Her beskriver vi protokollen og implementering av Methyl-Seq, en epigenomic plattform, med en rotte modell for å identifisere epigenetic endringer forbundet med kronisk stress eksponering. Resultatene viser at rotte Methyl-Seq plattformen er stand til å oppdage metylering forskjellene som framkommer stress eksponering i rotter.
Som genomer av flere dyr blir tilgjengelige, er det et økende behov for verktøy som kan fange dynamisk epigenetic endringer i disse dyremodeller. Rotta er en bestemt dyr der en epigenetic verktøyet kan utfylle mange farmakologiske og atferdsmessige studier å gi innsiktsfulle mekanistisk informasjon. Dette tilpasset vi SureSelect fange målsystemet (referert til som Methyl-Seq) rat, som kan vurdere DNA metylering nivåer over rotte genomet. Rotte design mål arrangører, CpG øyene, island bredder og GC-rike områder fra alle RefSeq gener.
For å implementere plattformen på en rotte eksperiment, ble Sprague Dawley hannrotter utsatt for kronisk variabel stress i 3 uker, hvoretter blodprøver ble samlet inn for genomisk DNA utvinning. Methyl-Seq biblioteker ble konstruert fra rotte DNA-prøver av klipping, kortet hemorroider, målet berikelse, bisulfite konvertering og multipleksing. Biblioteker var sekvensielt på en neste generasjons sekvensering plattform og den sekvensert lest ble analysert for å identifisere DMRs mellom DNA av stresset og trykklette rotter. Toppkandidat DMRs var uavhengig bekreftet av bisulfite pyrosequencing å bekrefte robustheten av plattformen.
Resultatene viser at rotte Methyl-Seq plattformen er et nyttig epigenetic verktøy som kan fange metylering endringer forårsaket av eksponering til stress.
Fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering har ført til et vell av genomisk sekvenser for både modellen og ikke-modellen organismer. Tilgjengeligheten av slike sekvenser har muliggjort forskning på genetikk, komparativ genomikk og transcriptomics. For eksempel tilgjengelig genomisk sekvenser er svært nyttig for å justere sekvensering data fra ChIP-Seq eksperimenter som beriker DNA basert på tilknytningen histone modifikasjoner1eller bisulfite sekvensering, som måler DNA metylering av oppdage uracil dannet fra bisulfite konvertering unmethylated cytosines2. Imidlertid har det vært forsinkelser i gjennomføringen av epigenomic plattformer som innlemme tilgjengelig genomisk sekvensering data i sin design på grunn av kommenterte data artsspesifikke regulatoriske sekvenser som kan påvirke gen funksjon.
Spesielt er DNA metylering en av de mest studerte epigenetic endringene på DNA som kan utnytte tilgjengelige genomic data for å bygge en methylomic plattform. Et slikt eksempel er en matrise-basert plattform for menneskelig methylome3, som har vært mye brukt i ulike disipliner fra onkologi psykiatri4,5. Dessverre er lignende plattformer for ikke-menneskelige dyr modeller knappe, som det er nesten ingen brukte plattformer som har tatt nytte av genomisk sekvensen i sin første design.
En vanlig metode for å vurdere methylomic landskapet av ikke-menneskelige dyr modeller er redusert representasjon bisulfite sekvensering (RRBS)6. Denne tilnærmingen overvinner kostnaden for hele-genome bisulfite sekvensering at samtidig som et omfattende methylomic landskap, gir lavere Les grundig dekning kostnader og begrenset funksjonell informasjon i store gen-fattige områder i genomet2 . RRBS innebærer begrensning fordøye og størrelse-utvalg av genomisk DNA å berike for svært GC-rik sekvenser som CpG øyer som er ofte funnet i nærheten av genet arrangører og tenkte å spille en rolle i genet regulering7. Mens metoden RRBS er brukt i en rekke viktige studier, er sin avhengighet av begrensning enzymer ikke uten betydelige utfordringer og begrensninger. For eksempel er anriking av GC-rik sekvenser i RRBS helt avhengig av tilstedeværelse av bestemte sekvenser anerkjent av begrensning enzym og påfølgende størrelse av geleelektroforese. Dette betyr at alle genomic områder som ikke inneholder disse begrensning utelates under størrelse. Cross-species sammenligninger er også utfordrende hvis samme begrensning områder finnes i de samme loci blant de ulike artene.
En tilnærming til å overvinne begrensninger av RRBS er å bruke en berikelse metode som utnytter publiserte genomisk sekvensen i utformingen av plattformen. Matrise-basert menneskelige plattformen bruker primer sonder designet mot bestemte forbruksvarer for allel-spesifikke (CG vs TG etter bisulfite konvertering) mål avspenning og grunning forlengelsen. Designen reflekterer ikke bare tilgjengelige menneskelige genomisk sekvens, men eksperimentelt verifisert regulatoriske regioner fra flere tekstlinjer henvendelse, som kode og ENSEMBL8. Til tross for bred bruk i menneskelig methylomic undersøkelser finnes ikke en tilsvarende plattform for modell dyr. I tillegg steder til matrise-basert format betydelig begrensningen på areal tilgjengelig for probeplassering. I de siste årene, har forsøk vært gjort kombinere målet-spesifisitet by av fange sonde design og funksjonen høy gjennomstrømming av neste generasjons sekvensering. Slik bestrebelse resultert i sekvensering-baserte målet berikelse systemet for musen genomet (mus Methyl-Seq), som ble brukt til å identifisere hjernen-spesifikke eller glukokortikoid-indusert forskjeller i metylering9,10. Lignende plattformer for andre modellen og ikke-modellen dyr for å lette epigenomic forskning i disse dyrene.
Her viser vi gjennomføringen av denne romanen plattform for å gjennomføre methylomic analyse på rotte. Rotta har fungert som en viktig dyremodell i farmakologi, metabolisme, neuroendocrinology og virkemåte. For eksempel, er det et økende behov for å forstå de underliggende mekanismene som gir opphav til medikament toksisitet, fedme, stressrespons eller narkotikamisbruk. En høy gjennomstrømming plattform kan fange methylomic endringer forbundet med disse forholdene vil øke vår forståelse av mekanismer. Siden rotten genomet mangler fortsatt merknad for regulatoriske regioner, vi innlemmet ikke-redundant arrangører, CpG øyene, island bredder11, og tidligere identifisert GC-rik sekvenser i rotta Methyl-Seq plattform12.
For å vurdere vellykket design og implementering av SureSelect mål berikelse (generelt referert til som Methyl-Seq) plattform for rotte genomet, ansatt vi en rotte modell av kronisk variabel stress (CVS)13 å identifisere ulikt methylated områdene mellom trykklette og stresset dyr. Vår plattform tegning, protokollen og implementering kan være nyttig for etterforskerne som kanskje ønsker å gjennomføre en omfattende og upartisk epigenetic undersøkelse på en organisme som genomisk sekvensen er allerede tilgjengelig, men fortsatt dårlig kommentert.
I denne studien vi designet og implementert Methyl-Seq plattformen for rotte genomet. Ved å demonstrere sin nytteverdi med en rotte modell av stress, viste vi at eksperimentelle og analytisk rørledningen kan gi ulikt denaturert områder mellom to sammenligningsgrupper.
For å sikre en vellykket implementering av plattformen, må flere viktige trinn overholdes. Første, innledende DNA kvalitet og kvantitet har en betydelig innvirkning på kvaliteten og kvantiteten av siste Methyl-Seq biblioteket. Vi brukte en fluorometer, i stedet for et spektrofotometer, slik at våre DNA måling reflektert antall double-strandet DNA stede. Bioanalyzer ble brukt til å måle molekylær størrelse og antall DNA etter klipping og etter kort hemorroider. Bekrefter den molekylære størrelsen “shift” mellom disse trinnene er avgjørende å bekrefte tilstedeværelse av kort på slutten av hver DNA fragment som vil gjennomgå adapter-mediert PCR i de etterfølgende trinnene. Antall DNA igjen på slutten av kortet ligation trinnet er også viktig, siden minst 100 ng biblioteket produktet er nødvendig på dette trinnet å sikre tilstrekkelig mengde er tilgjengelig etter målet berikelse og bisulfite konverteringstrinnene. En siste høy følsomhet måling ble utført på konstruert Methyl-Seq biblioteket slik at biblioteket kan fortynnes riktig for påfølgende klynger på neste generasjons sequenceren. Endelig var bisulfite pyrosequencing ansatt som svært kvantitativ, uavhengig å vurdere nøyaktigheten av rørledningen analytisk. Det siste godkjenningen ved hjelp av den opprinnelige prøver og replikering bruker flere dyr er avgjørende skritt for å sikre at eksperimentet kan oppdage biologisk betydelige endringer i DNA metylering.
Vi har også flere retningslinjer avvik fra protokollen eller hvis oppstår problemer. Først er det mulig å miste for mye DNA under slutten-reparasjon, kortet hemorroider eller magnetiske perle rensing trinn. Eventuelt starter mengder DNA kan være små (< 200 ng) på grunn av begrenset vev/DNA tilgjengelighet eller gjennomføringen av ulike berikelse som fluorescens aktivert celle sortering. Øke antall syklus under to biblioteket forsterkning trinnene kan være stand til å kompensere for overdreven tap av DNA eller lav starter DNA beløp gjennom biblioteket bygging protokollen. Men er ikke mer enn en ekstra 2-3 sykluser anbefalt, overdreven mal forsterkning er sannsynlig føre til en økning i antall dupliserte leser blir sekvensielt. Disse like utelates under justering skritt for å hindre skjevhet i prosent metylering beregninger. Andre hvis den gjennomsnittlige DNA størrelsen ikke øker av mer enn 30 bps, kontrollere sikre at reagensene er ny, som T4 DNA polymerase, Klenow eller T4 ligase kan være gamle. Kommersielt tilgjengelige erstatning reagenser kan brukes.
I tillegg er det mulig at de anslåtte DMRs ikke kan validere av pyrosequencing, hvor DNA metylering forskjeller finnes ikke eller er betydelig mindre enn de spådd av analyse. Dårlig godkjenningen kandidat regioner er et problem for felles for mange genomet hele analyser, for eksempel når pyrosequencing resultatene ikke bekrefte differensial metylering eller effekt er mye mindre enn det spådd av analysen. BSmooth er en analytisk pakke som “jevner” metylering nivåer over et vindu av flere forbruksvarer. For gjeldende eksperimentet innblandet BSmooth en DMR som metylering nivåer ble godkjent av bisulfite pyrosequencing. Imidlertid vil det trolig være avvik mellom metylering nivåer spådd av BSmooth og de bekreftet av pyrosequencing. Avvik oppstår fra utjevning funksjonen beregner gjennomsnittlig metylering verdiene på tvers av alle forbruksvarer i en DMR, inkludert påfølgende forbruksvarer som kan variere i DNA metylering av mer enn 50% eller forbruksvarer som metylering verdiene ble ekskludert grunn sub terskelen lese dybde. R-pakker som MethylKit24 kan brukes til å identifisere mindre Vinduer forbruksvarer eller selv enkelt forbruksvarer som metylering nivåer korrelerer sterkt med de godkjent av pyrosequencing. Implementere ulike pakker og teste deres spådd regioner eller forbruksvarer av differensial metylering av pyrosequencing sikrer robustheten av data. Alternativt kan opprinnelige Methyl-Seq biblioteker resequenced og lagt til lese filene å øke lese dybde. Siden fastsettelse av metylering nivåer er semi kvantitative og diktert av antall leser [(# of CpGs) / (antall TpGs + forbruksvarer)], øke Les dybden for en gitt CpG vil øke nøyaktigheten i prosent metylering verdien. I denne studien vurdert vi bare forbruksvarer som metylering ble fastsatt av minst ti leser og oppnådd en total Les dekning av 19 x for hver CpG.
Rotte Methyl-Seq plattformen er ikke uten begrensninger. Det er mer kostnadseffektivt enn hele-genome bisulfite sekvensering, er det betydelig dyrere enn andre metoder. Likevel var mesteparten av kostnadene for innkjøp lanes på sequenceren og ikke på systemet. Avhengig av Les dybden nødvendig med kryss-vevet sammenligninger krever mindre på grunn av store (25-70%) forskjeller12 i DNA metylering, reduseres kostnadene ved multipleksing flere samplinger lane og bruke en høyere kapasitet plattform. Også er prøve forberedelsene mer tidkrevende enn andre metoder. Ligner andre pulldown tilnærminger som inneholder neste generasjons sekvensering, legge ekstra bisulfite konvertering og rensing trinnene til arbeidsbelastningen. Total, metyl-Seq plattformen er et kostnadseffektivt alternativ til hele-genome sekvensering og gir base par oppløsning på mer enn 2,3 millioner forbruksvarer, som er betydelig mer enn de assayed av microarray-baserte plattformer. Til dags dato, kommersielt tilgjengelig menneskelige og mus har Methyl-Seq plattformer blitt brukt til å dokumentere alkohol-avhengige endringer i macaque hjernen25,26, neurodevelopmental gener i musen hjernen9og blod-hjerne mål av glukokortikoider10. Videre, muligheten til å målrette bestemte områder uavhengig av sekvens anerkjennelse av begrensning enzymer gjør det til en ideell plattform for cross-species sammenligninger. Til denne studien designet vi Methyl-Seq plattformen for rotte, som mange farmakologiske, metabolske og atferdsmessige eksperimenter utføres uten fordelen av et genom hele methylomic verktøy. Våre data viser at det kan brukes til å oppdage DMRs i en rotte modell av stress og korrelert andre fysiologiske parametere som samlet plasma CORT nivåer.
Methyl-Seq plattformen er ideell for epigenetic eksperimenter i dyr med sekvensert genomer som ikke kanskje har nok eksperimentelle bevis for å dokumentere regulatoriske regioner. Når slike områder er gjort tilgjengelig, kan flere regioner spesialdesignede og knyttet til den gjeldende versjonen. Videre er plattformen ideell for komparativ genomikk, siden målet anriking ikke er begrenset av begrensning enzym anerkjennelse. For eksempel kan området formidler alle genet av interesse fanges uansett om havner det en spesifikk begrensning nettsted. Tilsvarende kan noen regulatoriske regioner, som de identifiserte i musen eller mennesker, som er bevart i genomet av interesse hentes.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av NIH grant MH101392 (RSL) og støtte fra følgende priser og stiftelser: en NARSAD ung forsker pris, Margaret Ann pris etterforsker fondet, James Wah affektive lidelser Scholar fondet via Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation, og prosjektet Match Foundation (RSL).
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |