SINEUPs sono sintetici antisenso non-codificazione RNAs, che contengono un dominio di legame (BD) e un dominio effector (ED) e up-regolare la traduzione di mRNA di destinazione. Qui, descriviamo i metodi di rilevamento per SINEUPs in linee cellulari coltivate, analisi della loro attività di promozione di traduzione mediante Western-blot e un throughput elevato semi-automatizzato sistema di imaging.
Potenziamento mirato-proteina è di importanza non solo per lo studio dei processi biologici, ma anche per applicazioni terapeutiche e biotecnologiche. Qui, presentiamo un metodo per selettivamente up-regolare l’espressione della proteina di geni desiderati in cellule coltivate mediante antisenso sintetica conosciuta come SINEUPs RNA non codificanti. È questo controllo positivo dell’espressione genica a livello post-trascrizionale ed esercitata da un invertito breve elemento nucleare sparpagliato (SINE) ripetizione alla fine di 3ʹ di SINEUPs che comprende il suo dominio effector (ED). SINEUPs in particolare possibile associare a qualsiasi mRNA codificanti per proteine di scelta attraverso il suo dominio di associazione (BD), un’area progettata per completare la sequenza all’interno della regione non tradotta (UTR 5ʹ) di 5ʹ e dintorni il codone di inizio del mRNA. Target-specifici SINEUPs progettato in questo modo transfected alle cellule coltivate, e proteine e RNA sono estratte per analisi successive, generalmente la post-transfezione 24-48 h. Proteina indotta da aumentandone up-regolazione viene rilevato mediante Western-blot ed espressione di RNA viene misurata utilizzando la trascrizione d’inversione quantitativa Real-Time PCR. Abbiamo osservato che il BD design è fondamentale per il raggiungimento ottimale aumentandone l’attività e che testando diverse BD dimensioni e posizioni per quanto riguarda il codone di inizio della destinazione del che mRNA è raccomandato. Di conseguenza, descriviamo qui un metodo di imaging ad alta velocità semi-automatizzato basato sulla rilevazione della fluorescenza che può essere implementata a target che mRNA fusa con la proteina fluorescente verde (GFP). SINEUPs in particolare migliorare la traduzione all’interno di gamma normale fisiologica della cellula, senza alterare il livello di trascrizione di destinazione. Questo metodo è stato impiegato con successo contro una gamma di obiettivi endogeni ed esogeni, in un’ampia varietà di umani, mouse e linee cellulari dell’insetto con sistemi in vivo. Inoltre, SINEUPs sono stati segnalati per aumentare la produzione di anticorpi e lavorare come un terapeutico contro haploinsufficient geni del RNA. La natura versatile e modulare di SINEUPs li rende uno strumento adatto per controllo traduzionale gene-specifico.
Nell’era post-genomica, molte intuizioni sono state acquisite nei ruoli normativi gene di non-codificazione trascritti antisenso dovute all’evoluzione delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione1,2,3 e strumenti di modifica del gene. Questa categoria di trascrizioni, che precedentemente è stata considerata come “trascrizionale spazzatura”, è ormai affermata come un giocatore chiave di regolazione genetica. Trascritti antisenso sono segnalati per modulare la cromatina e controllo stabilità ed espressione della loro cognate proteina-codificazione senso mRNA4,5. Nella maggior parte dei casi, questa modalità di regolamento è negativa e trascritti antisenso silenzio loro controparti di senso attraverso interazioni RNA-RNA6,7. Questo tratto di trascritti antisenso naturale è stato utilizzato ai geni downregulate desiderato sotto forma di sintetico Short interfering RNA (siRNA), microRNA (miRNA) e oligo antisenso (ASO)8,9,10 ,11 , lasciando un vuoto tecnologico per mirati su-regolamento del gene.
Uno studio intrigante ha cambiato la prospettiva del campo di RNA antisenso dimostrando che antisenso lungo RNA non codificanti (come lncRNAs) dei geni Uchl1 (ubiquitina C-terminale Idrolasi L1) e Uxt (trascrizione espresso ubiquitariamente) regolano positivamente traduzione di loro cognate senso mRNA a livello post-trascrizionale in topi12. Alla fine di 5ʹ di questi lncRNAs si sovrappone con diverse basi nella regione non tradotta 5ʹ (5ʹ UTR) delle loro corrispondenti trascrizioni di senso, e alla fine di 3ʹ non sovrapposte contiene una ripetizione invertita di un retrotrasposone appartenendo a breve sparpagliato nucleare famiglia di elemento (SINE). È interessante notare che, abbiamo scoperto che la principale forza motrice dietro questo up-regolazione traduzionale è ripetere il seno incorporato e non è limitato al mouse che sine ripete solo. Umano ripetizione Alu-contenenti come lncRNAs rafforzata anche la traduzione di mRNA bersaglio senso, rafforzando l’idea di una nuova classe di SINE-driven antisenso di regolamentazione non-codificazione RNAs, opportunamente denominata SINEUPs13. Recenti studi hanno dimostrato che il potenziale di SINEUPs naturale è conservato in SINEUPs sintetico progettato specificamente per mirare vari geni endogeni ed esogeni14,15. SINEUPs hanno due caratteristiche importanti: prima il “dominio di legame” (BD) che generalmente è la regione di fine 5ʹ complementare alla sequenza che comprende il primario avviare codone di un mRNA codificanti per proteine e secondo il “dominio effector” (ED) come incorpora un invertito ripetizione del seno che è un prerequisito per aumentandone funzione14 (Figura 1). SINEUPs può essere personalizzato per progettare un BD mira specificamente un gene di scelta. Questo può quindi essere sfruttato per sezionare la funzione di un particolare gene coinvolto in una via biologica, come un’alternativa migliore per una strategia di sovraespressione di mRNA convenzionali. Inoltre, questo strumento versatile può essere applicato per incrementare la produzione di anticorpi e come una droga per trattare haploinsufficient malattie causate da insufficienti dosaggi di proteine funzionali16,17,18, 19,20,21.
I vantaggi della tecnologia aumentandone sono molteplici. Non altera l’espressione del bersaglio al livello trascrizionale. BDs più fornire maggiore specificità ai SINEUPs, mentre non induce una risposta di stress di dsRNA-dipendente15. L’induzione della proteina è mantenuta entro l’intervallo fisiologico normale della cellula, impedendo qualsiasi effetto deleterio a causa di espressione della proteina aberrante o eccessivo. SINEUPs sono compatibili con una vasta gamma di mouse, umano, e criceto coltivate varietà di cellula, per esempio, HEK293T/17, HepG2, HeLa, CHO, MN9D e molte altre12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs efficientemente possibile target geni endogeni, geni transitoriamente iperespresso e geni Bandierina-etichettate o luciferasi-fusion, eliminando la necessità di anticorpi di gene-specific14,18. L’analisi di base aumentandone richiede coltura cellulare ordinaria, trasfezione, elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), tempo reale della trascrizione-polimerasi inversa quantitativa reazione a catena (qRT-PCR) strumenti e impostazioni, e perizia può essere acquisita in breve tempo.
Qui, descriviamo un metodo per il targeting geni con SINEUPs sintetico di up-regolare la traduzione, un effetto incompatibile con altre tecnologie come RNA interferenza9 e ASO gapmers11,22,23. Un metodo ampiamente utilizzato per l’attivazione del gene RNA-guida è cluster breve regolarmente intercapedine palindromico attivazione basata su ripetizioni (CRISPRa), dove l’espressione genica viene attivato al livello trascrizionale24. Questo metodo, anche se semplice e veloce, richiede più guida singola RNAs (sgRNAs) targeting per lo stesso gene per una maggiore efficienza, aumentando la probabilità di associazione fuori bersaglio25. Inoltre, l’enzima chiave del sistema CRISPRa, la proteina cataliticamente morto CRISPR-collegata 9 (dCas9) ha specificità obbligatoria bassa e sgRNAs targeting regioni promotrici di bi-direzionale possono non specifico up-regolare è vicino a geni25. Al contrario, SINEUPs legano agli mRNA alla regione singola associazione di destinazione con alta specificità e non influenzano l’espressione dei geni vicini. Discutiamo i passaggi di base coinvolti nella progettazione aumentandone, trasfezione, proteina e analisi di espressione di RNA. Inoltre, vi presentiamo un semi-automatico, ad alta velocità sistema di imaging per schermo SINEUPs multipli in una sola volta, che è utile per il rilevamento di SINEUPs ottimale.
Abbiamo descritto qui un protocollo per migliorare in particolare la produzione di proteine di un target di mRNA per mezzo di una SINE-contenente non-codificanti RNA, chiamato SINEUPs. Come un esempio rappresentativo, ottimale aumentandone sintetico-GFP è mostrato di up-regolare la traduzione di mRNA GFP 2,6 come misurato da analisi Western blot.
Progettare un BD ottimale è fondamentale per garantire la specificità aumentandone e potenza (misura di up-regolazione della proteina). In precedenza, abbiamo proiettato 17 BDs di aumentandone-GFP di Western-blot analisi15 e abbiamo trovato che il BD ottima si sovrappone la sequenza di KOZAK AUG di mRNA GFP, anche se potrebbe non essere il caso con altri mRNA e deve essere verificata per ogni singolo caso. Un altro gruppo indipendente proiettato anche il BD utilizzando un metodo diverso di31. Come molti BDs di screening può essere piuttosto lungo e ingombrante, abbiamo introdotto un metodo di rilevazione ad alta velocità aumentandone qui. Questo metodo misura relativi cambiamenti nella densità GFP integrato in cellule trasfettate con aumentandone rispetto al transfettati per il controllo vettoriale. Per garantire che ugualmente transfected le cellule in un particolare bene di una piastra di coltura e segnale GFP non è concentrata solo una determinata regione del pozzo, è molto importante distribuire le cellule ugualmente in pozzi nel punto 2.1. Per questo scopo, agitare la piastra 10 volte avanti e indietro (↑ ↓) dopo la semina le cellule all’interno di un banco pulito delicatamente e ripetere nell’incubatrice 5% CO2 prima di iniziare l’incubazione.
Un altro punto critico è il calcolo della concentrazione nella proteina in fase 3.3. Il caricamento di una quantità errata di proteine durante l’analisi di Western-blot, di conseguenza impedire rilevamento di piccoli cambiamenti nell’espressione della proteina da alcuni il SINEUPs debole o generare falsi positivi da sovraccarico può causare errori di calcolo qui. Si consiglia di preparare appena la curva standard di proteine ogni volta, assicurandosi che uguali quantità di norme e campioni proteici sono misurati al punto 3.3.3. Il protocollo descritto qui si concentra su aumentandone-GFP, ma analisi Western-blot può essere utilizzato per qualsiasi destinazione mRNA di interesse. Il tempo di incubazione e la concentrazione degli anticorpi deve essere ottimizzati per ogni destinazione ottenere il miglior risultato.
Una delle caratteristiche uniche di SINEUPs è che il livello di espressione di mRNA bersaglio rimane inalterato. È importante per il trattamento di RNA con dnasi per evitare il rilevamento di SINEUPs trasfettate e DNA genomico mediante qRT-PCR. AUMENTANDONE RNAs e l’espressione del mRNA bersaglio dovrebbe essere misurate mediante qRT-PCR per confermare il successo di transfezione e di attività aumentandone. SINEUPs contengono una sequenza SINE, che è abbondante in tutto sia l’essere umano e del mouse genomi. Per evitare il rilevamento non specifici delle sequenze di SINE, non è consigliabile per disegnare qRT-PCR primers per la sequenza SINE.
In questo protocollo abbiamo utilizzato linee cellulari umane, ma SINEUPs sono efficaci in una serie di linee cellulari da parecchie specie diverse12,13,14,18,19. Le condizioni di cultura e di transfezione delle cellule possono essere modificate secondo diverse linee cellulari, purché questi mantengono l’efficienza di trasfezione dei vettori aumentandone. Inoltre, possono essere impiegati metodi alternativi di estrazione RNA, sintesi del cDNA e il controllo della concentrazione di proteine, dato che conservano la qualità richiesta di RNA e proteine per qRT-PCR e Western-blot analisi. Mentre abbiamo usato un cytometer di micro-pozzo alto-rendimento specifico, che attivato il rilevamento della fluorescenza di GFP attraverso l’intero ben, altri citometri con una simile gamma di rilevazione possono essere usate31. Deve essere notato che se la distribuzione di cellule e transfezione è uguale in tutto un bene, quindi non è necessario eseguire la scansione l’intero pozzo per fluorescenza GFP: metà o un quarto della zona di un pozzo potrebbe essere sufficiente a discernere effetto aumentandone secondo esperimento Competenze di al.
Stabilire un protocollo di rilevamento aumentandone di alto-rendimento consente la selezione simultanea di più BDs targeting un determinato mRNA in cellule coltivate. Questo è importante perché le norme che disciplinano il targeting ottimale per il BD non sono ancora chiare. Tale un multiplex sistema di screening permette di testare su larga scala di molti SINEUPs contro diversi geni, utili per il targeting di molteplici geni coinvolti in una particolare via di segnalazione per esempio. Inoltre, può essere utilizzata per espandere la ricerca di efficaci SINEUPs targeting alcuni mRNA, progettando diversi aumentandone BDs intorno AUG-Kozak regione (Vedi Figura 1), co-trasfettando integrale mRNA bersaglio (5ʹ UTR-CD-3ʹ UTR) fusi con GFP mRNA in cellule coltivate per trovare la SINEUPs ottimale e successivamente test BD candidati contro endogeno mRNA in cellule coltivate e animali modello in vivo, da esseri umani e topi ad altre specie animali e vegetali.
Questo protocollo di screening è molto veloce. Non abbiamo bisogno di difficoltà e raccogliere le cellule, ma solo bisogno di inserire la vita delle cellule piastra di coltura in strumento di imaging. Ci proponiamo di utilizzare questo protocollo di screening ad alta resa ottimale BDs di SINEUPs di selezionare e valutare potenziali candidati mediante Western-blot. Quindi, i candidati selezionati con BDs ottimale possono essere applicati per aumentare la produzione di anticorpi18,19,21. Attualmente, il campo terapeutico di RNA è drammaticamente in crescita. Per esempio, siRNA, ASO, mRNA e terapie CRISPR RNA, sono largamente impiegate per controllare l’espressione di mRNA dei loro rispettivi target9,32. In questo contesto, SINEUPs sono nella loro infanzia, ma finora nessuno l’ha studiato SINEUPs cambiato espressione di mRNA bersaglio. Inoltre, non modificare i SINEUPs mRNA di destinazione, ma solo su-regolare la traduzione di mRNA. Inoltre, perdita di funzione malattie derivanti dal haploinsufficiency possono essere mirate per terapia aumentandone, ottenendo una volta 2 induzione della proteina carente17,33. Anche se fuori bersaglio effetti devono essere ulteriormente studiati, SINEUPs, potenzialmente e specificamente di destinazione un mRNA singolo, espresso con una sequenza complementare al BD.
Una limitazione del presente protocollo ad alta velocità è che non è adatto a schermo BDs di SINEUPs in modelli di topo in vivo poiché le misure del protocollo la GFP integrato intensità solo. Come SINEUPs sono lncRNAs antisenso naturali che agiscono appaiamento, non possono essere applicati quando la destinazione mRNA è mancante nelle cellule o i campioni di tessuto.
Tuttavia, SINEUPs può essere applicato agli studi di guadagno di funzione, per migliorare la produzione di anticorpi e come terapia RNA di up-regolare l’espressione di proteine carenti all’interno della gamma di 1.5-3.0-fold. I metodi descritti qui presentano una guida utile per indirizzare e rilevare potenziamento indotto da aumentandone traduzione di mRNA desiderata e fornire un nuovo strumento per la regolazione genica post-trascrizionale.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto in parte dalla scienza di base e piattaforma tecnologia Program per medicina biologica innovativa, Nr. 17 am 0301014, dall’Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED), assegno di ricerca dal MEXT al RIKEN Center for Life Tecnologie di scienza e un assegno di ricerca dal MEXT a IMS RIKEN. Ringraziamo i membri del laboratorio PC e della rete aumentandone (SISSA, Università del Piemonte orientale e RIKEN) per discussioni stimolanti. Ringraziamo il dottor Matthew Valentine per correzione di bozze.
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |