Vi beskriver här, protokoll och genomförandet av metyl-Seq, en epigenetisk plattform, använda en råtta modell för att identifiera epigenetiska förändringar i samband med kronisk stress exponering. Resultaten visar att råtta metyl-Seq plattformen kan upptäcka metylering skillnader som uppstår från stress exponering hos råttor.
Som genomen hos en större mängd djur blir tillgängliga, finns det ett ökande behov av verktyg som kan fånga dynamiska epigenetiska förändringar i dessa djurmodeller. Råttan är en viss modell djur där en epigenetisk verktyg kan komplettera många farmakologiska och beteendevetenskapliga studier att ge insiktsfulla mekanistiska information. I detta syfte anpassat vi SureSelect Target Capture-systemet (kallad metyl-Seq) för råtta, som kan bedöma DNA metylering nivåer över råtta genomet. Rat design riktade initiativtagare, CpG öar, ön stränder och GC-rika regioner från alla RefSeq gener.
För att implementera plattformen på en råtta experiment, utsattes manliga Sprague Dawley-råttor för kronisk variabeln stress för 3 veckor, varefter blodprover samlades för genomisk DNA-extraktion. Metyl-Seq bibliotek konstruerades råtta DNA prover av klippning, adapter ligatur, target anrikning, bisulfite konvertering och multiplexing. Biblioteken var sekvenserade i en nästa generations sekvensering plattform och den sequenced läser analyserades för att identifiera Jespers mellan DNA av betonade och obetonade råttor. Toppkandidat Jespers validerades självständigt av bisulfite pyrosekvensering bekräfta robustheten av plattformen.
Resultaten visar att råtta metyl-Seq plattformen är en användbar epigenetiska verktyg som kan fånga metylering förändringar orsakade av exponering betona.
Framsteg i hög genomströmning sekvensering har lett till en uppsjö av genomsekvenser både modell och icke-modellorganismer. Tillgången till sådana sekvenser har underlättat forskning i genetik, komparativ genomik och transkriptomik. Exempelvis tillgängliga genomsekvenser är mycket användbart för att anpassa sekvensering data från ChIP-Seq experiment som berikar DNA baserat på associationen med Histon ändringar1eller bisulfite sekvensering, som mäter DNA-metylering av att upptäcka uracil bildas från bisulfite omvandling av unmethylated cytosin2. Dock har förekommit förseningar i genomförandet av epigenetisk plattformar som införlivar tillgängliga genomisk sekvensering data i deras design på grund av kommenterad data av artspecifika reglerande sekvenser som kan påverka geners funktion.
I synnerhet är DNA-metylering en av de mest studerade epigenetiska förändringar på DNA som kan utnyttja tillgängliga genomisk data för att bygga en methylomic plattform. Ett sådant exempel är en array-baserad plattform för mänskliga methylome3, som allmänt har använts i olika discipliner från onkologi till psykiatrin4,5. Tyvärr, liknande plattformar för icke-mänskliga djurmodeller är knappa, som det finns praktiskt taget ingen utbredda plattformar som har dragit nytta av genomiska sekvensen i sin ursprungliga design.
En vanlig metod att bedöma methylomic landskap av icke-mänskliga djurmodeller är minskad representation bisulfite sekvensering (RRBS)6. Detta tillvägagångssätt övervinner kostnaden för helgenom-bisulfite sekvensering som, samtidigt som den ger en omfattande methylomic landskap, ger lägre Läs-djup täckning på grund av kostnaden och begränsad funktionell information i stora gen-fattiga områden av genomet2 . RRBS innebär begränsning digest och storlek-urval av genomisk DNA för att berika för mycket GC-rika sekvenser såsom CpG öar som vanligen hittas nära gen promotorer och tros spela en roll i gen förordning7. Medan den RRBS metoden har använts i ett antal viktiga studier, är beroendet av restriktionsenzym inte utan betydande utmaningar och begränsningar. Anrikning av GC-rika sekvenser i RRBS är exempelvis helt beroende av förekomsten av specifika sekvenser igen av restriktionsenzym och efterföljande storlek urval av elektrofores. Detta innebär att någon genomisk områden som inte innehåller dessa begränsning platser undantas vid val av storlek. Cross-arter jämförelser utmanar också, om inte samma begränsning platser finns i de samma loci bland olika arter.
En strategi för att övervinna begränsningarna av RRBS är att använda en anrikning metod som utnyttjar publicerade genomiska sekvensen i utformningen av plattformen. Arraybaserade mänskliga plattformen använder primer sonder utformad mot specifika CpGs för allel-specifika (CG vs. TG efter bisulfite konvertering) målet glödgning och primer filändelsen. Dess design speglar inte bara den tillgängliga mänskliga genomiska sekvensen, men experimentellt verifierade regulatoriska regioner förvärvats från flera rader för bevisupptagning, såsom koda och HÄCKNING8. Trots dess omfattande användning i mänskliga methylomic utredningar finns inte en liknande plattform för modell djur. Dessutom förlägger formatet array-baserade betydande konkurrenstryck på yta som är tillgänglig för sonden placering. I flera år, har man gjort ansträngningar för att kombinera mål-specificitet ges av capture sonden designen och funktionen hög genomströmning av nästa generations sekvensering. En sådan strävan har resulterat i sekvensering-baserade anrikning målsystemet för mus genomet (mus metyl-Seq), som användes för att identifiera hjärnan-specifika eller glukokortikoidinducerad skillnader i metylering9,10. Liknande plattformar för andra modell och icke-modell djur behövs för att underlätta epigenetisk forskning hos dessa djur.
Här visar vi genomförandet av denna nya plattform för att genomföra methylomic analys på råtta. Råttan har fungerat som en viktig djurmodell i farmakologi, metabolism, neuroendokrinologi och beteende. Exempelvis finns det ett ökande behov av att förstå de underliggande mekanismer som ger upphov till drug toxicitet, fetma, stress svar eller narkotikamissbruk. En hög genomströmning plattform kan fånga methylomic förändringar i samband med dessa villkor skulle öka vår förståelse av mekanismerna. Eftersom råtta genomet saknar fortfarande anteckning för regulatoriska regioner, vi införlivas icke-redundant initiativtagare, CpG öar, ön shores11och tidigare identifierat GC-rika sekvenser i råtta metyl-Seq plattform12.
För att bedöma framgångsrik design och implementering av SureSelect mål anrikning (allmänt kallad metyl-Seq) plattformen för råtta genomet, anställt vi en råtta modell av kronisk variabeln stress (CVS)13 att identifiera differentially metylerade regioner mellan obetonade och stressade djur. Vår plattform design, protokoll och genomförandet kan vara användbart för utredare som kanske vill göra en omfattande och förutsättningslös epigenetiska utredning på en organism vars genomiska sekvensen finns redan men är fortfarande dåligt kommenterade.
I denna studie vi utformas och genomförs metyl-Seq plattformen för råtta genomet. Genom att visa dess nytta med en råtta modell av stress, visat vi att rörledningen experimentella och analytiska kan ge differentially metylerade regioner mellan två jämförelsegrupper.
För att säkerställa ett framgångsrikt genomförande av plattformen, behöver flera kritiska steg observeras. Första, inledande DNA kvalitet och kvantitet har en betydande inverkan på kvaliteten och kvantiteten av det slutliga metyl-Seq-biblioteket. Vi använde en fluorometer, snarare än en spektrofotometer, för att säkerställa att vår DNA mätning återspeglas kvantiteten av dubbelsträngat DNA närvarande. Bioanalyzer användes för att mäta molekylär storlek och mängden DNA efter klippning och efter adapter ligering. Verifiera den molekylära storleken ”shift” mellan stegen är avgörande för att bekräfta förekomsten av adaptrar i ändarna av varje DNA-fragment som kommer att genomgå adapter-medierad PCR i efterföljande steg. Mängden DNA kvar i slutet av steget adapter ligatur är också viktigt, eftersom minst 100 ng av produktens bibliotek behövs i detta steg att säkerställa tillräcklig mängd finns efter målet anrikning och bisulfite konverteringen stegen. En sista högkänslig mätning utfördes på Byggyta metyl-Seq biblioteket så att biblioteket kan spädas ordentligt för efterföljande klustring på nästa generations sequencer. Slutligen var bisulfite pyrosekvensering anställd som en mycket-kvantitativa, oberoende metod att bedöma riktigheten av rörledningen analytisk. Den slutliga validering med den ursprungliga prover och replikering med ytterligare djur är avgörande steg för att säkerställa att experimentet kan detektera biologiskt signifikanta förändringar i DNA-metylering.
Vi har även flera riktlinjer vid avvikelse från protokollet eller om problem påträffas. Först, är det möjligt att förlora alltför mycket DNA under slutet-reparation, adapter ligatur eller magnetiska pärla reningssteg. Alternativt starta mängder DNA kan vara liten (< 200 ng) på grund av begränsad vävnad/DNA tillgänglighet eller genomförandet av olika anrikningsmetoder såsom fluorescens aktiverad cell sortering. Ökande antalet cykel under två bibliotek förstärkning stegen kanske kunna kompensera för överdriven förlusten av DNA eller låg DNA utgångsbeloppet i hela biblioteket konstruktion protokollet. Dock rekommenderas inte mer än ytterligare 2 – 3 cykler, eftersom överdriven mall förstärkning är sannolikt att leda till en ökning av antalet duplicerade läsningar är sekvenserade. Dessa dubbletter är undantagna under justering steg att förhindra partiskhet i procent metylering beräkningar. För det andra, om den genomsnittliga DNA-storleken inte ökar med mer än 30 bps, kontrollera att reagenserna är nya, som T4 DNA-polymeras, Klenow eller T4 ligase kan vara gammal. Kommersiellt tillgängliga byte reagenser kan användas.
Dessutom är det möjligt att de förutspådda Jespers inte kan validera genom pyrosequencing, där DNA metylering skillnader existerar inte eller är betydligt mindre än de förutspådde genom analys. Stackars validering av kandidat regioner är ett problem som är alltför vanligt för många genome-wide analyser, till exempel när pyrosekvensering resultat bekräftar inte differentiell metylering eller effekt storlek är mycket mindre än vad som förutspåddes av analysen. BSmooth är ett analyspaket som ”slätar ut” metylering nivåer över ett fönster av flera CpGs. För aktuella experimentet inblandad BSmooth en DMR vars metylering nivåer validerades av bisulfite pyrosequencing. Dock kommer det sannolikt att avvikelser mellan metylering nivåer förutsägs av BSmooth och de kontrolleras av pyrosekvensering. Skillnaderna uppstår från den utjämnande funktion som uppskattar de genomsnittliga metylering värdena över alla CpGs inom en DMR, inklusive konsekutiva CpGs som kan skilja sig i DNA-metylering av mer än 50% eller CpGs vars metylering värden exkluderades på grund sub tröskel Läs djup. R-paket såsom MethylKit24 kan användas för att identifiera mindre fönster CpGs eller ens enda CpGs vars metylering nivåer korrelerar starkt med de validerade genom pyrosequencing. Genomföra olika paket och testa deras förväntade regioner eller CpGs av differentiell metylering av pyrosekvensering kommer att säkerställa robustheten hos data. Alternativt, ursprungliga metyl-Seq bibliotek kan vara resequenced och tillsätts Läs filerna att öka Läs djup. Eftersom fastställandet av metylering nivåer är semikvantitativt och dikterade av antalet läsningar [(# of CpGs) / (# av TpGs + CpGs)], öka Läs djupet för en given CpG kommer att öka noggrannheten i dess procent metylering värde. I denna studie ansåg vi endast CpGs vars metylering värden bestämdes av minst tio läsningar och uppnådde en övergripande Läs täckning av 19 x för varje CpG.
Rat metyl-Seq plattformen är inte utan sina begränsningar. Det är mer kostnadseffektivt än helgenom-bisulfite sekvensering, är det betydligt dyrare än andra metoder. Ändå var merparten av kostnaden för att köpa körfält på sequencer och inte för capture-systemet. Beroende på Läs djupet behövs med cross-vävnad jämförelser som kräver mindre på grund av stora (25-70%) skillnader12 i DNA-metylering, kan kostnaderna minskas genom multiplexing fler prover per körfält och använda en högre kapacitet plattform. Provberedningen är också mer tidskrävande än andra metoder. Samtidigt som liknar andra pulldown tillvägagångssätt som innehåller nästa generations sekvensering, lägga extra bisulfite konvertering och rening stegen till arbetsbördan. Övergripande, metyl-Seq plattformen är ett kostnadseffektivt alternativ till helgenom-sekvensering och ger baspar upplösning på mer än 2,3 miljoner CpGs, vilket är betydligt mer än de analyseras av microarray-baserade plattformar. Hittills, de kommersiellt tillgängliga mänskliga och mus har metyl-Seq plattformar använts för att dokumentera alkohol-anhörig ändringar i den makak hjärna25,26, utvecklingsrelaterade gener i mus hjärnan9och blod-hjärn mål av glukokortikoider10. Vidare är gör förmågan att rikta specifika regioner oberoende sekvens erkännande av restriktionsenzym det en idealisk plattform för cross-arter jämförelser. För denna studie utformat vi metyl-Seq plattformen för råtta, som många farmakologiska, metaboliska och beteendemässiga experiment utförs utan förmånen av en genome-wide methylomic verktyg. Våra data visar att det kan användas för att upptäcka Jespers i en råtta modell av stress och andra fysiologiska parametrar såsom totala plasmanivåerna CORT.
Metyl-Seq plattformen är idealisk för epigenetiska experiment på djur med sekvenserat genomet som inte kanske har tillräckligt experimentella bevis som dokumenterar regulatoriska regioner. När sådana regioner görs tillgänglig, kan ytterligare regioner vara skräddarsydda och kopplade till den aktuella versionen. Plattformen är dessutom idealisk för komparativ genomik, eftersom målet berikning inte begränsas av restriktionsenzym erkännande. Exempelvis kan Arrangören regionen någon gen av intresse fångas oavsett om det hamnar en specifik begränsning webbplats. På samma sätt kan eventuella regulatoriska regioner, såsom de som identifierats i musen eller människor, som är bevarad i genomet av intresse fångas.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har finansierats av NIH grant MH101392 (RSL) och stöd från följande utmärkelser och stiftelser: en publicerade Young Investigator Award, Margaret Ann pris utredare fonden, James Wah humör störningar Scholar fonden via the Charles T. Bauer Foundation, Baker Stiftelsen och stiftelsen Project Match (RSL).
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |