SINEUPs सिंथेटिक antisense गैर कोडिंग RNAs है, जो एक बाध्यकारी डोमेन (BD) और एक प्रभाव डोमेन (ED) और अप लक्ष्य mRNA के अनुवाद को विनियमित होते हैं । यहां, हम SINEUPs के लिए खोज तरीकों का वर्णन के लिए संस्कृति में सेल लाइनों, उनके अनुवाद का विश्लेषण-पश्चिमी दाग और एक अर्द्ध स्वचालित उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली द्वारा गतिविधि को बढ़ावा देने ।
लक्षित प्रोटीन वृद्धि महत्व का न केवल जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए है, लेकिन यह भी चिकित्सकीय और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए । यहां, हम चुनिंदा अप करने के लिए एक विधि प्रस्तुत-कृत्रिम antisense गैर के माध्यम से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में वांछित जीन के प्रोटीन अभिव्यक्ति को विनियमित-कोडिंग RNAs SINEUPs के रूप में जाना जाता है । जीन अभिव्यक्ति के इस सकारात्मक नियंत्रण के बाद transcriptional स्तर पर है और एक औंधा लघु interspersed परमाणु तत्व (ज्या) SINEUPs के 3 पिरणामस्वरूप अंत है कि उसके प्रभाव डोमेन (एड) शामिल है पर दोहराने के द्वारा लागू । SINEUPs विशेष रूप से किसी भी प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते है अपने बाध्यकारी डोमेन (BD) के माध्यम से पसंद की कोडिंग mRNA, एक के लिए 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र (5 पिरणामस्वरूप UTR) और codon के शुरू mRNA के भीतर अनुक्रम पूरक डिजाइन क्षेत्र । लक्ष्य-विशिष्ट इस तरह से डिजाइन SINEUPs प्रसंस्कृत कोशिकाओं को transfected हैं, और प्रोटीन और आरएनए अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए निकाले जाते हैं, आम तौर पर 24-48 एच पोस्ट-अभिकर्मक. SINEUP-प्रेरित प्रोटीन अप-विनियमन पश्चिमी दाग विश्लेषण और आरएनए अभिव्यक्ति द्वारा पता लगाया है वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर का उपयोग कर मापा जाता है । हमने देखा है कि bd डिजाइन इष्टतम SINEUP गतिविधि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और है कि लक्ष्य mRNA के शुरू codon के संबंध में विभिंन bd आकार और पदों के परीक्षण की सिफारिश की है । इसलिए, हम यहां एक अर्द्ध स्वचालित उच्च प्रवाह इमेजिंग विधि प्रतिदीप्ति पता लगाने कि लक्ष्य mRNA ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ जुड़े को लागू किया जा सकता है पर आधारित का वर्णन । SINEUPs विशेष रूप से सेल के सामांय शारीरिक सीमा के भीतर अनुवाद बढ़ाने के लिए, लक्ष्य प्रतिलिपि स्तर फेरबदल के बिना । इस विधि को सफलतापूर्वक अंतर्जात और exogenous लक्ष्य की एक सीमा के खिलाफ कार्यरत है, मानव, माउस की एक विस्तृत विविधता में, और vivo सिस्टम में साथ कीट सेल लाइनों । इसके अलावा, SINEUPs एंटीबॉडी उत्पादन में वृद्धि और एक आरएनए haploinsufficient जीन के खिलाफ चिकित्सकीय के रूप में काम करने के लिए सूचित किया गया है । SINEUPs की बहुमुखी और मॉड्यूलर प्रकृति उन्हें जीन-विशिष्ट शोधों के नियंत्रण के लिए एक उपयुक्त उपकरण बनाती है.
जीनोमिक के बाद के दौर में, कई अंतर्दृष्टि के जीन विनियामक भूमिकाओं में प्राप्त किया गया है गैर कोडिंग antisense टेप अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास के कारण1,2,3 और जीन संपादन उपकरण । टेप, जो पहले “transcriptional कचरा” माना जाता था की यह श्रेणी अब आनुवंशिक विनियमन के एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में स्थापित किया गया है । Antisense टेप को क्रोमेटिन और नियंत्रण स्थिरता और उनके cognate प्रोटीन की अभिव्यक्ति-कोडिंग नब्ज mRNA4,5की सूचना है । ज्यादातर मामलों में, विनियमन के इस विधा नकारात्मक और antisense टेप आरएनए-आरएनए6,7के माध्यम से उनकी भावना समकक्षों मौन है । प्राकृतिक antisense टेप की यह विशेषता सिंथेटिक छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना), microRNA (miRNA), और antisense ओलिगोस्पर्मिया (ASO) के रूप में downregulate वांछित जीन का उपयोग किया गया है8,9,10 ,11 लक्षित जीन अप के लिए एक तकनीकी शूंय छोड़ने-विनियमन ।
एक पेचीदा अध्ययन का प्रदर्शन है कि antisense लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs (lncRNAs के रूप में) जीन Uchl1 (ubiquitin सी-टर्मिनल hydrolase L1) और Uxt (बैरे-प्रतिलिपि व्यक्त की) द्वारा antisense आरएनए क्षेत्र के परिप्रेक्ष्य बदल चूहों में transcriptional स्तर के पश्चात्12में उनके cognate भाव mRNA के अनुवाद को सकारात्मक रूप से विनियमित करना । इन के रूप में lncRNAs के 5 पिरणामस्वरूप अंत 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र में कई कुर्सियां (5 पिरणामस्वरूप UTR) उनके इसी भाव टेप के साथ ओवरलैप, और गैर अतिव्यापी 3 पिरणामस्वरूप अंत एक retrotransposon की एक औंधा दोहराने शामिल लघु interspersed परमाणु से संबंधित तत् (ज्या) कुटुंब. दिलचस्प है, हमने पाया है कि इस शोधों के पीछे मुख्य ड्राइविंग बल-विनियमन एंबेडेड साइन दोहराने है और यह केवल माउस को दोहराने के लिए सीमित नहीं है । मानव Alu दोहराने-lncRNAs के रूप में भी लक्ष्य भावना mRNAs का अनुवाद बढ़ाया, ज्या के एक उपंयास वर्ग के विचार मजबूत-विनियामक antisense गैर कोडिंग RNAs, उचित13SINEUPs नाम चालित । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्राकृतिक SINEUPs की क्षमता सिंथेटिक SINEUPs में संरक्षित करने के लिए विशेष रूप से विभिंन अंतर्जात और exogenous जीन14,15लक्ष्य बनाया है । SINEUPs दो महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं: पहले “बाध्यकारी डोमेन” (बी) जो आम तौर पर 5 पिरणामस्वरूप अंत एक प्रोटीन के प्राथमिक शुरू codon को शामिल अनुक्रम के पूरक क्षेत्र है mRNA कोडिंग, और दूसरा “प्रभाव डोमेन” (ईडी) के रूप में इसे शामिल एक SINEUP समारोह14 के लिए एक शर्त है जो ज्या के उल्टे दोहराने (चित्रा 1) । SINEUPs के लिए एक विशेष रूप से पसंद की एक जीन लक्ष्यीकरण BD डिजाइन अनुकूलित किया जा सकता है । यह तो एक विशेष एक जैविक मार्ग में शामिल जीन के समारोह काटना दोहन किया जा सकता है, एक पारंपरिक mRNA के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में व्यक्त की रणनीति । इसके अलावा, इस बहुमुखी उपकरण एंटीबॉडी उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए लागू किया जा सकता है, और कार्यात्मक प्रोटीन की अपर्याप्त खुराकों की वजह से haploinsufficient रोगों के इलाज के लिए एक दवा के रूप में16,17,18, 19,20,21.
SINEUP टेक्नोलॉजी के फायदे कई गुना होते हैं. यह transcriptional स्तर पर लक्ष्य की अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं करता है । अब बीडीएस SINEUPs को और अधिक विशिष्टता प्रदान करते हैं, जबकि एक dsRNA-निर्भर तनाव15प्रतिक्रिया उत्प्रेरण नहीं है । प्रोटीन प्रेरण कोशिका की सामान्य शारीरिक सीमा के भीतर बनाए रखा है, ंयायपालिका या अत्यधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के कारण किसी भी बचके प्रभाव को रोकने. SINEUPs माउस, मानव की एक विस्तृत विविधता के साथ संगत कर रहे हैं, और हंसटर प्रसंस्कृत सेल लाइनों, उदाहरण के लिए, HEK293T/17, HepG2, हेला, चो, MN9D, और कई और12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs कुशलतापूर्वक अंतर्जात जीन लक्ष्य कर सकते हैं, क्षणिक जीन, और झंडा-टैग या luciferase फ्यूजन जीन, जीन विशिष्ट एंटीबॉडी14,18की जरूरत को नष्ट करने । बुनियादी SINEUP विश्लेषण नियमित सेल संस्कृति, अभिकर्मक, सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो की आवश्यकता है (एसडीएस-पृष्ठ), वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) उपकरणों और सेटिंग्स, और विशेषज्ञता कम समय में प्राप्त किया जा सकता है ।
यहाँ, हम अप करने के लिए कृत्रिम SINEUPs के साथ जीन लक्ष्यीकरण के लिए एक विधि का वर्णन-अनुवाद को विनियमित, आरएनए हस्तक्षेप9 और ASO gapmers11,22,23जैसे अन्य प्रौद्योगिकियों के विपरीत एक प्रभाव. आरएनए-निर्देशित जीन सक्रियण के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि नियमित रूप से प्रतिक्रियाशील लघु palindromic दोहराया-आधारित सक्रियण (CRISPRa), जहां जीन अभिव्यक्ति transcriptional स्तर24पर शुरू हो रहा है संकुल है । इस विधि, हालांकि सरल और तेजी से, एकाधिक एकल गाइड RNAs (sgRNAs) उच्च दक्षता के लिए एक ही जीन लक्ष्यीकरण की आवश्यकता है, जिससे ऑफ लक्ष्य बंधन25की संभावना बढ़ रही है । इसके अलावा, CRISPRa प्रणाली के प्रमुख एंजाइम, उत्प्रेरक मृत CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (dCas9) कम बाध्यकारी विशिष्टता और sgRNAs लक्ष्यीकरण द्वि-दिशात्मक प्रवर्तक क्षेत्रों गैर विशेष रूप से अप-पास के जीन25को विनियमित कर सकते हैं । इसके विपरीत, SINEUPs उच्च विशिष्टता के साथ एक एकल बंधन क्षेत्र में mRNA लक्ष्य को बांध और आसपास के जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करते । हम SINEUP डिजाइन, अभिकर्मक, प्रोटीन और आरएनए एक्सप्रेशन विश्लेषण में शामिल बुनियादी कदमों पर चर्चा करते हैं । इसके अलावा, हम एक अर्द्ध स्वचालित, उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली को एक बार में कई SINEUPs स्क्रीन, जो इष्टतम SINEUPs का पता लगाने के लिए उपयोगी है वर्तमान ।
हम यहां विशेष रूप से एक साइन-गैर कोडिंग आरएनए, SINEUPs बुलाया के माध्यम से एक लक्ष्य mRNA के प्रोटीन उत्पादन बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, इष्टतम सिंथेटिक SINEUP-GFP अप करने के लिए दिखाया गया है-GFP mRNA २.६ के अनुवाद को विनियमित-के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण से मापा ।
एक इष्टतम BD डिजाइनिंग SINEUP विशिष्टता और शक्ति (प्रोटीन की हद तक विनियमन) को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे पहले, हमने पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण द्वारा SINEUP-GFP के 17 बीडीएस की जांच की और पाया कि इष्टतम BD GFP mRNA के AUG-श्मिट अनुक्रम को ओवरलैप करता है, हालांकि यह अन्य mRNAs के साथ मामला नहीं हो सकता और प्रत्येक मामले के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए । एक अंय स्वतंत्र समूह भी एक अलग31विधि का उपयोग कर BD दिखलाई । स्क्रीनिंग के रूप में कई बीडीएस काफी समय लेने वाली और बोझिल हो सकता है, हम एक उच्च प्रवाह SINEUP जांच विधि यहां शुरू की । यह विधि नियंत्रण वेक्टर transfected-कोशिकाओं की तुलना में SINEUP transfected-कोशिकाओं में GFP एकीकृत घनत्व में सापेक्ष परिवर्तन के उपाय करता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक संस्कृति प्लेट के एक विशेष कुआं में कोशिकाओं को समान रूप से transfected है और GFP संकेत अच्छी तरह से केवल एक निश्चित क्षेत्र के लिए ध्यान केंद्रित नहीं है, यह बहुत ही कदम २.१ में कुओं में समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रयोजन के लिए, धीरे थाली हिला 10 बार आगे पीछे (↑ ↓) एक साफ पीठ के अंदर कोशिकाओं बोने के बाद और 5% CO2 मशीन में दोहराने से पहले मशीन शुरू ।
एक और महत्वपूर्ण कदम ३.३ कदम में प्रोटीन एकाग्रता की गणना है । यहां गलत गणना पश्चिमी दाग विश्लेषण के दौरान प्रोटीन की एक ग़लत राशि की लोडिंग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, फलस्वरूप कमजोर SINEUPs के कुछ द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति में छोटे परिवर्तन का पता लगाने या अतिभारित से झूठी सकारात्मक पैदा करने को रोकने । यह ताजा प्रोटीन मानक वक्र हर बार तैयार करने के लिए सिफारिश की है, सुनिश्चित करें कि मानकों और प्रोटीन के नमूनों की बराबर मात्रा में कदम 3.3.3 में मापा जाता है बना । प्रोटोकॉल यहां वर्णित SINEUP-GFP पर केंद्रित है, लेकिन पश्चिमी दाग विश्लेषण ब्याज की किसी भी लक्ष्य mRNA के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मशीन समय और एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
SINEUPs की अनूठी विशेषताओं में से एक है कि लक्ष्य-mRNA अभिव्यक्ति स्तर अप्रभावित रहता है । यह qRT-पीसीआर द्वारा transfected SINEUPs और जीनोमिक डीएनए का पता लगाने से बचने के लिए DNase के साथ आरएनए का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । अभिकर्मक और SINEUP गतिविधि दोनों की सफलता की पुष्टि के लिए SINEUP RNAs और target mRNA एक्सप्रेशन को qRT-पीसीआर द्वारा मापा जाना चाहिए । SINEUPs एक साइन अनुक्रम है, जो दोनों मानव और माउस जीनोम भर में प्रचुर मात्रा में होते हैं । ज्या अनुक्रम का गैर-विशिष्ट डिटेक्शन से बचने के लिए, यह qRT-पीसीआर प्राइमरों को साइन अनुक्रम के लिए डिज़ाइन करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल में हम मानव कोशिका लाइनों का इस्तेमाल किया, लेकिन SINEUPs कई विभिंन प्रजातियों12,13,14,18,19से सेल लाइनों के एक नंबर में प्रभावोत्पादक हैं । सेल संस्कृति और अभिकर्मक स्थितियों के रूप में इन SINEUP वैक्टर के अभिकर्मक दक्षता बनाए रखने के रूप में लंबे समय के रूप में अलग सेल लाइनों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और प्रोटीन एकाग्रता जाँच के वैकल्पिक तरीकों को देखते हुए नियोजित किया जा सकता है कि वे qRT-पीसीआर और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए आवश्यक आरएनए और प्रोटीन गुणवत्ता की रक्षा करते हैं । जब तक हम एक विशिष्ट उच्च प्रवाह माइक्रो-अच्छी तरह से cytometer, जो पूरी तरह से GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम थे, एक समान पता लगाने रेंज के साथ अन्य cytometers31इस्तेमाल किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अगर कोशिकाओं और अभिकर्मक के वितरण के एक अच्छी तरह भर में बराबर हैं, तो यह आवश्यक नहीं है GFP प्रतिदीप्ति के लिए पूरी तरह से स्कैन: आधा या एक अच्छी तरह के क्षेत्र के एक चौथाई प्रयोग के आधार पर SINEUP प्रभाव विचार करने के लिए पर्याप्त हो सकता है अल कौशल ।
एक उच्च प्रवाह SINEUP का पता लगाने प्रोटोकॉल की स्थापना कई बीडीएस के एक साथ स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में एक दिया mRNA लक्ष्यीकरण । यह महत्वपूर्ण है के रूप में BD द्वारा अधिकतम लक्ष्यीकरण शासी नियम अभी भी अस्पष्ट हैं । इस तरह के एक मल्टीप्लेक्स स्क्रीनिंग प्रणाली विभिंन जीन के खिलाफ कई SINEUPs के बड़े पैमाने पर परीक्षण के लिए अनुमति देता है, कई उदाहरण के लिए एक विशेष संकेत मार्ग में शामिल जीन लक्ष्यीकरण के लिए उपयोगी है । इसके अलावा, यह प्रभावी SINEUPs कई mRNAs लक्ष्यीकरण के लिए खोज का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, अगस्त के आसपास विभिंन SINEUP बीडीएस डिजाइन-श्मिट क्षेत्र ( 1 चित्रादेखें), सह transfecting पूर्ण लंबाई लक्ष्य mRNAs (5 पिरणामस्वरूप UTR-सीडीएस-3 पिरणामस्वरूप UTR) GFP mRNA के साथ जुड़े प्रसंस्कृत कोशिकाओं में इष्टतम SINEUPs को खोजने के लिए, और बाद में अंतर्जात mRNA के खिलाफ BD के उम्मीदवारों का परीक्षण करने के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं में और vivo मॉडल जानवरों में, मनुष्यों और चूहों से अन्य पशु और प्रजातियों के पौधे.
यह स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बहुत तेज है । हम ठीक है और कोशिकाओं को इकट्ठा करने की जरूरत नहीं है, लेकिन सिर्फ इमेजिंग साधन में रहने वाले सेल संस्कृति प्लेट जगह की जरूरत है । हम इस उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए SINEUPs के इष्टतम बीडीएस का चयन करें और पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा संभावित उंमीदवारों का मूल्यांकन करने का प्रस्ताव । इस प्रकार, इष्टतम बीडीएस के साथ चयनित उंमीदवारों एंटीबॉडी उत्पादन बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है18,19,21। वर्तमान में, आरएनए चिकित्सीय क्षेत्र नाटकीय रूप से बढ़ रहा है । उदाहरण के लिए, सिरना, ASO, mRNA, और CRISPR आरएनए चिकित्सा, व्यापक रूप से उनके संबंधित लक्ष्य9,३२के mRNA अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कार्यरत हैं । इस संदर्भ में, SINEUPs अपने शैशव में हैं, लेकिन अब तक कोई भी अध्ययन SINEUPs लक्ष्य mRNAs की अभिव्यक्ति बदल दिया है । इसके अलावा, SINEUPs लक्ष्य mRNA संपादित नहीं करते हैं, लेकिन केवल अप-mRNA के अनुवाद को विनियमित । इसके अलावा, हानि-समारोह haploinsufficiency से उत्पंन रोगों SINEUP चिकित्सा द्वारा लक्षित किया जा सकता है, की कमी प्रोटीन17,३३की एक 2 गुना प्रेरण प्राप्त करने । बंद लक्ष्य प्रभाव हालांकि आगे का अध्ययन करने की जरूरत है, SINEUPs संभावित और विशेष रूप से एक लक्ष्य, BD के लिए एक पूरक अनुक्रम के साथ mRNA व्यक्त किया.
इस उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह उपयुक्त नहीं है SINEUPs में vivo माउस मॉडल में बीडीएस स्क्रीन क्योंकि प्रोटोकॉल GFP एकीकृत तीव्रता केवल उपाय । के रूप में SINEUPs प्राकृतिक antisense lncRNAs कि अधिनियम के बाद transcriptionally हैं, वे लागू नहीं किया जा सकता है जब लक्ष्य mRNA कोशिकाओं या ऊतक नमूनों में लापता है ।
फिर भी, SINEUPs लाभ के समारोह अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, एंटीबॉडी उत्पादन बढ़ाने के लिए, और एक आरएनए थेरेपी के रूप में अप-1.5-3.0-गुना की सीमा के भीतर कमी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को विनियमित । तरीकों यहां वर्णित करने के लिए लक्ष्य और वांछित mRNA के SINEUP प्रेरित अनुवाद वृद्धि का पता लगाने के लिए एक उपयोगी गाइड वर्तमान और पोस्ट के लिए एक नया उपकरण-transcriptional जीन विनियमन प्रदान करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन में आंशिक रूप से अभिनव जैविक चिकित्सा, no 17am0301014 के लिए बुनियादी विज्ञान और मंच प्रौद्योगिकी कार्यक्रम, चिकित्सा अनुसंधान और विकास (एमएड) के लिए जापान एजेंसी से, अनुसंधान अनुदान MEXT से आरआईकेईएन केंद्र के लिए जीवन का समर्थन किया था विज्ञान प्रौद्योगिकी और MEXT से आरआईकेईएन आईएमएस के लिए एक अनुसंधान अनुदान । हम पीसी लैब के सदस्यों को धंयवाद और SINEUP नेटवर्क (SISSA, पूर्वी Piedmont और आरआईकेईएन के विश्वविद्यालय) सोचा उत्तेजक विचार विमर्श के लिए । हम ठीक करने के लिए डॉ मैथ्यू वेलेंटाइन धंयवाद ।
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |