SINEUPs är syntetiska antisense icke-kodande RNAs, som innehåller en bindande domän (BD) och en effektor domän (ED) och uppreglera översättning av rikta mRNA. Här beskriver vi detektionsmetoder för SINEUPs i odlade cellinjer, analys av deras översättning-främja aktivitet av Western-blot och en halvautomatisk hög genomströmning imaging system.
Riktad-protein förbättring är av betydelse inte bara för att studera biologiska processer, utan även för terapeutiska och biotekniska tillämpningar. Här presenterar vi en metod för att selektivt uppreglera proteinuttryck av önskad gener i odlade celler med hjälp av syntetiska antisense icke-kodande RNAs kallas SINEUPs. Denna positiva kontrollen av genuttryck är på post-transcriptional nivå och utövas av en inverterad kort interspersed nukleära element (sinus) Upprepa i 3ʹ slutet av SINEUPs som består av dess effektor domän (ED). SINEUPs kan specifikt binder till någon protein-kodning mRNA i val genom dess bindande domän (BD), en region som kompletterar sekvensen inom regionen 5ʹ oöversatta (5ʹ UTR) och runt den start Codonen på mRNA. Mål-specifika SINEUPs utformade på detta sätt är transfekterade att odlade celler och proteiner och RNA extraheras för nedströms analyser, normalt 24-48 h efter transfection. SINEUP-inducerad protein Uppregleringen detekteras av Western-blot analys och RNA uttryck är mätt med realtid kvantitativa omvänd Transkription PCR. Vi har observerat att BD design är avgörande för att uppnå optimal SINEUP aktivitet och att testa olika BD storlekar och ståndpunkter med avseende på den start-kodon målet mRNA rekommenderas. Därför beskriver vi här en halvautomatisk hög genomströmning bildgivande metod baserad på fluorescens upptäckt som kan genomföras till target mRNA smält med grönt fluorescerande protein (GFP). SINEUPs förbättra specifikt Översättning inom normala fysiologiska intervallet av cellen, utan att ändra avskrift målnivån. Denna metod har använts framgångsrikt mot ett spektrum av endogena och exogena mål, i en mängd olika mänskliga, mus och insekt cellinjer tillsammans med invivo system. SINEUPs har dessutom rapporterats öka antikroppsproduktion och arbeta som en terapeutisk mot haploinsufficient gener RNA. Den flexibla och modulära karaktären SINEUPs gör dem ett lämpligt verktyg för gen-specifika translationell kontroll.
I Postgenomisk eran, många insikter har fått in i gen reglerande roller av icke-kodande antisense avskrifter på grund av utvecklingen av nästa generations sekvensering teknik1,2,3 och gen-redigeringsverktyg. Denna kategori av avskrifter, som ansågs tidigare vara ”transkriptionell trash”, är nu etablerad som en nyckelaktör för genetiska regleringen. Antisense avskrifter rapporteras att modulera kromatin och kontrollen stabilitet och uttryck av deras cognate protein-kodning känsla mRNA4,5. I de flesta fall, denna förordning är negativa och antisense avskrifter tystnad motsvarigheterna känsla genom RNA-RNA interaktioner6,7. Detta drag av naturliga antisense avskrifter har använts till downregulate önskas gener i form av syntetiska små störande RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) och antisense oligos (ASO)8,9,10 ,11 lämnar ett tekniska tomrum för riktade upp-genreglering.
En spännande studie ändras fältet antisense-RNA perspektiv genom att påvisa att antisense länge icke-kodande RNAs (som lncRNAs) av generna Uchl1 (ubiquitin C-terminal hydrolas L1) och Uxt (ubiquitously uttryckta avskrift) positivt reglera översättning av deras besläktat känsla mRNA på post-transcriptional nivå i möss12. 5ʹ slutet av dessa interspersed som lncRNAs överlappar flera baser i 5ʹ oöversatta regionen (5ʹ UTR) bildregistreringar motsvarande känsla, och icke-överlappande 3ʹ slutet innehåller en inverterad upprepning av en retrotransposon tillhör kort kärn element (sinus) familj. Intressant nog fann vi att den främsta drivkraften bakom detta translationell Uppregleringen är inbäddade sinus upprepar och det är inte begränsat till mus sinus upprepar bara. Mänskliga Alu repeat-innehållande heter som lncRNAs också förbättrad översättning av målet känsla mRNA, förstärker idén om en ny klass av sinus-driven reglerande antisense icke-kodande RNAs, passande nog SINEUPs13. Senare studier visade att potentialen i naturliga SINEUPs bevaras i syntetiska SINEUPs som utformats för att specifikt mål olika endogena och exogena gener14,15. SINEUPs har två viktiga funktioner: första ”bindande domänen” (BD) som är allmänt 5ʹ slutet regionen komplement till sekvensen som omfattar primärt starta kodon en protein-kodning mRNA och andra ”effektor domänen” (ED) eftersom det inbegriper en inverterad upprepning av sinus vilket är en förutsättning för SINEUP funktion14 (figur 1). SINEUPs kan anpassas för att designa en BD särskilt inriktad på en gen av val. Detta kan sedan utnyttjas för att dissekera funktionen av en särskild gen som är involverade i en biologisk väg, som ett bättre alternativ till en konventionell mRNA överuttryck strategi. Dessutom Detta mångsidiga verktyg kan användas för att öka produktion av antikroppar, och som en drog att behandla haploinsufficient sjukdomar som orsakas av otillräckliga doser av funktionella proteiner16,17,18, 19,20,21.
Fördelar med SINEUP-teknik är många. Det förändrar inte uttrycket för målet på transkriptionell nivå. Längre BDs ge mer specificitet till SINEUPs, medan inte förmå en dsRNA-beroende stress svar15. Protein med induktion upprätthålls inom det normala fysiologiska intervallet av cellen, förebygga eventuella skadliga inverkan på grund av avvikande eller överdriven proteinuttryck. SINEUPs är kompatibel med en mängd olika mus, mänskliga, och hamster odlade cellinjer, exempelvis HEK293T/17, HepG2, HeLa, CHO, MN9D och många fler12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs kan effektivt rikta endogena gener, övergående överuttryckt gener och flaggan-märkta eller luciferas-fusion gener, eliminerande nöden av gen-specifika antikroppar14,18. Grundläggande SINEUP analysen kräver rutinmässig cellkultur, transfection, sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), realtid kvantitativa omvänd Transkription-polymerasen kedjar reaktion (qRT-PCR) instrument och inställningar, och kunskap kan vinnas på kort tid.
Här, beskriver vi en metod för att rikta gener med syntetiska SINEUPs att uppreglera översättning, en effekt tvärtemot andra tekniker såsom RNA interferens9 och ASO gapmers11,22,23. En allmänt använd metod för RNA-guidad gen aktivering är klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner-baserad aktivering (CRISPRa), där genuttrycket utlöses den transkriptionell nivå24. Denna metod, men enkel och snabb, kräver flera enda guide RNAs (sgRNAs) inriktning samma gen för högre effektivitet, vilket ökar chanserna för off-target bindande25. Det nyckel-enzymet av CRISPRa systemet, det katalytiskt döda CRISPR-associerade proteinet 9 (dCas9) har dessutom låg bindande specificitet och sgRNAs inriktning dubbelriktad arrangören regioner kan icke-specifikt uppreglera i närheten gener25. Omvänt SINEUPs binda för att rikta mRNA på en enda bindande region med hög specificitet och påverkar inte närliggande genuttryck. Vi diskutera de grundläggande stegen i SINEUP design, transfection, proteiner och RNA uttryck analyser. Dessutom presenterar vi en halvautomatisk, hög genomströmning imaging system skärm flera SINEUPs samtidigt, vilket är användbart för detektion av optimala SINEUPs.
Vi beskrivs här ett protokoll för att särskilt förbättra proteinproduktion av ett mål som mRNA med hjälp av en sinus-innehållande icke-kodande RNA, kallas SINEUPs. Som ett typexempel visas optimal syntetiska SINEUP-GFP att uppreglera översättningen av GFP mRNA 2.6-fold mätt med Western-blot analys.
Designa en optimal BD är avgörande för att säkerställa SINEUP specificitet och styrka (omfattningen av protein upp-förordning). Tidigare vi säkerhetskontrolleras 17 BDs av SINEUP-GFP med Western-blot analys15 och hittade att den optimala BD överlappar den AUG-KOZAK sekvensen av GFP mRNA, men det inte kanske är fallet med andra mRNA och bör kontrolleras för varje enskilt fall. En annan oberoende grupp screenas även BD använder en annan metod31. Som screening många BDs kan vara ganska tidskrävande och besvärligt, introducerade vi en hög genomströmning SINEUP detektionsmetod här. Denna metod mäter relativa förändringar i GFP integrerad täthet i SINEUP transfekterade-celler jämfört med kontroll vektor transfekterade-cellerna. För att säkerställa att celler i en särskild brunn kultur platta är transfekterade lika och god Jordbrukarsed signal inte är koncentrerad till endast en viss region i brunnen, är det mycket viktigt att distribuera cellerna lika i brunnarna i steg 2.1. För detta ändamål, försiktigt skaka plattan 10 gånger fram och tillbaka (↑↓) efter sådd cellerna inuti en ren bänk och upprepa i 5% CO2 inkubatorn innan inkubering.
Ett annat viktigt steg är beräkningen av proteinkoncentration i steg 3.3. Felbedömningar här kan leda till lastningen av en felaktig mängd protein under Western-blot analys, följaktligen att förhindra upptäckt av små förändringar i proteinuttryck av några av de svaga SINEUPs eller generera falsklarm från överbelastning. Det rekommenderas att färska förbereda protein standardkurvan varje gång, att se till att lika mängder standarder och protein prov mäts i steg 3.3.3. Protokollet beskrivs här fokuserar på SINEUP-GFP, men Western-blot analys kan användas för något rikta mRNA av intresse. De inkubationstid och koncentrationen av antikroppar bör optimeras för varje mål för att få bästa resultat.
En av de unika funktionerna i SINEUPs är att mål-mRNA uttryck nivå förblir opåverkad. Det är viktigt att behandla RNA med DNAS att undvika upptäckt av transfekterade SINEUPs och genomisk DNA av qRT-PCR. SINEUP RNAs och målet mRNA uttryck bör mätas med qRT-PCR bekräfta framgång både transfection och SINEUP aktivitet. SINEUPs innehåller en SINE sekvens, som är rikligt förekommande i hela både människan och mus genomen. För att undvika icke-specifik detektion av SINE sekvenser, rekommenderas det inte att utforma qRT-PCR primers till SINE sekvensen.
I detta protokoll vi används mänskliga cellinjer, men SINEUPs är effektiv i ett antal cellinjer från flera olika arter12,13,14,18,19. Cell kultur och transfection villkoren kan ändras enligt olika cellinjer så länge dessa behåller transfection effektivitet SINEUP vektorer. Dessutom kan alternativa metoder av RNA extraktion, cDNA syntes, och protein koncentration kontroll vara anställd, med tanke på att de bevara krävs RNA och protein för qRT-PCR och Western-blot analys. Medan vi använde en särskild hög genomströmning mikro-väl cytometer, som aktiverats detektion av GFP fluorescens över hela brunnen, kan andra cytometers med en liknande avkänningsområde vara begagnade31. Det bör noteras att om fördelningen av celler och transfection är lika i hela en väl, då det inte är nödvändigt att skanna hela brunnen för god Jordbrukarsed fluorescens: hälften eller en fjärdedel av området av en brunn kan vara nog att urskilja SINEUP effekt beroende på experiment Al färdigheter.
Att upprätta en hög genomströmning SINEUP detection protocol möjliggör samtidiga screening av flera BDs inriktning en given mRNA i odlade celler. Detta är viktigt eftersom reglerna för optimal inriktning av BD är fortfarande oklart. Sådan multiplex screening system möjliggör storskalig testning av många SINEUPs mot olika gener, användbar för inriktning flera gener inblandade i en viss signalväg för anföra som exempel. Dessutom det kan utnyttjas för att utöka sökandet efter effektiva SINEUPs inriktning flera mRNA, utforma olika SINEUP BDs runt AUG-Kozak region (se figur 1), Co transfecting fulla längd mål mRNA (5ʹ UTR-CD-skivor-3ʹ UTR) smält med GFP mRNA i odlade celler för att hitta optimal SINEUPs och därefter testa BD kandidater mot endogena mRNA i odlade celler och invivo modell djur, från människor och möss till andra Fridlysningsbestämmelserna.
Detta screening protokoll är mycket snabb. Vi behöver inte fixa och samla celler, men behöver bara placera levande cell kultur plattan i imaging instrumentet. Vi föreslår att använda detta high-throughput screening protokoll att välja optimal BDs av SINEUPs och utvärdera potentiella kandidater genom Western-blot analys. Valda kandidater med optimal BDs kan således tillämpas för att öka antikropp produktion18,19,21. För närvarande växer dramatiskt RNA terapeutiska området. Exempelvis är siRNA, ASO, mRNA och CRISPR RNA terapier, allmänt används för att kontrollera mRNA uttryck för deras respektive mål9,32. I detta sammanhang SINEUPs är i sin linda, men hittills ingen av de studerade SINEUPs förändrat uttryck av målet mRNA. Dessutom redigera SINEUPs inte rikta mRNA, men endast uppreglera översättning av mRNA. Dessutom kan förlust-av-funktion sjukdomar till följd av haploinsufficiency riktas av SINEUP behandling, att uppnå en 2-faldig induktion av de bristfälliga protein17,33. Även om off-target effekter behöver studeras ytterligare, rikta SINEUPs potentiellt och specifikt en enda, uttryckt mRNA med en kompletterande sekvens till BD.
En begränsning av hög genomströmning protokollet är att det inte är passande att skärmen BDs av SINEUPs i invivo musmodeller eftersom protokollet åtgärderna i GFP integrerat intensiteten bara. Som SINEUPs är naturliga antisense lncRNAs att agera post-transcriptionally, kan inte de tillämpas när målet mRNA saknas i celler eller vävnadsprover.
SINEUPs kan dock tillämpas till gain-of-function studier, att öka produktion av antikroppar, och som en RNA-terapi för att uppreglera uttrycket av bristfällig proteiner inom spänna av 1,5-3,0-fold. Metoderna som beskrivs här presenterar en användbar guide för att rikta och upptäcka SINEUP-inducerad översättning förbättring av önskad mRNA och ger ett nytt verktyg för post-transcriptional genreglering.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie var delvis stöds av grundläggande vetenskap och plattform Technology Program för innovativa biologisk medicin, nr 17 am 0301014, från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (AMED), forskningsanslag från MEXT till RIKEN Center for Life Science-teknologier och forskningsbidrag från MEXT till RIKEN IMS. Vi tackar medlemmar av de PC-labbet och SINEUP nätverket (SISSA, universitet i östra Piemonte och RIKEN) för tankeväckande diskussioner. Vi tackar Dr Matthew Valentine för korrekturläsning.
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |