Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

doi: 10.3791/58627 Published: February 1, 2019
* These authors contributed equally

Summary

سنوبس هي الاصطناعية العقاقير غير الترميز الكشف، التي تحتوي على مجال ملزمة (دينار بحريني) ومجال المستجيب (اد) ومتابعة تنظيم الترجمة من استهداف مرناً. هنا، نحن تصف أساليب الكشف سنوبس في خطوط الخلايا المستزرعة، تحليل لنشاطهم تشجيع الترجمة بوصمة عار الغربية وإنتاجية عالية شبه الآلي نظام التصوير.

Abstract

بروتين يستهدف تعزيز أهمية ليس فقط لدراسة العمليات البيولوجية وإنما أيضا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والعلاجية. وهنا، نقدم أسلوباً انتقائيا حتى-تنظيم التعبير البروتين المطلوب الجينات في الخلايا المستزرعة عن طريق antisense الاصطناعية غير الترميز الكشف المعروفة باسم سينيوبس. عنصر التحكم هذا إيجابيا للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال وتمارسها مقلوب قصيرة اينتيرسبيرسيد النووي عنصرا (شرط) كرر في نهاية 3ʹ سينيوبس التي تضم المجال المستجيب (ED). يمكن ربط سنوبس على وجه التحديد أي مرناً ترميز البروتين من الاختيار من خلال المجال ملزم به (دينار بحريني)، منطقة مصممة لتكملة التسلسل داخل المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) وما حولها كودون بداية من مرناً. سنوبس محددة الهدف المصممة بهذه الطريقة هي transfected الخلايا المستزرعة، ويتم استخراج البروتين والحمض النووي الريبي المصب التحليلات، عموما تعداء بعد ح 24-48. الكشف عن البروتينات المستحثة سينوب أعلى-التنظيم بواسطة تحليل وصمة عار الغربية والتعبير الحمض النووي الريبي يقاس باستخدام النسخ في الوقت الحقيقي عكس الكمي PCR. وقد لاحظنا أن تصميم دينار بحريني أمر حاسم لتحقيق أمثل سينوب النشاط وأن اختبار مختلفة الأحجام دينار بحريني والمواقف فيما يخص كودون ابدأ الهدف مرناً ويوصي. ولذلك نحن هنا وصف أسلوب تصوير الفائق شبه إليه يقوم على الكشف عن الأسفار التي يمكن تنفيذها للهدف مرناً تنصهر مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). سنوبس على وجه التحديد تعزيز الترجمة ضمن مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، دون تغيير مستوى نص الهدف. وقد استخدمت هذا الأسلوب بنجاح ضد مجموعة من الأهداف الداخلية والخارجية، في مجموعة متنوعة واسعة من البشرية، والماوس، وخطوط الخلية الحشرات جنبا إلى جنب مع نظم المجراة. وعلاوة على ذلك، أبلغ سنوبس على زيادة إنتاج الأجسام المضادة والعمل كالحمض النووي الريبي علاجية ضد الجينات هابلوينسوفيسينت. طبيعة تنوعاً ووحدات سنوبس يجعل منها أداة مناسبة لمراقبة المتعدية الجينات على حدة.

Introduction

في حقبة ما بعد الجينوم، اكتسبت العديد من الأفكار إلى أدوار تنظيمية الجينات غير ترميز النصوص العقاقير نظراً لتطوير الجيل التالي تسلسل التكنولوجيات1،،من23 و أدوات تحرير الجينات. هذه الفئة من النصوص، التي كانت تعتبر سابقا أن يكون "سلة المهملات النسخي"، ثبت الآن كلاعب رئيسي من المادة الوراثية. محاضر العقاقير أفيد بأن تعدل الكروماتين والاستقرار التحكم والتعبير عن تلك المشابهة ترميز البروتين معنى مرناً4،5. في معظم الحالات، هذا النمط من التنظيم سلبي والمستنسخات العقاقير إسكات نظرائهم الإحساس عن طريق الحمض النووي الريبي الريبي التفاعلات6،7. هذه سمة النصوص العقاقير الطبيعية قد استخدمت للجينات دوونريجولاتي المطلوب في شكل الاصطناعية الصغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، ميكرورنا (ميرنا)، والعقاقير أوليجوس (أسو)8،9،10 ،11 ترك فراغاً تكنولوجية لاستهداف أعلى-تنظيم الجينات.

دراسة مثيرة للاهتمام واحد تغيير منظور مجال الحمض النووي الريبي العقاقير بإثبات أن antisense طويلة غير الترميز الكشف (مثل لنكرناس) من الجينات Uchl1 (هيدرولاز ubiquitin الطرفية ج L1) أوكست (أوبيكويتوسلي-أعرب عن نسخة) تنظيم إيجابي ترجمة بهم قرابة بمعنى مرناً على مستوى بوستترانسكريبشونال في الفئران12. نهاية 5ʹ من هذه لنكرناس يتداخل مع عدة قواعد في المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) هذه النصوص معنى المقابلة، ويحتوي على نهاية 3ʹ غير متداخلة تكرار مقلوب ريتروترانسبوسون المنتمين إلى القصير ويتخلل النووية الأسرة عنصر (شرط). من المثير للاهتمام، وجدنا أن القوة الدافعة الرئيسية وراء هذا التنظيم يصل متعدية كرر جيب جزءا لا يتجزأ، وأنه لا يقتصر على الماوس جيب يكرر فقط. الإنسان الو تكرار المحتوية على لنكرناس أيضا تعزيز ترجمة مرناس الإحساس بالهدف، يعزز فكرة فئة جديدة من antisense التنظيمية يحركها شرط الكشف، غير الترميز المسمى سنوبس13. وأظهرت الدراسات الأخيرة أن إمكانات طبيعية سينيوبس يتم الاحتفاظ بها في سينيوبس الاصطناعية يستهدف على وجه التحديد الهدف الجينات داخلية وخارجية مختلفة14،15. سينيوبس أن اثنين من السمات الهامة: الأولى "المجال ملزمة" (دينار بحريني) عموما وهي منطقة نهاية 5ʹ مكملة للتسلسل الذي يشمل المرحلة الابتدائية تبدأ كودون مرناً ترميز البروتين، والثانية "المجال المستجيب" (ED) كما أنه يشتمل مقلوب تكرار للشرط الذي شرط مسبق ل الدالة سينوب14 (الشكل 1). يمكن تخصيص سنوبس لتصميم دينار بحريني على وجه التحديد استهداف جين للاختيار. ثم هذا يمكن تسخيرها لتشريح وظيفة الجينات خاصة تشارك في مسار بيولوجية، كبديل أفضل لاستراتيجية overexpression مرناً تقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الأداة تنوعاً لزيادة إنتاج الأجسام المضادة، و كدواء لعلاج الأمراض هابلوينسوفيسينت التي تسببها جرعات غير كافية من البروتينات الوظيفية16،،من1718، 19،،من2021.

وتتعدد مزايا التكنولوجيا سينوب. فإنه لا يغير من التعبير عن الهدف على المستوى النسخي. أطول خدمات تنمية الأعمال التجارية توفر المزيد من الخصوصية سنوبس، بينما لا يحفز استجابة إجهاد دسرنا-تعتمد على15. يتم الحفاظ على استحثاث البروتين داخل مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، والحيلولة دون أي تأثير ضار بسبب التعبير البروتين شاذة أو مفرطة. سينيوبس متوافقة مع مجموعة متنوعة واسعة من الماوس، والبشرية، ومثقف الهامستر خطوط الخلايا، على سبيل المثال، HEK293T/17، HepG2، هيلا، شو، MN9D، والعديد من أكثر12،13،،من1415،18 ،19. يمكنك استهداف سنوبس الكفاءة الذاتية الجينات والجينات overexpressed عابر ومعلم العلم أو لوسيفراس-الانصهار الجينات، مما يلغي الحاجة للأجسام المضادة الخاصة بالجينات14،18. تحليل سينيوب الأساسية يتطلب ثقافة الخلية الروتينية وتعداء والصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، الوقت الحقيقي النسخ العكسي الكمية-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرت-PCR) الصكوك والإعدادات، و يمكن اكتساب الخبرة في فترة زمنية قصيرة.

وهنا يصف لنا أسلوباً لاستهداف الجينات مع سنوبس الاصطناعية لمتابعة تنظيم الترجمة، تأثير خلافا لغيرها من التكنولوجيات مثل الحمض النووي الريبي التدخل9 واسو جابميرس11،،من2223. أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتنشيط الجينات الموجهة بالجيش الملكي النيبالي هو متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب المستندة إلى تكرار التنشيط (كريسبرا)، حيث يتم تشغيل تعبير الجينات في المستوى النسخي24. يتطلب هذا الأسلوب، بسيطة وسريعة، على الرغم من عدة دليل واحد الكشف (سجرناس) استهداف الجين نفسه لكفاءة أعلى، مما يزيد من فرص ربط خارج الهدف25. وبالإضافة إلى ذلك، قد الإنزيم الرئيسية للنظام كريسبرا، البروتين حفازة الميت المرتبطة كريسبر 9 (dCas9) خصوصية ملزمة منخفضة واستهداف سجرناس مناطق المروج ثنائي الاتجاه يمكن غير-متابعة-تنظم تحديداً القريبة الجينات25. على العكس من ذلك، سينيوبس ربط لاستهداف مرناً في منطقة ملزم واحد مع خصوصية عالية، ولا تؤثر على الجينات القريبة. ونحن نناقش الخطوات الأساسية المتبعة في تصميم سينوب تعداء والبروتين والحمض النووي الريبي تعبير تحاليل. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم شبه الآلي، الفائق تصوير نظام الشاشة سنوبس متعددة في وقت واحد، ومفيد للكشف عن سنوبس الأمثل.

Protocol

1-تصميم "خدمات تنمية الأعمال التجارية من سينوب بنيات" مرناس الهدف

  1. تحقق من موقع بدء النسخ (TSS) وترجمة موقع انطلاق مرناس المستهدفة في خلايا الفائدة. الحصول على بيانات خدمات الدعم التقني من مشاريع كل ترميز و [فنتوم] (تحليل التعبير الجيني، قفص cap) (زينبو: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/).
  2. افتح المستعرض والبحث عن المورثات التي تهم والتحقق من خدمات الدعم التقني بقمم القفص.
  3. راجع المثال تحليل الخلايا والأنسجة محددة "خدمات الدعم التقني من باركنسون" مرض البروتين 7 (PARK7) مرناً هو مبين في الشكل 2.
  4. تصميم قواعد تسلسل أطوال مختلفة عدة المقابلة إلى 40 دينار بحريني قواعد المنبع و 32 مجرى النهر من الميثيونين الأول (أغسطس)، 72 nt في المجموع.
  5. مخصص من أجل خدمات مصممة في ناقلات التعبير سينوب (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: تحقق خصوصية التسلسل بمحاذاة المحلية الأساسية أداة البحث (الانفجار) لتجنب آثار خارج الهدف26.

2-الخلية الثقافة وسينوب تعداء

  1. خلايا البذور من الفائدة في بئر 6-لوحة أو لوحة جيدا 24 على 24 ساعة قبل تعداء سنوبس. وفي حالة خط الخلية البشرية الكلي الجنينية (HEK293T/17) (انظر الجدول للمواد)، بذور 0.5 × 106 خلايا كل بئر الخلايا جيدا--لوحة أو 1.5 × 105 6 كل من بولي-د-يسين المغلفة 24 جيدا-طبق جيدا (انظر الجدول للمواد). يصبح روافد 70% بعد 24 ساعة.
  2. بعد 24 ساعة، تغيير المتوسطة إلى 1.5 مل متوسطة الطازجة جيدا 6-لوحة أو 0.4 مل من متوسطة طازجة لصفيحة جيدا 24. في حالة سينوب-التجارة والنقل، ترانسفيكت 0.6 ميكروغرام من بيجفب-C2 (انظر الجدول للمواد) و 3.4 ميكروغرام من سينوب-التجارة والنقل في بئر واحدة من الحرس الوطني جيدا--لوحة أو 130 6 من بيجفب-C2 و 670 نغ في سينوب-التجارة والنقل في بئر واحدة من صفيحة جيدا 24 مع كاشف تعداء (10 ميليلتر في 6 μ جيدا--لوحة و 3 L في 24 لوحة جيدا) باتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح 24.
  3. تغسل الخلايا مع 2 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) (37 ملم كلوريد الصوديوم، 8 مم Na2HPO4 مم 2.6 بوكل و 1.5 مم خ2ص4) في كل بئر من آبار 6-لوحة أو 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر من صفيحة جيدا 24. فقط لبولي-د-يسين جيدا 24 المغلفة-لوحة، إضافة 25 ميليلتر من وزن 0.05% لكل وحدة تخزين التربسين واحتضان في 5% CO2 حاضنة لمدة 5 دقائق وإضافة ميليلتر 275 من المتوسطة الخلية الواحدة وكذلك. في حالة بئر 6-لوحة، إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر. بيبيت صعودا وهبوطاً لحصاد 3/4 خلايا (1.5 مل لصفيحة بئر 6) أو 225 ميليلتر لصفيحة جيدا 24 من 1 جيدا لاستخراج البروتين (اذهب إلى بروتوكول 3 لاستخراج البروتين) و 1/4 خلايا (0.5 مل لصفيحة بئر 6) أو ميليلتر 75 24 جيدا--لوحة استخراج الحمض النووي الريبي وأجهزة الطرد المركزي في س 6,000 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية (الانتقال إلى الخطوة 5 لاستخراج الحمض النووي الريبي).
    ملاحظة: تحليل تأثير سينوب-التجارة والنقل في بولي-د-يسين مغلفة 24 جيدا-طبق بالتصوير. انتقل إلى الخطوة 7 (تحليل التصوير).

3. استخراج البروتين

  1. نضح 1.5 مل من برنامج تلفزيوني بعناية وإضافة 140 ميليلتر من تحلل الحل (20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم نا يدتا2, 1 ملم عطا، 1% (w/v) تريتون، بيروفوسفات صوديوم 2.5 ملم، 1 مم β-جليسيروفوسفاتي، 1 مم نا3فو4 ، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، وفلوريد 0.005% (w/v) فينيلميثيلسولفونيل (بمسف)) (انظر الجدول للمواد) ميليلتر جيدا--لوحة أو 60 6 كذلك 24-لوحة للكريات الخلية.
  2. مزيج من بيبيتينج وثم مزيج دقيق من التناوب سرعة بطيئة ح 1 في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية بالطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. فحص تركيز البروتين بمقايسة اللونية (انظر الجدول للمواد). إعداد جميع ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة.
    1. إعداد 5-6 مرات إضعاف بروتين ألبومين المصل البقري (BSA) القياسية في الماء عالي النقاوة بتركيزات تتراوح من 0.2-1.5 ملغ/مل البروتين. إعداد معايير جديدة في كل مرة.
    2. تحضير الكاشف العامل Aʹ بخلط 1 مل كاشف (حلاً طرطرات نحاس قلوية) مع 20 ميليلتر من الكاشف S (الحل الفاعل).
    3. تحميل 5 ميليلتر من الماء (المراقبة السلبية)، جيش صرب البوسنة الموحدة (البروتين موحدة وإيجابية التحكم) أو عينة البروتين في كل بئر من 96-جيدا-طبق.
    4. إضافة 25 ميليلتر من كاشف Aʹ في كل بئر. عناية إضافة 200 ميليلتر من كاشف ب (كاشف فلين) الواحدة وكذلك تجنب أي تشكيل فقاعة. وتغطي اللوحة مع رقائق الألومنيوم والانتظار لمدة 5-10 دقائق.
    5. قياس امتصاص البروتين في 750 نيوتن متر مع جهاز المطياف الضوئي. امتصاص مستقر ح 1 على الأقل.
    6. إعداد المنحنى المعياري بتركيزات البروتين القياسي جيش صرب البوسنة التآمر (مغ/مل) على المحور السيني وعلى امتصاص كل منهما على المحور ص. حساب تركيز البروتين العينة بتطبيق معادلة المنحنى المعياري.
      ملاحظة: إيقاف البروتوكول في هذه الخطوة إذا لزم الأمر، أو انتقل إلى الخطوة 4. للتخزين على المدى الطويل، الأداة تجميد عينات البروتين في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية.

4-الفصل البروتين من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والكشف عن البروتينات المستهدفة مع الأجسام المضادة (تحليل وصمة عار الغربية)

  1. إضافة وحدة تخزين واحدة من 2 × تحميل صبغ (0.1 M تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 4% الحزب الديمقراطي الصربي ووالغليسيرول 20%، 1.42% 2-ميركابتيثانول وبروموفينول 0.2% أزرق) لكل حجم العينة البروتين من الخطوة 3، 3. الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبارد فورا على الجليد لمدة 1 دقيقة.
  2. تحميل 10-20 ميكروغرام من عينات البروتين إلى 10% هلام بولي اكريلاميد الحزب الديمقراطي الصربي، وفصل في الخامس 100-150) (انظر الجدول للمواد).
  3. نقل البروتين من الهلام إلى الغشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر (انظر الجدول للمواد) بصك نقل شبه جاف مع نقل المخزن المؤقت (25 مم تريس، جليكاين 192 ملم و 20% ميثانول) في 25 الخامس لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة حل حظر (5% غير الدسم الحليب الجاف في المخزن المؤقت x TBST 1 (137 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، 0.1% توين-20)) (انظر الجدول للمواد) للحاوية حتى الغشاء يتم استيعابه تماما واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. وفي حالة سينيوب-التجارة والنقل، هجن البروتين مع الأضداد المضادة-التجارة والنقل (1:2000 المخفف في عرقلة الحل) (انظر الجدول للمواد) التي تفرخ الغشاء لمدة 30 دقيقة مع الهز في درجة حرارة الغرفة. بروتين لمراقبة داخلية، الكشف عن البروتين β-أكتين بالتهجين مع الأضداد المضادة-β-أكتين (1:2000 المخفف في عرقلة الحل) (انظر الجدول للمواد) لمدة 30 دقيقة مع الهز في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة 1 x TBST العازلة للحاوية حتى الغشاء تماما غارقة والغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة يغسل اثنين أكثر الأوقات (مجموع يغسل ثلاث).
  7. هجن البروتين بروتينات فلورية خضراء إلى المخفف (1: 1000 في عرقلة الحل) أرنب المضادة الأجسام المضادة مترافق مع الفجل البيروكسيديز (HRP)، وهجن البروتين بيتا-أكتين إلى المخفف (1: 1000 في عرقلة الحل) الماوس المضادة الأجسام المضادة مترافق مع برنامج الصحة الإنجابية في الغشاء مدة 30 دقيقة مع الهز في درجة حرارة الغرفة.
  8. يغسل الغشاء مع المخزن المؤقت x TBST 1 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة يغسل اثنين أكثر الأوقات (مجموع يغسل ثلاث).
  9. مزيج تساوي حجم تشيميلومينيسسينسي تعزيز برنامج الصحة الإنجابية (القامة) الكشف عن الكاشف 1 و 2 (انظر الجدول للمواد). نقل الغشاء إلى المزيج الكاشف 2 مل القامة، وتغطية المربع مع رقائق الألومنيوم والسماح لها احتضان لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعناية إزالة الغشاء من مزيج كاشف القامة وفضح استخدام التﻷلؤ التصوير الصك.

5. رنا الاستخراج والمعالجة الدناز

  1. استخراج الحمض النووي الريبي يلي القياسية البروتوكول لاستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا التي نمت في أحادي الطبقة27 أو بدلاً من ذلك استخدام استخراج الحمض النووي الريبي متاحة تجارياً مجموع كيت (انظر الجدول للمواد). أن أذكر بإيجاز، إضافة أي الكاشف تحلل أحادية الطور (شيخوا) من isothiocyanate غوانيدين والفينول إلى الخلايا المقطوع في خطوة 2.3 (1 مل سترشد كل الخلايا 5 مليون)27.
    ملاحظة: تغيير القفازات في كثير من الأحيان. استخدام الكواشف خالية من رناسي، وديثيلبيروكاربوناتي (ديبك)-تعامل ير البلاستيك والأواني الزجاجية لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي. إيقاف البروتوكول في هذه الخطوة إذا لزم الأمر. مخزن استخراج الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية.
  2. إضافة 0.1 حجم 10 × الدناز المخزن المؤقت و 2 يو من الدناز للجيش الملكي النيبالي المنقي من الخطوة 5، 1 (انظر الجدول للمواد).
  3. تعيين حجم رد فعل إلى 50 ميليلتر مع المياه خالية من نوكلاس وتخلط بلطف. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة إلى حجم 0.1 من الدناز إعادة علقت المنظمة كاشف ومزيج جيد (انظر الجدول للمواد). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  5. الطرد المركزي في 10,000 س ز لنقل س. 90 المادة طافية (خالية من الحمض النووي الريبي) إلى أنبوب 1.5 مل رناسي خالية جديدة. احرص على عدم لمس بيليه لأنه يمكن أن يسبب هذا الرصيد مرحل الدناز ومزعجة للخطوات النهائية.
  6. كوانتيتاتي الجيش الملكي النيبالي بالقياس260 ونسبة280 &/A260(لنقي الجيش الملكي النيبالي، النطاق هو 1.8 2.0) في جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.

6-أول حبلا كدنا توليف وتحليل PCR قرة

  1. تنفيذ أول توليف كدنا حبلا بعد بروتوكول توليف كدنا قياسية أدناه (انظر الجدول للمواد).
    1. مزيج 0.75 ميكرون اليغو dT التمهيدي، 4.3 التمهيدي عشوائي ميكرومتر، دنتبس (10 ملم في كل) مع 200-500 نانوغرام مجموع الحمض النووي الريبي (من الخطوات 5-8) في 10 ميليلتر من حجم إجمالي رد فعل. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وثم يطرح الاقتراح فورا على الجليد.
    2. مزيج العازلة المنتسخة العكسية x 1، 1 "يو رناسي" المانع، 10 يو من المنتسخة العكسية، وإضافة إلى 10 ميليلتر الجيش الملكي النيبالي-التمهيدي مزيج من 6.1.1.
    3. تعيين حجم الرد الإجمالي إلى 20 ميليلتر مع المياه خالية من نوكلياسي إذا لزم الأمر. المزيج بلطف واحتضان هذا المزيج رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، وأخيراً عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط الإنزيم. تبريد الأنابيب على الجليد.
      ملاحظة: ذوبان الجليد عينات الحمض النووي الريبي وجميع المواد الكاشفة على الجليد وتحضير هذا المزيج رد فعل على الجليد. إذا كان الكشف المستهدف فقط بوليا الكشف، استخدم اليغو dT التمهيدي فقط (2.5 ميكرومتر). إيقاف البروتوكول إذا لزم الأمر. تخزين كدنا المركبة عند-20 درجة مئوية.
  2. أداء بكر قرة في تريبليكاتيس التقنية (n = 3, Cт الانحراف المعياري > 0.2) وداخل replicates البيولوجية (n ≥ 3) استخدام 1 ميليلتر من 10 نانوغرام كدنا، 0.4 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، 0.4 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 10 ميليلتر من حل خليط من بوليميراز الدنا ، 0.4 ميليلتر من الحمض النووي المزدوج-حبلا تلطيخ صبغ، 10 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس (حجم رد الفعل كان 20 ميليلتر) للكشف عن منتجات PCR استخدام التالية الشروط؛ عقد المرحلة (المرحلة 1) 30 s في 95 درجة مئوية، وركوب الدراجات المرحلة (دورات 40) 5 s عند 95 درجة مئوية و 30 s عند 60 درجة مئوية، تذوب المرحلة منحنى. التمهيدي أمثلة للبشرية Gapdh_Fw: تكتكتجكتككتككتجتك، Gapdh_Rv البشرية: جكككاتاكجاككااتكك، EGFP_Fw: جكككجاكاككاكتاككتجاج، EGFP_Rv: كجكجتكاكجاكتككاج، وسينوب-GFP_Fw: كتجتجتجتاتاتكتكتاتج، وسينوب-GFP_Rv: كتكككجاجتكتكتجتاجك. انظر الجدول للمواد. تحليل كمية الحمض النووي الريبي التعبير مع 2-∆∆Ct ± SD الأسلوب28.

7-تصوير تحليل سنوبس بطريقة الكشف شبه الآلي

  1. تغسل الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني لبئر واحدة من صفيحة جيدا 24.
  2. إضافة 2.0 ميكروغرام من هويشت 33342 (انظر الجدول للمواد) (حل في 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني) لكل جيدا من 24-جيدا--اللوحة واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وصمة عار النواة.
  3. التدبير هويشت الملون الخلايا لحساب إجمالي عدد الخلايا في أقصى انبعاثات زرقاء 461 شمال البحر الأبيض المتوسط، وكثافة الفلورية الخضراء لعد عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء إيجابية في انبعاثات خضراء كحد أقصى 510 نانومتر باستخدام (سيتوميتير صورة الصغيرة، حسنا الفائق انظر الجدول للمواد). تحليل تأثير البروتين تصل التنظيمية سينيوبس عن طريق حساب كثافة التجارة والنقل المتكامل، الذي هو مجموع كافة الكثافات بكسل عرض الإشارات في كائنات مجزأة المحسوبة لكل قناة، باستخدام التصوير البرمجيات29.
  4. حصاد الخلايا لفحص الحمض النووي الريبي التعبير (العودة إلى الخطوات 5 و 6).

Representative Results

سينوب-التجارة والنقل هو سينوب اصطناعية التي تحتوي على كل دينار بحريني أمثل (-28/+ 4 تتداخل مرناً التجارة والنقل) واد (معكوس جيب B2 من AS-Uchl1) التي يمكن أن تصل-تنظيم الترجمة مرناً التجارة والنقل (الشكل 3 ألف و 3 باء) دون تغيير على التعبير عن التجارة والنقل مرناً (الشكل 3 و 3D). إلى الشاشة الأمثل خدمات تنمية الأعمال التجارية وبطولة العالم سنوبس، قمنا بتطوير بروتوكول تحليل الصور شبه الآلية التي تحسن الكشف عن الوقت وزيادة عدد العينات التي يجري فحصها في وقت واحد مقارنة مع تحليل وصمة عار الغربية تقليدية15. كما هو موضح في الشكل 4، استغرق هذا نظام التصوير الفائق 3 أيام (تحليل وصمة عار الغربية استغرق أسبوعين سنوبس 48). بعد أن أثبتت أن سينوب-التجارة والنقل يزيد الترجمة التجارة والنقل، ونحن بالكشف عن كثافة التجارة والنقل المتكاملة سيتوميتير الصورة. أمثل دينار بحريني من سينوب-التجارة والنقل الناجمة عن زيادة بنسبة 1.4-fold في التعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء. على الرغم من أننا لاحظنا ضغط الإشارات الصادرة من 2.6-fold (تحليل وصمة عار الغربية، انظر الشكل 3 ألف) إلى 1.4-fold (التصوير التحليل، انظر الشكل 5)، قد يكون الفرق بسبب معايرة برامج أداة التصوير. ومع ذلك، نحن في الكشف عن مستويات أعلى بكثير من الأسفار التجارة والنقل بالمقارنة مع عنصر التحكم (الشكل 5A و 5B).

Figure 1
رقم 1: التصميم الأساسي سنوبس الاصطناعية. دينار بحريني = المجال ملزمة لاستهداف مرناً، اد = المستجيب المجال الذي يحتوي على تسلسل جيب مقلوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: النسخ ابتداء من مواقع (تحديد) من البروتين مرض باركنسون البشرية 7 (PARK7) مرناً في أنسجة محددة والخلايا كما الكشف عنها بواسطة تحليل القفص. تظهر نتيجة بحث في خدمات الدعم التقني للبشرية مرناً PARK7 استخدام تكامل البيانات اوميكس والتصور التفاعلية نظام30لقطة (A) A. السهم الأخضر الأفقي في المسار hg19 الجينات Entrez يشير إلى موضع الجينوم الإشارة البشرية PARK7 مرناً والأشرطة الرأسية الخضراء في 1 القفص FANTOM5 ومسارات 2 تشير إلى مجموع تحديد (قياس كمحاضر كل مليون (tpm)) من 1,829 أنواع من الأنسجة والخلايا. (ب) تكبير المنطقة ملحوظ لخدمات الدعم التقني في الفريق A (مقياس 1/354: 35.4 كيلو بايت إلى 100 شركة بريتيش بتروليوم). رمادي المظللة منطقة في قفص FANTOM5 المرحلة المسارات 1 و 2 يشير إلى خدمات الدعم التقني من 6 خلايا معينة من أصل مجموع 1,829، وهي مدرجة في الجزء السفلي من الشكل. الأرقام (11.369، 4.998، 4.304، 3.509، 3.477 و 3.055) المقابلة لهذه الخلايا المذكورة تشير إلى نصوص كل مليون لكل خلية محددة في الرمادية مظللة المواقف لخدمات الدعم التقني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تحليل وصمة عار الغربية تؤكد اللائحة حتى للترجمة التي سينوب-التجارة والنقل- (A) سينوب-التجارة والنقل بوصمة عار الغربية دراسة مع الأجسام المضادة-التجارة والنقل. (ب) نتائج تم تطبيع لشدة الفرقة البروتين β-أكتين. (ج) التجارة والنقل مرناً والتعبير "الكشف سينوب" (د) تم الكشف عن طريق قرة-بكر. ف < 0.0005، n = 3، اختبار t-التائي، أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكاهاشي et al.15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التخطيطي لتحليل الصور شبه الآلي سينيوب. يوم 1: خلايا البذور من الفائدة في صفيحة جيدا 24. يوم 2: ترانسفيكت التجارة والنقل وسينوب-التجارة والنقل. يوم 3: تحليل تأثير سينيوبس بقياس كثافة التجارة والنقل المتكاملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل الفائق للترجمة الأعلى-التنظيم من جانب سينوب-التجارة والنقل- (أ) مقارنة بين الأسفار التجارة والنقل بين التحكم وسينيوب-بروتينات فلورية خضراء transfected الخلايا15. شريط المقياس = 2-(ب) التجارة والنقل تم تطبيع كثافة المتكاملة لعدد الخلايا مجموع حسابها عن طريق تلطيخ النووية مع هويشت 33342. ف < 0.0005، n = 3، اختبار t-التائي، أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. فوف: مجال الرؤية. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكاهاشي et al.15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وصفت لنا هنا بروتوكولا لتعزيز إنتاج البروتين على وجه التحديد الهدف مرناً عن طريق المحتوية على شرط غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، يسمى سنوبس. وكمثال ممثل، يرد سينيوب الاصطناعية الأمثل-بروتينات فلورية خضراء لمتابعة تنظيم ترجمة مرناً بروتينات فلورية خضراء 2.6-fold كما تقاس بتحليل وصمة عار الغربية.

تصميم دينار بحريني أمثل أمر حاسم لضمان خصوصية سينوب وفاعلية (مدى يصل البروتين-التنظيم). سابقا، ونحن فحص 17 خدمات تنمية الأعمال التجارية من سينوب-التجارة والنقل بالغربية-لطخة تحليل15 ووجد أن دينار بحريني الأمثل يتراكب تسلسل أغسطس-كوزاك مرناً بروتينات فلورية خضراء، على الرغم من أنه قد لا يكون الحال بالنسبة لسائر مرناس وينبغي التحقق من كل حالة. أيضا فحص مجموعة مستقلة أخرى تستخدم طريقة مختلفة31دينار بحريني. كما فحص العديد من خدمات تنمية الأعمال التجارية يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً ومرهقة، قدمنا طريقة كشف سينوب الفائق هنا. هذا الأسلوب يقيس التغيرات النسبية في كثافة التجارة والنقل المتكامل في سينوب transfected-الخلايا مقارنة بمكافحة ناقلات الأمراض transfected-الخلايا. لضمان أن يتم transfected الخلايا في بئر معينة للوحة الثقافة على قدم المساواة وبروتينات فلورية خضراء إشارة لا تتركز على منطقة معينة من البئر، من المهم جداً لتوزيع الخلايا على قدم المساواة في الآبار في الخطوة 2، 1. لهذا الغرض، بلطف يهز لوحة 10 مرات ذهابا وإيابا (↑↓) بعد زرع الخلايا داخل هيئة نظيفة وكرر في الحاضنة2 CO 5% قبل البدء في الحضانة.

خطوة حاسمة أخرى يتم حساب تركيز البروتين في الخطوة 3، 3. الحسابات الخاطئة هنا يمكن أن يؤدي إلى تحميل مبلغ الخاطئة للبروتين أثناء تحليل وصمة عار الغربية، وبالتالي منع الكشف عن التغيرات الصغيرة في التعبير البروتين ببعض سنوبس ضعيفة أو توليد المغلوطة من الحمولة الزائدة. من المستحسن طازجة إعداد المنحنى المعياري البروتين كل مرة، والتأكد من أن يتم قياس كميات متساوية من المعايير وعينات البروتين في خطوة 3.3.3. البروتوكول الموصوفة هنا يركز على سينيوب-التجارة والنقل، ولكن يمكن استخدام التحليل الغربية-وصمة عار لأي استهداف مرناً للفائدة. ينبغي أن يكون الأمثل في وقت الحضانة وتركيز الأجسام المضادة لكل هدف للحصول على أفضل نتيجة لذلك.

واحدة من السمات الفريدة سنوبس أن مستوى التعبير الهدف مرناً وتظل غير متأثرة. من المهم التعامل مع الجيش الملكي النيبالي مع الدناز لتجنب الكشف عن سنوبس ترانسفيكتيد والحمض النووي بواسطة qRT-بكر. الكشف سينيوب والتعبير مرناً الهدف ينبغي أن تقاس قرت-PCR لتأكيد نجاح تعداء والنشاط سينيوب. سنوبس تحتوي على تسلسل جيب، ووفيرة في جميع أنحاء البشرية وجينوم الفأر. لتجنب الكشف غير محددة شرط متواليات، لا ينصح لتصميم كبسولة تفجير qRT-بكر لتسلسل جيب.

في هذا البروتوكول استخدمنا خطوط الخلايا البشرية، ولكن سنوبس الناجعة في عدد من خطوط الخلايا من عدة أنواع مختلفة12،13،14،،من1819. يمكن تعديل شروط الثقافة وتعداء الخلايا وفقا لخطوط الخلايا المختلفة ما دامت هذه المحافظة على كفاءة تعداء موجهات سينوب. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام أساليب بديلة لاستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، والتحقق من تركيز البروتين، نظراً إلى أن تحافظ على نوعية البروتين والحمض النووي الريبي مطلوب بكر قرة وتحليل وصمة عار الغربية. بينما كنا محددة في سيتوميتير الصغرى، حسنا الفائق، الذي مكن كشف الأسفار التجارة والنقل عبر البئر كامل، سيتوميتيرس الأخرى بالكشف عن مجموعة مماثلة يمكن أن تستخدم31. جدير بأن إذا كان توزيع الخلايا وتعداء متساوون في جميع أنحاء بئر، ثم أنه من غير الضروري تفحص البئر كله للأسفار التجارة والنقل: نصف أو ربع من منطقة بئر قد تكون كافية لتمييز تأثير سينوب اعتماداً على التجربة نادي المهارات.

وضع بروتوكول اكتشاف سينوب الفائق يسمح للفحص المتزامن من خدمات متعددة تستهدف مرناً معين في الخلايا المستزرعة. هذا أمر هام نظراً للقواعد المنظمة لاستهداف الأمثل بدينار بحريني لا يزال غير واضح. هذه متعدد فحص نظام يسمح لاختبار على نطاق واسع من سنوبس كثيرة ضد جينات مختلفة، مفيدة لاستهداف جينات متعددة تشترك في مسار إشارات معينة على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لتوسيع نطاق البحث عن سنوبس فعالة تستهدف مرناس عدة، تصميم "خدمات سينوب" مختلفة حول المنطقة أغسطس-كوزاك (انظر الشكل 1)، شارك ترانسفيكتينج كامل طول الهدف مرناس (UTR UTR-الأقراص المدمجة-3ʹ 5ʹ) تنصهر مع مرناً بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المستزرعة للعثور على سنوبس الأمثل، وبعد ذلك اختبار المرشحين دينار بحريني ضد مرناً الذاتية في الخلايا المستزرعة والحيوانات الحية في نموذج، من البشر والفئران إلى غيرها من الأنواع الحيوانية والنباتية.

هذا البروتوكول الفحص بسرعة جداً. نحن لسنا في حاجة إلى إصلاح، وجمع الخلايا، ولكن فقط بحاجة إلى مكان المعيشة الخلية لوحة الثقافة في الصك التصوير. نقترح أن تستخدم هذا البروتوكول الفرز الفائق لتحديد "خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس" الأمثل، وتقييم المرشحين المحتملين عن طريق تحليل وصمة عار الغربية. وهكذا، يمكن تطبيقها المرشحين المختارين مع الأمثل خدمات تنمية الأعمال التجارية لزيادة جسم إنتاج18،،من1921. حاليا، يتزايد جذريا الميدان العلاجي الجيش الملكي النيبالي. على سبيل المثال، siRNA واسو ومرناً، والعلاجات "كريسبر الجيش الملكي النيبالي"، وتستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير مرناً أهداف كل منها9،32. وفي هذا السياق، سينيوبس في مراحلها الأولى، ولكن حتى الآن أيا من سينيوبس درس تغيير التعبير عن مرناس المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تحرير سينيوبس استهداف مرناً، ولكن فقط حتى تنظيم ترجمة مرناً. وعلاوة على ذلك، يمكن استهداف خسارة للدالة الأمراض الناتجة عن هابلوينسوفيسينسي بالعلاج سينوب، تحقيق إضعاف التعريفي17،نقص البروتين33. على الرغم من أن الآثار خارج الهدف تحتاج إلى مزيد من الدراسة، سينيوبس المحتملة، وعلى وجه التحديد استهداف مرناً واحد، أعرب مع تسلسل مكملة لدينار بحريني.

حد لهذا البروتوكول الفائق أنها ليست مناسبة "خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس" الشاشة في الماوس المجراة في نماذج لتدابير البروتوكول التجارة والنقل المتكاملة لكثافة فقط. كما سنوبس لنكرناس العقاقير الطبيعية التي تعمل بوستترانسكريبتيونالي، لا يمكن تطبيقها عند الهدف مرناً مفقود في الخلايا أو عينات الأنسجة.

ومع ذلك، يمكن تطبيق سنوبس لدراسات مكسب للدالة، لتعزيز إنتاج الأجسام المضادة، و كعلاج الحمض النووي الريبي لمتابعة تنظيم التعبير عن نقص البروتينات داخل نطاق 1.5-3.0-إضعاف. الأساليب الموصوفة هنا يقدم دليلاً مفيداً لاستهداف والكشف عن الترجمة التي يسببها سينيوب تعزيز مرناً المنشودة وتوفير أداة جديدة لتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال.

Disclosures

صاحب المقابلة بييرو كارنينسي هو أحد مؤسسي شركة التكنولوجيات ترانسيني الذي يحتفظ بالملكية الفكرية على براءة قدم (EP2691522A4 و JP2017169573A)، ومنح البراءات (US9353370B2) للتكنولوجيا سينوب.

Acknowledgments

هذه الدراسة جزئيا تدعمها منصة برنامج التكنولوجيا والعلوم الأساسية "الطب البيولوجي المبتكرة"، ورقم 17 وأنا 0301014، من وكالة اليابان "البحوث الطبية" والتنمية (AMED)، "منحة بحثية" من يأمرون بمركز الحياة بتبريد تكنولوجيا العلوم ومنحة بحثية من يأمرون بنظام الرصد الدولي بتبريد. ونشكر أعضاء مختبر الكمبيوتر والشبكة سينوب (SISSA وجامعة بيدمونت الشرقية بتبريد) لمناقشات شاحذة للفكر. ونحن نشكر الدكتور ماثيو الحب لتصحيح التجارب المطبعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthetic SINEUP Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 Step 1.5
HEK293T/17 ATCC ATCC CRL-11268 Step 2.1
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate Corning 6902A01 Step 2.1
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate Corning 08-774-124 Step 2.1
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027 Step 2.2
pEGFP-C2 Clontech #6083-1 Step 2.2
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signaling Technology #9803S Step 3.1 This is pre-mixed cell lysis solution.
PMSF Cell Signaling Technology #8553S Step 3.1 To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1x cell lysis buffer.
DC protein assay kit II BIO RAD #5000112JA Step 3.3
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µL BIO RAD #4561035 Step 4.2
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) Amasham 10600013 Step 4.3, This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane.
Nonfat Dry Milk Cell Signaling Technology #9999S Step 4.4 A component of the blocking solution.
GFP Tag Antibody Thermo Fisher Scientific A-6455 Step 4.5 Lot number: 1495850, RRID: AB_221570
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse SIGMA A5441 Step 4.5 Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins Dako P0448 Step 4.5 This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins Dako P0447 Step 4.5 This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137
ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham RPN2109 Step 4.9
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument Promega AS4500 Step 5.1 This is commercially available RNA exreaction instrument.
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit Promega AS1390 Step 5.1 This is commercially available RNA exreaction kit.
TURBO DNA-free Kit ambion AM1907 Step 5.2 and 5.4 The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent.
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6110A Step 6.1 The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis.
TB Green Premix Ex Taq II TaKaRa RR820A Step 6.2
Hoechst3342 Thermo Fisher Scientific H3570 Step 7.2
Celigo S Nexcelom Bioscience 200-BFFL-S Step 7.3 This is a high throughput micro-well image cytometer.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, (5740), 1564-1566 (2005).
  2. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309, (5740), 1559-1563 (2005).
  3. Hon, C. C., et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends. Nature. 543, (7644), 199-204 (2017).
  4. Tufarelli, C., et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature Genetics. 34, (2), 157-165 (2003).
  5. Yu, W., et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA. Nature. 451, (7175), 202-206 (2008).
  6. Carninci, P., Hayashizaki, Y. Noncoding RNA transcription beyond annotated genes. Current Opinion in Genetics & Development. 17, (2), 139-144 (2007).
  7. Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Nucleic Acids Research. 38, (21), 7736-7748 (2010).
  8. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (8), 509-524 (2014).
  9. Takahashi, H., Carninci, P. Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452, (2), 294-301 (2014).
  10. Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  11. Nishina, K., et al. DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing. Nature communications. 6, 7969 (2015).
  12. Carrieri, C., et al. Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat. Nature. 491, (7424), 454-457 (2012).
  13. Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells. Scientific Reports. 6, 33605 (2016).
  14. Zucchelli, S., et al. SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174 (2015).
  15. Takahashi, H., et al. Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation. PLOS ONE. 13, (2), e0183229 (2018).
  16. Deutschbauer, A. M., et al. Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast. Genetics. 169, (4), 1915-1925 (2005).
  17. Indrieri, A., et al. Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo. Scientific Reports. 6, 27315 (2016).
  18. Patrucco, L., et al. Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins. Gene. (2015).
  19. Sasso, E., et al. A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells. MAbs. 1-8 (2018).
  20. Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications. European Journal of Human Genetics. 16, (11), 1350-1357 (2008).
  21. Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs. Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).
  22. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, (15), 1634-1644 (2010).
  23. Watts, J. K., Corey, D. R. Silencing disease genes in the laboratory and the clinic. Journal of Pathology. 226, (2), 365-379 (2012).
  24. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10, (10), 973-976 (2013).
  25. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. 32, (7), 670-676 (2014).
  26. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, (3), 403-410 (1990).
  27. Liu, X., Harada, S. RNA isolation from mammalian samples. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 4 Unit 4.16 (2013).
  28. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  30. Severin, J., et al. Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU. Nature Biotechnology. 32, (3), 217-219 (2014).
  31. Yao, Y., et al. RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat. Nucleic Acids Research. 43, (9), e58 (2015).
  32. Savić, N., Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Translational Research. 168, 15-21 (2016).
  33. Long, H., et al. RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy. Biotechnology Letters. (2016).
الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Takahashi, H., Sharma, H., Carninci, P. Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation. J. Vis. Exp. (144), e58627, doi:10.3791/58627 (2019).More

Takahashi, H., Sharma, H., Carninci, P. Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation. J. Vis. Exp. (144), e58627, doi:10.3791/58627 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter