Aqui, descrevemos o protocolo e a implementação de metil-Seq, uma plataforma de epigenomic, usando um modelo do rato para identificar alterações epigenéticas associadas com exposição de estresse crônico. Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq rato é capaz de detectar diferenças de metilação que surgem a partir da exposição de estresse em ratos.
Como genomas de uma ampla variedade de animais se tornam disponíveis, há uma crescente necessidade de ferramentas que pode capturar alterações epigenéticas dinâmicas nestes modelos animais. O rato é um animal de modelo específico, onde uma ferramenta epigenética pode complementar muitos estudos farmacológicos e comportamentais para fornecer informação esclarecedora mecanicista. Para este fim, adaptamos o SureSelect capturar sistema alvo (referido como metil-Seq) para o rato, que pode avaliar os níveis de metilação do DNA através do genoma do rato. O design do rato alvo promotores, consoles de CpG, margens da ilha e regiões de GC-ricos de todos os genes RefSeq.
Para implementar a plataforma em um experimento de rato, ratos Sprague Dawley masculinos foram expostos ao estresse crônico de variável por 3 semanas, após o qual foram colhidas amostras de sangue para extração de DNA genômica. Metil-Seq bibliotecas foram construídas a partir das amostras de DNA de rato por cisalhamento, ligadura de adaptador, enriquecimento de alvo, conversão de bissulfito e multiplexação. As bibliotecas foram sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de última geração e as leituras sequenciais foram analisadas para identificar DMRs entre DNA de ratos estressados e átonos. DMRs candidato independente foram validadas por bissulfito pyrosequencing confirmar a robustez da plataforma.
Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq de rato é uma útil ferramenta epigenética que pode capturar as alterações de metilação induzidas pela exposição ao estresse.
Avanços no sequenciamento do elevado-throughput conduziram a uma riqueza de sequências genomic para modelo e organismos não-modelo. A disponibilidade de tais sequências facilitou a investigação em genética e genómica comparativa transcriptomics. Por exemplo, sequências genômicas disponíveis são altamente úteis para o alinhamento de dados de sequenciamento de ChIP-Seq experimentos que enriquecem o DNA com base em sua associação com modificações de histona1ou sequenciamento de bissulfito, que mede a metilação do DNA por detecção de uracil formado a partir de conversão de bissulfito de citosinas unmethylated2. No entanto, tem havido atrasos na implementação de plataformas de epigenomic que incorporam dados de sequenciamento genômico disponíveis na sua concepção, devido à falta de dados anotados de sequências reguladoras específicas que podem influenciar a função dos genes.
Em particular, metilação do DNA é uma das mais amplamente estudadas modificações epigenéticas no DNA que pode alavancar dados genômicos disponíveis para a construção de uma plataforma de methylomic. Um exemplo é uma plataforma baseada em array para o methylome humano3, que tem sido amplamente utilizado em diversas disciplinas de Oncologia a psiquiatria4,5. Infelizmente, plataformas semelhantes para modelos animais não-humanos são escassas, como não há praticamente nenhuma plataforma amplamente utilizado que aproveitou a sequência genômica em seu projeto inicial.
Um método comum para apreciar a paisagem de methylomic de modelos de animais não-humanos é reduzida representação bissulfito sequenciamento (RRBS)6. Esta abordagem supera o custo do sequenciamento do genoma inteiro bissulfito que, proporcionando uma paisagem de methylomic abrangente, fornece cobertura de leitura-profundidade inferior devido ao custo e informação funcional limitada em grandes áreas pobres em genes do genoma2 . RRBS envolve restrição digest e seleção de tamanho de DNA genômico de enriquecer para altamente rico em GC sequências como consoles de CpG que são comumente encontrados perto de promotores de genes e pensados para jogar um papel no gene Regulamento7. Enquanto o método RRBS tem sido usado em um número de importantes estudos, sua dependência de enzimas de restrição não é sem limitações e desafios notáveis. Por exemplo, o enriquecimento de sequências de GC-ricos em RRBS é totalmente dependente da presença de sequências específicas, reconhecida pela enzima de restrição e seleção de tamanho subsequente por eletroforese. Isto significa que quaisquer áreas genômicas que não contêm esses sites de restrição são excluídas durante a seleção do tamanho. Além disso, comparações entre espécies estão desafiando a menos que nos mesmos sítios de restrição estão presentes no mesmos Locus entre as diferentes espécies.
Uma abordagem para superar as limitações do RRBS é usar um método de enriquecimento que tira proveito da sequência genômica publicado no design da plataforma. A plataforma humana baseada em matriz usa sondas cartilha projetadas contra CpGs específico para alelo-específico (CG vs TG após a conversão de bissulfito) alvo recozimento e primer a extensão. Seu design reflete não só a sequência genômica humana disponível, mas regiões reguladoras verificados experimentalmente adquiridas de várias linhas de investigação, tais como ENCODE e ENSEMBL8. Apesar de sua ampla utilização em investigações de methylomic humana, uma plataforma semelhante não existe para os animais de modelo. Além disso, o formato baseado em matriz coloca restrição significativa na área da superfície disponível para a colocação da sonda. Nos últimos anos, têm-se esforços para combinar a alvo-especificidade conferida pela captura sonda design e o recurso de alta produtividade da próxima geração de sequenciamento. Tal um esforço resultou no sistema alvo baseada no sequenciamento de enriquecimento para o genoma do rato (mouse de metil-Seq), que foi usado para identificar diferenças específicas do cérebro ou induzida por glicocorticoide na metilação9,10. Plataformas semelhantes para outros modelo e não do modelo animais são necessários para facilitar a pesquisa de epigenomic nesses animais.
Aqui, demonstramos a implementação desta novela plataforma para realizar análise de methylomic no rato. O rato tem servido como um importante modelo animal em farmacologia, metabolismo, Neuroendocrinologia e comportamento. Por exemplo, há uma crescente necessidade de compreender os mecanismos subjacentes que dão origem a toxicidade de drogas, obesidade, estresse ou toxicodependência. Uma plataforma de alta produtividade capaz de captar mudanças methylomic associadas a essas condições iria aumentar a nossa compreensão dos mecanismos. Uma vez que o genoma do rato ainda carece de anotação para regiões reguladoras, nós incorporado promotores não-redundante, consoles de CpG, ilha margens11e identificado previamente sequências GC-rico no rato metil-Seq plataforma12.
Para avaliar o projeto bem sucedido e implementação da plataforma de SureSelect alvo enriquecimento (genericamente referido como metil-Seq) para o genoma do rato, utilizamos um modelo do rato de estresse crônico variável (CVS)13 para identificar diferencialmente metilados regiões entre animais átonas e tônicas. Nosso projeto da plataforma, protocolo e implementação podem ser útil para os investigadores que queiram conduzir uma investigação epigenética abrangente e imparcial sobre um organismo cuja sequência genômica já está disponível, mas continua a ser mal anotado.
Neste estudo, nós concebido e implementado a plataforma de metil-Seq para o genoma do rato. Demonstrando sua utilidade com um modelo do rato de stress, demonstrámos que o pipeline experimental e analítico pode fornecer diferencialmente metiladas regiões entre dois grupos de comparação.
Para garantir uma implementação bem-sucedida da plataforma, várias etapas críticas precisam ser observados. Primeiro, inicial, quantidade e qualidade do DNA tem um impacto significativo sobre a qualidade e quantidade da biblioteca de metil-Seq final. Usamos um dados, ao invés de um espectrofotômetro, para garantir que nossa medida de DNA reflete a quantidade de DNA de cadeia dupla presente. O bioanalyzer foi usado para medir o tamanho molecular e a quantidade de DNA após o corte e após ligadura do adaptador. Verificar o tamanho molecular “mudança” entre estas etapas é crucial para confirmar a presença de adaptadores nas extremidades de cada fragmento de DNA que passará por PCR mediada por adaptador nas etapas subsequentes. A quantidade de DNA restante no final da etapa de ligadura adaptador também é importante, desde pelo menos 100 ng do produto biblioteca é necessário nesta etapa para assegurar quantidade suficiente disponível após as etapas de conversão de enriquecimento e bissulfito de alvo. Uma medição de alta sensibilidade a final foi realizada na biblioteca de metil-Seq construída para que a biblioteca pode ser devidamente diluída para clustering subsequentes sobre o sequenciador de última geração. Finalmente, bissulfito pyrosequencing foi empregado como um método altamente quantitativa, independente para avaliar a precisão do pipeline analítica. A validação final usando as amostras originais e replicação usando animais adicionais são etapas cruciais para garantir que a experiência pode detectar mudanças biologicamente significativas na metilação do DNA.
Nós também incluímos várias orientações no caso de desvio de protocolo ou se problemas são encontrados. Primeiro, é possível perder muito DNA durante o fim-reparação, ligadura de adaptador ou etapas de purificação magnética do grânulo. Alternativamente, a partir de quantidades de DNA pode ser pequena (< 200 ng) devido à disponibilidade limitada de tecido/DNA ou a aplicação de diferentes métodos de enriquecimento como fluorescência ativada celular classificação. Aumentando o número de ciclo durante as etapas de amplificação de dois biblioteca pode ser capaz de compensar a perda excessiva de DNA ou baixa quantidade de DNA em todo o protocolo de construção de biblioteca a começar. No entanto, não mais do que um adicional 2 – 3 ciclos são recomendados, como amplificação excessiva modelo é susceptível de conduzir a um aumento no número de leituras duplicados sendo sequenciado. Estas duplicatas são excluídas durante a etapa de alinhamento para evitar viés nos cálculos da porcentagem de metilação. Em segundo lugar, se o tamanho médio de DNA não aumenta por mais de 30 bps, verifique se que os reagentes são novos, como T4 DNA polimerase, Klenow e/ou T4 ligase pode ser velho. Reagentes de substituição disponível comercialmente podem ser usados.
Além disso, é possível que a predita DMRs não podem validar por pyrosequencing, onde as diferenças de metilação de DNA não existem ou são significativamente menos do que aqueles preditos pela análise. Validação de pobre das regiões do candidato é um problema muito comum para muitas análises de todo o genoma, tais como quando pyrosequencing resultados não confirmam a metilação diferencial ou o tamanho do efeito é muito menor do que o previsto pela análise. BSmooth é um pacote analítico que os níveis de metilação “suaviza” através de uma janela de múltiplos CpGs. Para a experiência atual, BSmooth implicado um DMR cujos níveis de metilação foram validados pela pyrosequencing bissulfito. No entanto, provavelmente haverá discrepâncias entre os níveis de metilação preditos por BSmooth e aqueles verificados por pyrosequencing. As discrepâncias surgem a partir da função de suavização que estima os valores médios de metilação através de todas as CpGs dentro um DMR, incluindo consecutivos CpGs que podem diferir na metilação do DNA por mais de 50% ou CpGs cujos valores de metilação foram excluídos devido a limite de sub leitura de profundidade. R-pacotes como MethylKit24 podem ser usados para identificar janelas menores de CpGs ou mesmo única CpGs cujos níveis de metilação correlacionam fortemente com aqueles validados pelo pyrosequencing. Implementação de pacotes diferentes e testando suas regiões previstas ou CpGs de metilação diferencial por pyrosequencing garantem robustez dos dados. Alternativamente, bibliotecas de metil-Seq originais podem ser reordenadas e adicionadas aos arquivos de leitura para aumentar a profundidade de leitura. Desde que a determinação dos níveis de metilação são semi-quantitativa e ditada pelo número de leituras [(# of CpGs) / (n º de TpGs + CpGs)], aumento da profundidade de leitura para um determinado CpG aumentará a precisão do seu valor percentual de metilação. Neste estudo, consideramos apenas CpGs cujos valores de metilação foram determinados pelo menos dez leituras e alcançado uma cobertura global de leitura de 19 x para cada CpG.
A plataforma de metil-Seq de rato não é sem suas limitações. Enquanto é mais rentável do que o sequenciamento do genoma inteiro bissulfito, é consideravelmente mais caro do que outros métodos. No entanto, a maioria do custo foi para adquirir pistas sobre o sequencer e não para o sistema de captura. Dependendo da profundidade de leitura necessária, com comparações de cruz-tecido que exigem menos devido a diferenças de grande (25% a 70%)12 na metilação do DNA, o custo pode ser reduzido por multiplexação mais amostras por raia e usando uma plataforma de maior capacidade. Além disso, a preparação da amostra é mais demorada do que outros métodos. Embora semelhante a outras abordagens de pulldown que incorporam o sequenciamento de nova geração, as etapas de conversão e purificação de bissulfito adicionado adicionem à carga de trabalho. Em geral, a plataforma de metil-Seq é uma alternativa econômica para o sequenciamento do genoma inteiro e fornece resolução de pares de base em mais de 2,3 milhões de CpGs, que é consideravelmente mais do que aqueles analisada por plataformas microarray. Até à data, os humanos comercialmente disponíveis e mouse metil-Seq plataformas têm sido usadas para documentar as alterações dependentes de álcool no cérebro de macaco25,26, desenvolvimento neurológico genes no cérebro de rato9e sangue-cérebro alvos de glicocorticoides10. Além disso, a capacidade de direcionar a regiões específicas, independentemente do reconhecimento de sequência por enzimas de restrição torna uma plataforma ideal para comparações entre espécies. Para este estudo, nós projetamos a plataforma de metil-Seq para o rato, para o qual muitas experiências farmacológicas, metabólicas e comportamentais são executadas sem o benefício de uma ferramenta de methylomic de todo o genoma. Nossos dados mostram que ele pode ser usado para detectar DMRs em um modelo do rato de stress e correlacionados outros parâmetros fisiológicos, tais como níveis de plasma global CORT.
A plataforma de metil-Seq é ideal para epigenéticos experimentos em animais com genomas sequenciados que podem não ter suficiente evidência experimental documentando regiões reguladoras. Quando tais regiões são disponibilizadas, regiões adicionais podem ser personalizados e anexadas à versão atual. Além disso, a plataforma é ideal para genómica comparativa, uma vez que o enriquecimento de destino não é restringido por reconhecimento de enzima de restrição. Por exemplo, a região promotora de qualquer gene de interesse pode ser capturada independentemente se ele abriga um sítio de restrição específica. Da mesma forma, qualquer regiões reguladoras, tais como aquelas identificadas no mouse ou seres humanos, que são conservados no genoma de interesse podem ser capturados.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pelo NIH grant MH101392 (RSL) e apoio dos seguintes prêmios e fundações: um NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann preço investigador Fund, fundo de estudioso de James Wah humor distúrbios através do Charles T. Bauer Foundation, Baker Fundação e a Fundação de partida do projeto (RSL).
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |