यहां, हम मिथाइल-Seq, एक epigenomic मंच के प्रोटोकॉल और कार्यांवयन का वर्णन करते हैं, जो पुराने तनाव के जोखिम से जुड़े epigenetic परिवर्तनों को पहचानने के लिए एक चूहे के मॉडल का उपयोग करते हैं । परिणाम प्रदर्शित करता है कि चूहे मिथाइल-Seq मंच मिथाइल मतभेद है कि चूहों में तनाव जोखिम से उत्पंन का पता लगाने में सक्षम है ।
जानवरों की एक व्यापक विविधता के जीनोम के रूप में उपलब्ध हो जाते हैं, इन जानवरों के मॉडल में गतिशील epigenetic परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं कि उपकरणों के लिए एक बढ़ती हुई जरूरत है. चूहा एक विशेष मॉडल जानवर है जहां एक epigenetic उपकरण कई औषधीय और व्यवहार अध्ययन के लिए व्यावहारिक यंत्रवत जानकारी प्रदान पूरक कर सकते हैं । इस छोर तक, हमने चूहे के लिए SureSelect टारगेट कैप्चर सिस्टम (मिथाइल-Seq के रूप में भेजा) अनुकूलित किया है, जो चूहे के जीनोम में डीएनए मिथाइल स्तर का आकलन कर सकता है । चूहा डिजाइन प्रमोटरों, CpG द्वीपों, द्वीप किनारे, और सभी RefSeq जीन से जीसी-अमीर क्षेत्रों को लक्षित ।
एक चूहे प्रयोग पर मंच को लागू करने के लिए, पुरुष Sprague Dawley चूहों 3 सप्ताह के लिए जीर्ण चर तनाव के संपर्क में थे, जिसके बाद रक्त के नमूने जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए । मिथाइल-Seq पुस्तकालयों का निर्माण चूहे के डीएनए नमूनों से बाल काटना, अनुकूलक बंधाव, लक्ष्य संवर्धन, bisulfite रूपांतरण, और division द्वारा किया गया था । पुस्तकालयों एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर अनुक्रम थे और अनुक्रम पढ़ता बल दिया और तनाव में चूहों के डीएनए के बीच DMRs की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया गया. मंच की मजबूती की पुष्टि के लिए bisulfite pyrosequencing द्वारा शीर्ष उम्मीदवार DMRs को स्वतंत्र रूप से मान्य किया गया ।
परिणाम प्रदर्शित करता है कि चूहे मिथाइल-Seq मंच एक उपयोगी epigenetic उपकरण है कि मिथाइल तनाव को जोखिम से प्रेरित परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं ।
उच्च प्रवाह अनुक्रमण में अग्रिम दोनों मॉडल और गैर मॉडल जीवों के लिए जीनोमिक दृश्यों का खजाना करने के लिए नेतृत्व किया है । ऐसे जुगाड़ की उपलब्धता ने आनुवंशिकी, तुलनात्मक जीनोमिक्स, और transcriptomics में अनुसंधान को सुगम बनाया है । उदाहरण के लिए, उपलब्ध जीनोमिक अनुक्रम हिस्टोन संशोधनों1, या bisulfite अनुक्रमण है, जो डीएनए मिथाइल द्वारा उपाय के साथ अपने सहयोग के आधार पर डीएनए को समृद्ध कि चिप Seq प्रयोगों से अनुक्रमण डेटा संरेखित करने के लिए अत्यधिक उपयोगी हैं unmethylated cytosines2के bisulfite रूपांतरण से गठित uracil का पता लगाना. हालांकि, वहां epigenomic प्लेटफार्मों के कार्यांवयन में देरी है कि प्रजातियों की व्याख्या डेटा की कमी के कारण उनके डिजाइन में उपलब्ध जीनोमिक अनुक्रमण डेटा शामिल विशेष विनियामक अनुक्रम है कि जीन समारोह को प्रभावित कर सकते हैं ।
विशेष रूप से, डीएनए मिथाइल डीएनए पर सबसे व्यापक रूप से अध्ययन epigenetic संशोधनों में से एक है कि एक methylomic मंच के निर्माण के लिए उपलब्ध जीनोमिक डेटा का लाभ उठाने कर सकते है । ऐसा ही एक उदाहरण है मानव methylome3के लिए एक सरणी आधारित मंच है, जो व्यापक रूप से ऑन्कोलॉजी से विभिन्न विषयों में मनोरोग4,5के लिए प्रयोग किया गया है. दुर्भाग्य से, गैर मानव पशु मॉडल के लिए इसी तरह के प्लेटफार्मों दुर्लभ हैं, के रूप में वहां वस्तुतः कोई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्लेटफार्मों कि उनके प्रारंभिक डिजाइन में जीनोमिक अनुक्रम का लाभ ले लिया है ।
गैर मानव पशु मॉडल के methylomic परिदृश्य का आकलन करने के लिए एक आम विधि कम प्रतिनिधित्व bisulfite अनुक्रमण (आरआरबी)6है । इस दृष्टिकोण पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण है कि, जबकि एक व्यापक methylomic परिदृश्य उपलब्ध कराने की लागत पर काबू पा, कम पढ़ने के लिए गहराई के बड़े जीन में लागत और सीमित कार्यात्मक जानकारी के कारण कवरेज प्रदान करता है 2 जीनोम के गरीब क्षेत्रों . आरआरबी शामिल प्रतिबंध डाइजेस्ट और आकार जीनोमिक डीएनए के चयन के लिए अत्यधिक GC-अमीर दृश्यों के लिए समृद्ध ऐसे CpG द्वीपों कि सामांयतः जीन प्रवर्तकों के पास पाया जाता है और जीन विनियमन7में एक भूमिका निभाने के लिए सोचा । जबकि आरआरबी विधि महत्वपूर्ण अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है, प्रतिबंध एंजाइमों पर अपनी निर्भरता उल्लेखनीय चुनौतियों और सीमाओं के बिना नहीं है । उदाहरण के लिए, आरआरबी में जीसी-रिच दृश्यों के संवर्धन ट्रो द्वारा प्रतिबंध एंजाइम और अनुवर्ती आकार चयन द्वारा मांयता प्राप्त विशिष्ट दृश्यों की उपस्थिति पर पूरी तरह से निर्भर है । इसका अर्थ यह है कि इन प्रतिबंध साइट्स नहीं हैं जो किसी भी जीनोमिक क्षेत्रों आकार चयन के दौरान शामिल नहीं हैं । इसके अलावा, पार प्रजातियों की तुलना चुनौती दे रहे है जब तक कि एक ही प्रतिबंध साइटों को विभिंन प्रजातियों के बीच एक ही loci में मौजूद हैं ।
आरआरबी की सीमाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण एक संवर्धन विधि है कि मंच के डिजाइन में प्रकाशित जीनोमिक अनुक्रम का लाभ लेता है का उपयोग करने के लिए है । सरणी आधारित मानव मंच प्राइमर जांच एलील के लिए विशिष्ट CpGs के खिलाफ डिजाइन विशिष्ट (bisulfite रूपांतरण के बाद तटरक्षक बनाम टीजी) लक्ष्य एनीलिंग और प्राइमर विस्तार का उपयोग करता है । इसकी डिजाइन न केवल उपलब्ध मानव जीनोमिक अनुक्रम को दर्शाता है, लेकिन प्रयोग-सत्यापित नियामक क्षेत्रों ऐसे सांकेतिक शब्दों में बदलना और8ENSEMBL के रूप में जांच की कई लाइनों से हासिल की । मानव methylomic जांच में अपने व्यापक उपयोग के बावजूद, एक समान मंच मॉडल जानवरों के लिए मौजूद नहीं है । इसके अलावा, सरणी-आधारित स्वरूप जांच प्लेसमेंट के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र पर महत्वपूर्ण प्रतिबंध रखता है । पिछले कई वर्षों में, लक्ष्य-विशेष कब्जा जांच डिजाइन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की उच्च प्रवाह सुविधा द्वारा afforded गठबंधन करने के लिए प्रयास किया गया है । इस तरह के एक प्रयास अनुक्रमण-आधारित लक्ष्य संवर्धन प्रणाली माउस जीनोम (माउस मिथाइल-Seq), जो मिथाइल9,10में मस्तिष्क विशिष्ट या glucocorticoid प्रेरित मतभेदों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के लिए हुई है । अन्य मॉडल और गैर मॉडल जानवरों के लिए इसी तरह के प्लेटफार्मों इन जानवरों में epigenomic अनुसंधान की सुविधा के लिए की जरूरत है ।
यहां, हम चूहे पर methylomic विश्लेषण का संचालन करने के लिए इस उपंयास मंच के कार्यांवयन का प्रदर्शन । चूहा औषध विज्ञान, चयापचय, neuroendocrinology, और व्यवहार में एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में सेवा की है । उदाहरण के लिए, वहां एक बढ़ाने के लिए अंतर्निहित तंत्र है कि दवा विषाक्तता, मोटापा, तनाव प्रतिक्रिया, या नशीली दवाओं की लत को जंम दे समझने की जरूरत है । एक उच्च प्रवाह इन स्थितियों के साथ जुड़े methylomic परिवर्तन पर कब्जा करने में सक्षम मंच तंत्र की हमारी समझ में वृद्धि होगी । के बाद से चूहा जीनोम अभी भी विनियामक क्षेत्रों के लिए एनोटेशन का अभाव है, हम गैर निरर्थक प्रमोटरों, CpG द्वीप, द्वीप किनारे11, और पहले से पहचान की गई GC-चूहे मिथाइल-Seq मंच12में अमीर दृश्यों को शामिल किया ।
SureSelect लक्ष्य संवर्धन के सफल डिजाइन और कार्यांवयन का आकलन करने के लिए (सामांय रूप से मिथाइल-Seq के रूप में संदर्भित) चूहा जीनोम के लिए मंच है, हम क्रोनिक चर तनाव (सीवी)13 के एक चूहे मॉडल कार्यरत को पहचान के लिए विभेदक methylated तनावग्रस्त और तनावग्रस्त पशुओं के बीच क्षेत्र । हमारे मंच डिजाइन, प्रोटोकॉल, और कार्यांवयन के जांचकर्ताओं जो एक जीव जिसका जीनोमिक अनुक्रम पहले से ही उपलब्ध है पर एक व्यापक और निष्पक्ष epigenetic जांच का संचालन करना चाहते हो सकता है के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन खराब व्याख्या बनी हुई है ।
इस अध्ययन में हमने चूहे के जीनोम के लिए मिथाइल-Seq प्लेटफॉर्म तैयार किया और उसे कार्यान्वित कर रहे हैं. तनाव का एक चूहा मॉडल के साथ अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन करके, हम प्रदर्शन किया है कि प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक पाइपलाइन दो तुलना समूहों के बीच विभेदक methylated क्षेत्रों प्रदान कर सकते हैं ।
मंच के एक सफल कार्यांवयन सुनिश्चित करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम को मनाया जाना चाहिए । पहला, प्रारंभिक डीएनए गुणवत्ता और मात्रा अंतिम मिथाइल-Seq पुस्तकालय की गुणवत्ता और मात्रा पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । हम एक fluorometer, बजाय एक spectrophotometer का इस्तेमाल किया, यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमारे डीएनए माप दोहरे असहाय डीएनए की मात्रा वर्तमान प्रतिबिंबित । के रूप में आणविक आकार और बाल काटना और एडाप्टर बंधाव के बाद के बाद डीएनए की मात्रा को मापने के लिए किया गया था विश्लेषक । इन चरणों के बीच आणविक आकार “shift” की पुष्टि करने के बाद चरणों में एडाप्टर मध्यस्थता पीसीआर से गुजरना होगा कि प्रत्येक डीएनए टुकड़ा के सिरों पर एडेप्टर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है. एडाप्टर बंधाव चरण के अंत में शेष डीएनए की मात्रा भी महत्वपूर्ण है, के बाद से कम से १०० पुस्तकालय उत्पाद के एनजी इस कदम पर की जरूरत है सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त मात्रा लक्ष्य संवर्धन और bisulfite रूपांतरण चरणों के बाद उपलब्ध है । पुस्तकालय को अगली पीढ़ी के sequencer पर बाद में clustering के लिए ठीक से पतला किया जा सकता है ताकि एक अंतिम उच्च संवेदनशीलता माप निर्मित मिथाइल-Seq पुस्तकालय पर किया गया था । अंत में, bisulfite pyrosequencing विश्लेषणात्मक पाइपलाइन की सटीकता का आकलन करने के लिए एक उच्च मात्रात्मक, स्वतंत्र विधि के रूप में नियोजित किया गया था । अंतिम सत्यापन का उपयोग कर मूल नमूनों और अतिरिक्त जानवरों का उपयोग कर प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है कि प्रयोग डीएनए मिथाइल में जैविक रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगा सकते हैं ।
हम भी प्रोटोकॉल से विचलन की स्थिति में कई दिशानिर्देश शामिल हैं या समस्याओं का सामना कर रहे हैं । सबसे पहले, यह अंत की मरंमत के दौरान बहुत अधिक डीएनए खोने के लिए संभव है, अनुकूलक बंधाव, या चुंबकीय मनका शुद्धि कदम । वैकल्पिक रूप से, डीएनए की मात्रा शुरू छोटे हो सकता है (< 200 एनजी) सीमित ऊतक/डीएनए की उपलब्धता या इस तरह के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई के रूप में विभिंन संवर्धन विधियों के कार्यांवयन के कारण । दो पुस्तकालय प्रवर्धन कदम के दौरान चक्र संख्या में वृद्धि के लिए पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल भर में डीएनए या कम शुरू डीएनए राशि के अत्यधिक नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने में सक्षम हो सकता है । हालांकि, नहीं एक अतिरिक्त 2 से अधिक-3 चक्र की सिफारिश कर रहे हैं, के रूप में अत्यधिक प्रवर्धन टेंपलेट डुप्लिकेट की संख्या में वृद्धि के लिए नेतृत्व की संभावना है अनुक्रम जा रहा है । इन डुप्लिकेट्स को प्रतिशत मिथाइल परिकलनों में पक्षपात को रोकने के लिए संरेखण चरण के दौरान छोड़ दिया जाता है । दूसरा, अगर औसत डीएनए आकार से अधिक 30 बीपीएस द्वारा वृद्धि नहीं करता है, यह सुनिश्चित करें कि रिएजेंटों नए हैं, के रूप में टी-4 डीएनए पोलीमरेज़, Klenow, और/ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रतिस्थापन एजेंट उपयोग किए जा सकते हैं ।
इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाया DMRs pyrosequencing द्वारा सत्यापित नहीं हो सकता है कि संभव है, जहां डीएनए मिथाइल मतभेद मौजूद नहीं है या विश्लेषण द्वारा भविष्यवाणी की तुलना में काफी कम हैं । उंमीदवार क्षेत्रों के गरीब मांयता कई जीनोम के लिए बहुत आम समस्या है व्यापक विश्लेषण, जैसे जब pyrosequencing परिणाम अंतर मिथाइल की पुष्टि नहीं करते है या प्रभाव का आकार है कि विश्लेषण के द्वारा भविष्यवाणी की तुलना में बहुत छोटा है । BSmooth एक विश्लेषणात्मक पैकेज है कि “चिकनी” एकाधिक CpGs की एक खिड़की के पार में मिथाइल का स्तर है । वर्तमान प्रयोग के लिए, BSmooth एक DMR जिसका मिथाइल स्तर bisulfite pyrosequencing द्वारा मांय किया गया फंसाया । हालांकि, वहां की संभावना BSmooth और pyrosequencing द्वारा सत्यापित उन द्वारा अनुमानित मिथाइल स्तर के बीच विसंगतियों होगा । विसंगतियों को स्मूथिंग फंक्शन से उत्पंन होता है जो एक DMR के भीतर CpGs के सभी भर में औसत मिथाइल मूल्यों का अनुमान लगाता है, जिसमें लगातार CpGs है जो डीएनए मिथाइल में ५०% से अधिक या CpGs से अलग हो सकती है जिनके कारण मिथाइल मूल्यों को छोड़ दिया गया था उप-थ्रेशोल्ड गहराई पढ़ें. आर-MethylKit24 के रूप में संकुल CpGs के छोटे खिड़कियों या यहां तक कि एकल CpGs जिनकी मिथाइल स्तर pyrosequencing द्वारा मांय उन लोगों के साथ सहसंबंधी बनाना पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिंन संकुल को लागू करने और उनके अनुमानित क्षेत्रों या pyrosequencing द्वारा अंतर मिथाइल के CpGs परीक्षण डेटा की मजबूती सुनिश्चित करेगा । वैकल्पिक रूप से, मूल मिथाइल-Seq लायब्रेरीज़ को पढ़ने और पढ़ने की गहराई बढ़ाने के लिए पढ़ी गई फ़ाइलों में जोड़ा जा सकता है । के बाद से मिथाइल स्तर के निर्धारण अर्द्ध मात्रात्मक और पढ़ता है की संख्या से तय कर रहे है [(# of CpGs)/(# of TpGs + CpGs)], एक दिया CpG के लिए पढ़ने की गहराई बढ़ाने के अपने प्रतिशत मिथाइल मूल्य की सटीकता में वृद्धि होगी । इस अध्ययन में, हम केवल CpGs जिसका मिथाइल मूल्यों को कम से निर्धारित किया गया था दस पढ़ता है और प्रत्येक CpG के लिए 19x की एक समग्र पढ़ें कवरेज हासिल की ।
चूहे मिथाइल-Seq प्लेटफॉर्म अपनी सीमाओं के बिना नहीं है । हालांकि यह पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण से अधिक लागत प्रभावी है, यह काफी अंय तरीकों की तुलना में अधिक महंगा है । फिर भी, लागत का सबसे sequencer पर गलियों की खरीद के लिए और कब्जा प्रणाली के लिए नहीं था । पर निर्भर करता है पढ़ें गहराई आवश्यक है, के साथ पार ऊतक तुलना की आवश्यकता कम बड़ी के कारण (25-70%) मतभेद12 डीएनए मिथाइल में, लागत प्रति लेन और अधिक नमूनों को मल्टीप्लेक्स द्वारा कम किया जा सकता है और एक उच्च क्षमता मंच का उपयोग कर । इसके अलावा, नमूना तैयारी अन्य तरीकों की तुलना में अधिक समय लेने वाली है. जबकि अन्य pulldown दृष्टिकोण है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण शामिल करने के लिए समान, जोड़ा bisulfite रूपांतरण और शुद्धि चरणों कार्य लोड करने के लिए जोड़ें. कुल मिलाकर, मिथाइल-Seq मंच पूरे जीनोम अनुक्रमण करने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है और अधिक से अधिक २,३००,००० CpGs, जो microarray आधारित प्लेटफार्मों द्वारा परख उन से काफी अधिक है पर आधार जोड़ी संकल्प प्रदान करता है । तारीख करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव और माउस मिथाइल-Seq प्लेटफार्मों को समूल मस्तिष्क में25,26, माउस ब्रेन9में neurodevelopmental जीन, और रक्त-मस्तिष्क में अल्कोहल पर निर्भर परिवर्तन दस्तावेज़ का इस्तेमाल किया गया है ग्लुकोकोर्तिकोइद का लक्ष्य10. इसके अलावा, प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा अनुक्रम मांयता की परवाह किए बिना विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने की क्षमता यह पार प्रजातियों की तुलना के लिए एक आदर्श मंच बनाता है । इस अध्ययन के लिए, हमने चूहे के लिए मिथाइल-Seq प्लेटफ़ॉर्म तैयार किया है, जिसके लिए जीनोम-वाइड methylomic टूल के लाभ के बिना कई औषधीय, चयापचयी और व्यवहारिक प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाता है । हमारे डेटा बताते है कि यह तनाव का एक चूहा मॉडल में DMRs का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ऐसे समग्र प्लाज्मा कोर्ट के स्तर के रूप में अंय शारीरिक मानकों को संबद्ध ।
मिथाइल-Seq प्लेटफार्म उन अनुक्रमित जीनोम के साथ पशुओं में epigenetic प्रयोगों के लिए आदर्श है जिनके पास नियामकीय क्षेत्रों का दस्तावेजीकरण पर्याप्त प्रायोगिक प्रमाण नहीं है । जब ऐसे क्षेत्र उपलब्ध कराए जाते हैं, तो अतिरिक्त क्षेत्र कस्टम-डिज़ाइन और वर्तमान संस्करण से अनुलग्न हो सकते हैं । इसके अलावा, मंच तुलनात्मक जीनोमिक्स के लिए आदर्श है, के बाद से लक्ष्य संवर्धन प्रतिबंध एंजाइम मांयता द्वारा विवश नहीं है । उदाहरण के लिए, किसी भी जीन के प्रवर्तक क्षेत्र के हित की परवाह किए बिना कब्जा किया जा सकता है कि क्या यह एक विशिष्ट प्रतिबंध साइट बंदरगाह । इसी तरह, किसी भी नियामक क्षेत्रों, जैसे माउस या मानव में पहचाने गए, जो ब्याज के जीनोम में संरक्षित कर रहे है पर कब्जा किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन NIH ग्रांट MH101392 (RSL) और निंनलिखित पुरस्कार और नींव से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया: एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार, मार्गरेट ऐन कीमत अन्वेषक कोष, जेंस वाह मूड विकारों विद्वान कोष के माध्यम से चार्ल्स टी. Bauer फाउंडेशन, बेकर फाउंडेशन, और परियोजना मैच फाउंडेशन (RSL) ।
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |