SINEUPs er syntetiske antisense ikke-koding RNAs, som inneholder en bindende domene (BD) og et effektor domene (ED) og opp-regulere oversettelse av målrette mRNA. Her beskriver vi gjenkjenningsmetoder for SINEUPs i kulturperler cellelinjer, analyse av deres oversettelse-fremme ved Western blot og en semi-automatisert høy gjennomstrømning tenkelig system.
Mål-protein ekstrautstyr er viktig ikke bare for studiet av biologiske prosesser, men også for terapeutisk og bioteknologisk. Her presenterer vi en metode for å selektivt opp-regulere protein uttrykk for ønsket gener i kulturperler celler ved hjelp av syntetisk antisense ikke-koding RNAs kjent som SINEUPs. Denne positive kontrollen av genuttrykk på post-transcriptional nivå og utøves av en invertert kort avbrutt kjernefysiske element (SINE) gjenta nederst 3ʹ SINEUPs som omfatter sitt effektor domene (ED). SINEUPs kan spesielt bindes til et protein-koding mRNA gjennom sin bindende domene (BD), et område som er utformet for å utfylle sekvensen i 5ʹ uoversatt regionen (5ʹ UTR) og rundt start codon av mRNA valg. Mål-spesifikke SINEUPs utviklet på denne måten er transfekterte kulturperler celler, og protein og RNA pakkes for nedstrøms analyser, vanligvis 24-48 h etter hva. SINEUP-indusert protein opp-regulering oppdages av Western blot analyse og RNA uttrykk måles med sanntid kvantitative omvendt transkripsjon PCR. Vi har observert at BD design er avgjørende for å oppnå optimal SINEUP aktivitet og som tester ulike BD størrelsene og plasseringen med hensyn til start codon til målet mRNA anbefales. Derfor beskriver vi her en halvautomatisk høy gjennomstrømming bildebehandling metode basert på fluorescens oppdagelse som kan gjennomføres mot mRNA smeltet sammen med grønne fluorescerende protein (GFP). SINEUPs forbedre spesielt oversettelsen innenfor normale fysiologiske cellen, uten å endre transkripsjon målnivået. Denne metoden har vært vellykket ansatt mot en rekke endogene og ytre mål, i en rekke menneskelige, musen og insekt linjer sammen med i vivo systemer. Videre er SINEUPs rapportert å øke antistoffproduksjon og fungere som en RNA terapeutiske mot haploinsufficient gener. Allsidig og modulære natur SINEUPs gjør dem et egnet verktøy for gen-spesifikke translasjonsforskning kontroll.
I post-genom tid, mange innsikt har fått i genet regulatoriske rollene til ikke-koding antisense utskrifter på grunn av utviklingen av neste generasjons sekvensering teknologi1,2,3 og Gen-redigeringsverktøy. Denne kategorien av transkripsjoner, som ble tidligere regnet som “transcriptional trash”, er nå etablert som en sentral aktør i genetisk forskriften. Antisense utskrifter rapporteres å modulere chromatin og kontroll stabilitet og uttrykk for deres beslektet protein-koding følelse mRNA4,5. I de fleste tilfeller denne modusen for regulering er negativ og antisense utskrifter stillhet papirformat følelse gjennom RNA-RNA interaksjoner6,7. Denne egenskap av naturlige antisense transkripsjoner blitt benyttet til downregulate ønsket gener i form av syntetiske lite forstyrrende RNA (siRNA), microRNA (miRNA) og antisense oligos (ASO)8,9,10 ,11 forlate et teknologisk tomrom for målrettet genet opp-regulering.
En spennende studie forandret perspektivet til feltet for antisense RNA ved å demonstrere det antisense lenge ikke-koding RNAs (som lncRNAs) av genene Uchl1 (ubiquitin C-terminalen hydrolase L1) og Uxt (overalt uttrykt utskriften) positivt regulere oversettelse av deres beslektet forstand mRNA på post-transcriptional nivå i mus12. 5ʹ slutten av disse ispedd lncRNAs overlapper flere baser i 5ʹ uoversatt regionen (5ʹ UTR) i sine tilsvarende følelse transkripsjoner, og ikke-overlappende 3ʹ slutten inneholder en invertert gjentakelse av en retrotransposon tilhører kort kjernefysiske element (SINE) familie. Interessant, fant vi at den viktigste drivkraften bak denne translasjonsforskning opp-forskriften er innebygd sinus gjenta og det er ikke begrenset til musen sinus gjentar bare. Menneskelige Alu gjenta inneholder navnet som lncRNAs også forbedret oversettelse av målet fornuftig mRNAs, forsterker ideen om en roman klasse av sinus-drevet regulatoriske antisense ikke-koding RNAs, passende SINEUPs13. Studier viste at potensialet i naturlige SINEUPs beholdes i syntetisk SINEUPs designet spesielt mot ulike endogene og eksogene gener14,15. SINEUPs har to viktige funksjoner: første “bindende domene” (BD) hvilke er vanligvis 5ʹ slutten regionen utfyllende til sekvensen omfatter primært start codon av et protein-koding mRNA, og andre “effektor domain” (ED) som opptar en invertert gjentakelse av sinus som er en forutsetning for SINEUP funksjonen14 (figur 1). SINEUPs kan tilpasses for å designe en BD spesielt rettet mot et gen valgfrihet. Dette kan deretter bli brukt til å analysere funksjonen til et bestemt gen involvert i en biologisk sti, som et bedre alternativ til en konvensjonell mRNA overuttrykte strategi. Dessuten, denne allsidige verktøyet kan brukes til å øke antistoffproduksjon, og som et rusmiddel til å behandle haploinsufficient sykdommer forårsaket av utilstrekkelig dosering av funksjonelle proteiner16,17,18, 19,20,21.
Fordelene med SINEUP teknologi er mange. Det endrer ikke uttrykk for målet på transcriptional nivå. Lengre BDs gi mer spesifisitet for SINEUPs, mens ikke indusere en dsRNA-avhengige stress respons15. Protein induksjon opprettholdes innen normale fysiologiske cellen, hindrer noen skadelig effekt på grunn av avvikende eller overdreven protein uttrykk. SINEUPs er kompatible med en rekke musen, menneskelig, og hamster kultivert linjer, for eksempel HEK293T/17, HepG2, jakten, CHO, MN9D og mange flere12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs kan effektivt målrette endogene gener, transiently overexpressed gener og flagg-merket eller luciferase-fusion gener, eliminerer behovet av gen-spesifikke antistoffer14,18. Grunnleggende SINEUP analysen krever rutinemessig cellekultur, hva, natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), sanntid kvantitative omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) instrumenter og innstillinger, og kompetanse kan oppnås på kort tid.
Her beskriver vi en metode for målretting gener med syntetisk SINEUPs å opp-regulere oversettelse, en effekt i motsetning til andre teknologier som RNA forstyrrelser9 og ASO gapmers11,22,23. En brukte metoden for RNA-guidede genet aktivisering er gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar-basert aktivering (CRISPRa), hvor genuttrykk utløses på transcriptional nivå24. Denne metoden, men enkel og rask, krever flere enkelt guide RNAs (sgRNAs) rettet mot det samme genet for høyere effektivitet, og dermed øke sjansene for off-målet bindende25. I tillegg nøkkel enzymet CRISPRa systemet, katalytisk død CRISPR-assosiert protein 9 (dCas9) har lav bindende spesifisitet og sgRNAs rettet mot toveis promoter regioner kan nonspecifically opp-regulere i nærheten gener25. Derimot SINEUPs binde for å målrette mRNA på et enkelt bindende område med høy spesifisitet og påvirker ikke uttrykket av nærliggende gener. Vi diskuterer de grunnleggende trinnene involvert i SINEUP design, hva, protein og RNA uttrykk analyser. Videre, presenterer vi en halvautomatisk, høy gjennomstrømming tenkelig system til skjermen flere SINEUPs samtidig, som er nyttig for påvisning av optimal SINEUPs.
Vi beskrevet her en protokoll for å forbedre spesielt protein produksjon av et mål mRNA ved hjelp av en sinus-som inneholder ikke-koding RNA, kalt SINEUPs. Som et representativt eksempel er optimal syntetisk SINEUP-GFP vist å opp-regulere oversettelsen av GFP mRNA 2,6 målt ved Western blot analyse.
Utforme en optimal BD er avgjørende for å sikre SINEUP spesifisitet og styrke (omfanget av protein opp-regulering). Tidligere vi vist 17 BDs av SINEUP-GFP av Western blot analyse15 og fant at optimal BD overlapper august-KOZAK sekvensen av GFP mRNA, men ikke kan være tilfelle med andre mRNAs og bør kontrolleres for hvert enkelt tilfelle. En annen uavhengig gruppe også vist BD bruker en annen metode31. Som screening mange BDs kan være ganske tidkrevende og tungvint, innført vi en høy gjennomstrømming SINEUP oppdagelsen metoden her. Denne metoden måler relative endringer i GFP integrert tetthet i SINEUP transfekterte-celler i forhold til kontrollen vektor transfekterte-cellene. For å sikre at celler i en bestemt godt av en kultur plate er transfekterte like og GFP signalet er ikke konsentrert til bare et bestemt område av brønnen, er det svært viktig å distribuere cellene like i brønnene i trinn 2.1. For dette formålet, forsiktig riste platen 10 ganger og tilbake (↑↓) etter seeding cellene i en ren benk og gjenta i 5% CO2 inkubator før inkubasjon.
Et annet viktig skritt er beregningen av protein konsentrasjon i trinn 3.3. Feilberegninger her kan føre til lasting av en feilaktig mengde protein under Western blot analyse, dermed hindre oppdagelsen av små endringer i protein uttrykk av noen av de svake SINEUPs eller generere falske positiver fra overbelastning. Det anbefales å fersk forberede protein standardkurven hver gang, sørge for at like mye standarder og protein prøver måles i trinn 3.3.3. Protokollen beskrevet her fokuserer på SINEUP-GFP, men Western blot analyse kan brukes for alle mål mRNA rundt. Den inkubasjonstiden og konsentrasjonen av antistoffer skal være optimalisert for hvert mål å få det beste resultatet.
En av de unike funksjonene til SINEUPs er at målet-mRNA uttrykk nivå forblir upåvirket. Det er viktig å behandle RNA med DNase å unngå deteksjon av transfekterte SINEUPs og genomisk DNA ved qRT PCR. SINEUP RNAs og mRNA måluttrykk bør måles ved qRT PCR å bekrefte suksessen til både hva og SINEUP aktivitet. SINEUPs inneholder en sinus rekkefølge, som er over både menneskelige og mus genomer. For å unngå ikke-spesifikk SINUSEN sekvenser, anbefales det ikke å designe qRT PCR primere for sinus sekvensen.
Vi brukte humane cellelinjer i denne protokollen, men SINEUPs er effektiv i cellen linjer fra flere ulike arter12,13,14,18,19. Celle kultur og hva vilkårene kan endres etter ulike linjer som disse opprettholde transfection effektivitet av SINEUP vektorer. Videre kan alternative metoder for RNA utvinning, cDNA syntese og protein konsentrasjon kontroll anvendes, gitt at de bevare nødvendig RNA og protein kvaliteten for qRT PCR og Western blot analyse. Mens vi brukte en bestemt høy gjennomstrømming mikro-og cytometer, som aktivert påvisning av GFP fluorescens over hele brønnen, kan andre cytometers med en lignende rekkevidde være brukte31. Det skal bemerkes at hvis distribusjon av celler og hva er like gjennom en godt, så det ikke er nødvendig å skanne hele brønnen for GFP fluorescens: halvparten eller en fjerdedel av en godt kan være nok til å skjelne SINEUP effekten avhengig av eksperimentet Al ferdigheter.
Etablere en høy gjennomstrømming SINEUP oppdagelsen protokollen tillater samtidig screening av flere BDs målretting en gitt mRNA i kulturperler celler. Dette er viktig som reglene som styrer optimal målretting av BD er fortsatt uklart. Slike en multipleks screening systemet gir omfattende testing av mange SINEUPs mot ulike gener, nyttig for målretting flere gener involvert i en bestemt signalveien for eksempel. Videre kan det bli benyttet for å utvide søket etter effektive SINEUPs rettet mot flere mRNAs, designe forskjellige SINEUP BDs rundt august-Kozak regionen (se figur 1), co transfecting full lengde målet mRNAs (5ʹ UTR-CD-3ʹ UTR) smeltet sammen med GFP mRNA i kulturperler celler å finne optimal SINEUPs, og senere testing BD kandidater mot endogene mRNA i kulturperler celler og i vivo modell dyr, mennesker og mus til andre dyre- og plantelivet arter.
Dette screening er veldig rask. Vi trenger ikke å fikse og samle celler, men trenger bare å plassere levende celle kultur plate i tenkelig maskinen. Vi foreslår å bruk denne høy gjennomstrømming screening protokollen å velge optimal BDs av SINEUPs og vurdere potensielle kandidater ved Western blot analyse. Utvalgte kandidater med optimal BDs kan dermed brukes til å øke antistoff produksjon18,19,21. Foreløpig vokser feltet RNA terapeutiske dramatisk. For eksempel er siRNA, ASO, mRNA og CRISPR RNA terapier, viden ansatt til å styre mRNA uttrykk for deres respektive målene9,32. I denne sammenheng, SINEUPs er i sin barndom, men så langt ingen av de studerte SINEUPs endret uttrykk for målet mRNAs. I tillegg SINEUPs ikke Rediger målrette mRNA, men bare opp-regulere oversettelse av mRNA. Videre kan tap-av-funksjon sykdommer som følge av haploinsufficiency bli målrettet av SINEUP terapi, oppnå en 2-fold induksjon av mangelfull protein17,33. Selv om off-målet effekter trenger videre studier, målrette SINEUPs potensielt og spesifikt en enkelt, uttrykte mRNA med en utfyllende sekvens BD.
En begrensning av denne høy gjennomstrømming protokollen er at den ikke passer til skjermen BDs av SINEUPs i vivo musen modeller fordi protokollen tiltak GFP integrert intensitet bare. Som SINEUPs er naturlig antisense lncRNAs som fungerer post-transcriptionally, kan ikke de brukes når målet mRNA mangler i cellene eller vevsprøver.
SINEUPs kan imidlertid brukes til gevinst-av-funksjon studier, å forbedre antistoffproduksjon, og som en RNA therapy å opp-regulere uttrykk for mangelfulle proteiner i størrelsesorden 1,5-3.0-fold. Metodene som er beskrevet her presenterer en guide og oppdage SINEUP-indusert oversettelse forbedring av ønsket mRNA og gir et nytt verktøy for post-transcriptional gene regulering.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien var delvis støttet av grunnleggende vitenskap og plattform teknologien Program for nyskapende biologisk medisin, no. 17 er 0301014, fra Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling (AMED), forskningsstipend fra MEXT til RIKEN senteret for livet Vitenskapen teknologiene og et forskningsstipend fra MEXT til RIKEN IMS. Vi takker medlemmer av det PC og SINEUP nettverk (SISSA, Universitetet østlige Piemonte og RIKEN) for tankevekkende diskusjoner. Vi takker Dr. Matthew Valentine for korrekturlesing.
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |