 如整体血浆 CORT 水平。
甲基 Seq 平台是动物的表观遗传学实验的理想选择, 有序列的基因组, 可能没有足够的实验证据记录监管区域。当这些区域可用时, 其他区域可以自定义设计并附加到当前版本。此外, 该平台是比较基因组学的理想选择, 因为目标富集不受限制性酶识别的约束。例如, 任何兴趣基因的启动子区域都可以被捕获, 无论它是否有一个特定的限制站点。同样, 任何监管区域, 如在鼠标或人类中发现的, 在感兴趣的基因组中保存的, 都可以被捕获。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由 NIH 赠款 MH101392 (RSL) 资助, 并得到以下奖项和基金会的支持: NARSAD 年轻研究员奖, 玛格丽特 Ann 价格调查基金, 詹姆斯华情绪障碍学者基金通过查尔斯 t. 鲍尔基金会, 贝克基础和项目匹配基础 (RSL)。
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |