Studiet af amfibie biologi giver værdifulde oplysninger om de reproduktive, fysiologiske, embryologiske og udviklingsmæssige processer, der drev organismer i mange taksonomiske grupper. Her præsenterer vi en omfattende vejledning om forskellige metoder, der kan bruges til at studere ovarie kontrol og overvågning i padder.
Ovarie kontrol og monitorering i padder kræver en mangesidet tilgang. Der er flere applikationer, der med succes kan fremkalde reproduktive adfærd og erhvervelse af kønsceller og embryoner til fysiologisk eller Molekylær forskning. Padder bidrager til en-12:45-tredjedel af hvirveldyr forskning, og af interesse i denne sammenhæng er deres bidrag til det videnskabelige samfunds viden om reproduktive processer og embryo logisk udvikling. Men det meste af denne viden er afledt af et lille antal arter. I den seneste tid, decimering af padder over hele kloden har krævet øget intervention af konservationister. Den bundne genopretning og sikkerhed kolonier, der fortsætter med at dukke op som reaktion på udryddelse risiko gøre eksisterende forskning og kliniske anvendelser uvurderlige for overlevelse og reproduktion af amfibier holdes under menneskelig pleje. Succes for enhver bundet befolkning er baseret på dens sundhed og reproduktion og evnen til at udvikle levedygtige afkom, der viderefører den mest forskelligartede genetiske repræsentation af deres arter. For forskere og dyrlæger er evnen til at overvåge og kontrollere ovarie udvikling og sundhed derfor bydende nødvendig. Fokus i denne artikel er at fremhæve de forskellige assisteret reproduktionsteknikker, der kan anvendes til at overvåge og, hvor det er relevant eller nødvendigt, kontrollere ovariefunktionen i padder. Ideelt set bør alle reproduktive og sundhedsmæssige spørgsmål reduceres gennem korrekt fangenskab, men som med ethvert dyr, er spørgsmål om sundhed og reproduktive patologier uundgåelige. Ikke-invasive teknikker omfatter adfærdsmæssige vurderinger, visuel inspektion og palpering og morphometriske målinger til beregning af krops tilstands indekser og ultralyd. Invasive teknikker omfatter hormonelle injektioner, blodprøvetagning, og kirurgi. Ovarie kontrol kan udøves på en række måder afhængigt af den ønskede applikation og arter af interesse.
Amfibier har længe været anerkendt som vigtige biologiske og medicinske modeller af en bred vifte af forskningsdiscipliner. Data indhentet ved at studere særlige arter såsom Xenopus laevis og X. tropicalis, Leopard Frog (Lithobates (tidligere Rana) Pipiens) og Axolotler (Ambystoma mexicanum) er blevet anvendt til en række andre hvirveldyr, herunder mennesker. De veterinære, husdyrhold og assisteret reproduktive teknikker, der er opstået ved at studere disse og andre padder yde bistand til dem, som har til opgave at udvikle vellykket pleje, vedligeholdelse og bæredygtighed af sjældnere populationer i fangenskab 1 , 2 , 3 , 4.
Interessen er stigende for den samtidige brug af in og ex situ bevarings baserede tilgange til at vende strømmen af udryddelse for mange i fare amfibie arter1,2. Denne artikel indeholder de metoder, der i øjeblikket er tilgængelige til at overvåge og kontrollere amfibie ovariefunktionen i model arter af Anuraner og hale. Desuden, eksisterende teknikker til at løse en fælles reproduktive patologi af ægopbevaring er præsenteret.
Som i mange taksonomiske grupper involverer Padde Ovarie kontrol en række tæt synkroniserede interaktioner mellem miljø og fysiologi. Temperatur og fotoperioden (kendt som nærtmere signaler) afkodes af øjet og hjernen, hvor de hurtigt omdannes til genetiske, hormonelle og cirkadiske processer (ultimative signaler)3,4. Metoderne til overvågning og kontrol af ovariefunktionen, der er omfattet af denne artikel, omfatter invasive og ikke-invasive teknikker. Institutionel dyrepleje-og anvendelses udvalg (IACUC) forsknings-og undervisnings krav definerer ikke-invasive teknikker som dem, der vil forårsage minimal til ingen fysisk smerte eller psykisk lidelse og kræver ingen smertestillende medicin5. Her omfatter ikke-invasive teknikker visuel inspektion og palpation, adfærdsmæssige observationer, morphometriske vurderinger og ultralyd. Tværtimod, de teknikker til blod opsamling, hormon administration og kirurgi (ovariektomi og fjernelse af opbevarede æg) er klassificeret som invasive, da de kan resultere i nogle smerter eller ubehag og kræver anæstesi eller post-proceduremæssig lægemiddelbehandling.
Ikke-invasive ovarie overvågningsteknikker kan nemt inkorporeres i den daglige pleje rutine for de fleste fanget padder. Afhængig af arten, æggestokkene graviditet kan ofte bestemmes ved simpel visuel inspektion (glas Frog). I andre tilfælde kan palpering indikere, om en kvindelig er gravid. Forskellige krops tilstands indekser (BCI) såsom vægt, snude urostyle længde (Sul), snude-vent længde (SVL) og standard Mass Index (SMI) er til rådighed for at forudsige tilstedeværelsen eller fraværet af æg4,6,7, 8,9. Dog bør man være forsigtig med fortolkningen af resultaterne, da de fleste ikke betragter alder, kropsform eller sammensætning (f. eks. vand tilbageholdt versus ovarie masse eller fedt)6. Definitive reproduktive diagnoser kan opnås via ultralyd med mere dybtgående viden om ægudvikling og iscenesættelse af æggestokkene cyklus4,7. Ultralyd giver også et middel til at bekræfte og overvåge reproduktive patologier og tilknyttede fysiologiske forhold4,8.
Ud over at give oplysninger om helbredstilstand, kan blodprøvetagning anvendes til at måle reproduktive hormoner. Hvis hormon profilering er det endelige mål, det er vigtigt at undgå stress-relaterede påvirkninger, der kan tolerere systemiske steroid data. Mens et potentielt kraftfuldt overvågningsværktøj, der er endnu ikke at være en undersøgelse viser medfødte Endokrinologiske reaktioner på eksogene hormon administration i nogen amfibie arter. Blod kan sikkert tages fra flere steder; i frøer dette omfatter ventrale abdominal vene, linguale plexus, femoral vene og hjerte9,10. I Caudates opsamles blod fra den ventrale hale vene. Graden af invasivitet, mængden af tilbageholdenhed kræves, behovet for bedøvelsesmiddel, delikatesse af organet er målrettet, og størrelsen af dyret er faktorer, der skal overvejes, når du vælger en samling teknik til amfibie patienten. Denne artikel vil præsentere teknikken til blod opsamling fra ansigtet maxillær eller musculocutaneous vene af frøer som oprindeligt beskrevet af Forzan et al.9.
Ovarie kontrol er artsspecifik og, som sådan, hormon protokoller bør testes og optimeres. Bortset fra sæsonudsving og det tilhørende cirkulerende hormon miljø kan ovarie kontrol også være tæt knyttet til alder, tid i fangenskab og udsættelse for gentagen hormon administration, hvor der kun er få oplysninger i litteraturen11 , 12 , 13. gennemførelsen af hormon behandlinger for at fremkalde reproduktiv adfærd, gamet produktion, modning og oviposition er blevet en meget rapporteret tilgang til at løse fælles reproduktive problemer forbundet med fangenskab4, 8,14,15,16. Da mekanismerne til kontrol af reproduktion i hvirveldyr er stærkt bevaret, findes der en række hormoner, neuropeptider og kommercielt tilgængelige lægemidler, der anvendes terapeutisk i andre taksonomiske grupper, som også kan anvendes pålideligt i en række amfibie arter (tabel 1). Gonadotropin releasing hormon (GnRH) og humant choriongonadotropin (HCG) (eller variationer heraf, dvs. PMSG og EKG)17,18, enten individuelt eller i kombination, har været anvendt i udstrakt grad i amfibie bundne avlsprogrammer, herunder: det sydlige Rocky Mountain Boreal (anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; TOAD, Dusky Gopher Frog, Rana sevosa (Langhorne et al., ikke offentliggjort)7; Gulf Coast waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming TOAD, Anaxyrus baxteri18; Bullfrog, Rana Rana21; den amerikanske TOAD, Anaxyrus americanus22; græs frøen, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactylus Coqui24; Xenopus, xenopus laevis25; Gunthers toadlet, Pseduophryne guentheri26; den nordlige Leopard Frog, Lithobates pipiens; den argentinske horned-Frog, Ceratophrys udsmykkede; cranwell’s hornede frø, C. cranwelli; den amerikanske jord-Frog, odontophrynus americanus27; og branden Salamander (Salamandra)228. Steroid hormoner, ligesom progesteron (P4), er mindre almindeligt rapporterede, men har vist god effekt i eliciterer ægløsning og oviposition i nogle arter af padder16,18,29. Prostaglandiner (især prostaglandin 2-alpha (PGF2α)) er involveret i ægløsning sammen med kortikosteroider30,31,32,34 og når høje niveauer under den ovulatoriske fase31.
I in vitro undersøgelser, PGF2α er en potent induktor af ægløsning31, mens in vivo det kan inducere oviposition af opbevarede æg i Rana muscosa4,30,32. Hypofyse ekstrakter er også effektive induktorer af ægløsning15,16,34; bekymringer vedrørende biosikkerhed og potentialet for sygdomsoverførsel er imidlertid ofte afskrækkende for avls kolonier i fangenskab, når de overvejer denne fremgangsmåde35.
Den sidste del af denne artikel detaljer kirurgiske procedurer og giver alternative tilgange til at udvide æggestokkene undersøgelser eller støtte med opløsningen af reproduktive patologier. Ovariectomies udføres oftest i padder for at få oocytter til embryo logisk forskning. Men, det kan også give et middel mod lagrede æg, når en anden muligheder mislykkes. Selv om denne procedure er invasiv, kræver fuld anæstesi og indsnit til at udsætte ægge masserne, det kræver ikke eutanasi. Desuden, efter partiel ovariektomi, dyr kan gøre en fuld helbredelse og fortsætte med at være reproductivt aktivpost-kirurgi8,36.
Protokollerne beskrevet nedenfor skitserer invasive og ikke-invasive metoder til ovarie kontrol og monitorering i Anuraner og hale. De specifikke arter, der udvælges til at illustrere teknikker i Anurans omfatter R. slimhinde og X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensis, og A. mexicanum omfatter de arter, der anvendes til tilsvarende beskrive teknikker i caudates.
Direkte håndtering, visuel observation og morphometriske foranstaltninger giver ikke-invasive teknikker og er de første vurderingskriterier for bestemmelse af kvindelig reproduktionsfase. Denne undersøgelse viser dog, at gravid ovarier ikke altid kan identificeres pålideligt ved palpation. Afhængigt af arten kan gravid æggestokke undertiden påvises visuelt gennem semi-gennemskinnelig (figur 13a, B) eller fuldstændig gennemsigtig hud på den ventrale side af dyret (figur 13c). Kvinder, der har afsluttet oviposition kan vise tydelige ændringer i deres udseende sammenlignet med gravid kvinder (f. eks løs hud og tab af op til 30% af deres kropsmasse, figur 13D). Under avl, hanner og hunner vil vise visse adfærd, der giver oplysninger om nærhed til ægløsning og oviposition. I tilfælde af R. muscosa indikationer på, at en kvindelig er tæt på oviposition begynde med den kvindelige ind i hånd stande.
Anvendelsen af ultralyd teknologi til Anurans og Caudates tillader diagnosticering af tilstedeværelse eller fravær af æg og om oviposition var forbundet med fuldstændig eller delvis frigivelse af udviklede æg. Således giver denne metode en mere fuldstændig og præcis vurdering af reproduktiv status uden at være begrænset til bestemmelse gravid/ikke-gravid status via en visualisering teknik, der varierer efter abdominal hud gennemsigtighed, eller epidermal konsistens blandt de forskellige amfibie arter. Ultralyd kan udføres med relativ lethed og med lidt stress til dyrene (figur 5 og Figur 13) og kan bruges til at karakterisere reproduktive cyklusser og til at bestemme reproduktions status4. Det er afgørende at blive fortrolig med arterne; denne undersøgelse viste imidlertid, at Necturus og R. muscosa har fælles udviklingsmæssige tegn i deres reproduktions mønstre, der giver mulighed for en tilsvarende klassificering af reproduktions stadiet (figur 5). Gennem denne teknologi er der nu beviser for, at ægudvikling er høj i fangenskab Necturus og R. muscosa , og at begge disse arter følger en sæsonbestemt mønster. Selv om årsagerne til disse fænomener er ukendte og kræver yderligere undersøgelse, uden brug af ultralyd, flere områder af æggestokkene dysfunktion, såsom æg retention og delvis oviposition, ville have gået uopdaget. Fremtidige anvendelser til denne teknik vil blive brugt til at afgøre, om kvinder skal udvælges til avl i et givet år, og om oviposition er komplet.
En blod indsamlings protokol, som den, der præsenteres i R. muscosa, som er både effektiv og forårsager minimal lidelse for dyret, er optimal til at studere hormon profiler i fangenskab og Vildtfangede anuraner (Calatayud, ikke offentliggjort). Til dato foreligger der ingen oplysninger om de årlige hormon profiler af captive R. muscosa og derfor ingen viden om, hvordan hormoner påvirker deres helbred og reproduktion. Desuden, med bevis for, at kvinder af denne art ikke kan være årlige opdrættere, hormonelle profilering vil være en anden metode til sporing af æggestokkene cyklusser. Sammen med ultralyd, hormon analyse kan føre til bedre forudsigelse af, hvad kvinder vil være klar til oviposition. Desuden er to tilfælde af interkønnet i den bundne R. muscosa -population blevet dokumenteret i det forløbne år. Desuden er udviklingen af tommelfinger Pads blevet noteret på nogle af de ældre stiftende kvinder. Årsagerne til dette er i øjeblikket under undersøgelse, men de første resultater tyder på, at det kan vedrøre ændringer i testosteronniveauer (Calatayud, ikke offentliggjort). Kræsne hormonelle cyklusser hos kvinder i forskellige aldre vil hjælpe os med at forstå, hvorfor kvinder kan udvikle mand-associerede sekundære seksuelle karakteristika, og om dette forventes i en aldrende befolkning.
Udefrakommende hormonbehandling er blevet brugt til at overvinde reproduktive dysfunktioner ofte stødt på fangenskab amfibier. Men for både R. muscosa og necturus populationer i denne undersøgelse, ingen signifikante forskelle i oviposition mellem hormon-behandlede og kontrol hunner blev påvist over en 2 og 5-årig periode, hhv. Dette kan indikere, at hormon administration protokol, doser, priming og hormon kombination anvendes ikke var tilstrækkelig for arten. En nærmere analyse af de enkelte kvindelige reproduktions historier antyder, at R. muscosa ikke kan opleve en årlig avl, hvilket også kan være en følge af den manglende hormonelle virkning hos behandlede kvinder. Fordi en vis procentdel af kvinder konsekvent sprunget avl hvert år, forstå den naturlige historie af arterne kan hjælpe med at afgøre, om der er behov for udefrakommende hormoner, og når de kan være mest effektive. De procedurer, der er skitseret i denne artikel kan anvendes på en række arter, (tabel 1) og er for anurere spænder fra 5 g til 150 g; større dyr kan kræve forskellige sprøjter og nåle målere. Injektionsstedet varierer med nogle hormoner, der kræver intra-muskuløs, intra-peritoneal, subkutan eller intradermal injektion (figur 7).
Kirurgi med henblik på ovariektomi er en almindelig metode, der anvendes i forskellige amfibie arter for at opnå oocytter til embryologiske undersøgelser. Ovariektomi kan også være indiceret til populations kontrol og medicinske spørgsmål såsom ægretention. I tilfælde af partielle ovariectomier, hvor der udføres oocyt-høst til forskningsformål, skal operationen sikre, at dyret forbliver reproduktions ligt. Administration af PGF2α har vist nogle løfte om at løse ægretention i kvindelige R. muscosa. I flere individer fremkaldte PGF2α fuldstændig deposition af tidligere opbevarede æg, men i andre var der kun delvis aflejring, som krævede manuel stripping for at fjerne alle æggene. Mens PGF2α kan tjene som et alternativ til kirurgi for Ægretention i R. muscosa, dens evne til at afhjælpe lignende patologiske tilstande i andre padder vil kræve artsspecifik validering. Når kirurgisk indgreb er bemyndiget til Anuran eller hale patient, er det nødvendigt at sikre et passende plan for anæstesi, før indsnit er lavet. Astute observation færdigheder er nødvendige for at vurdere og overvåge de normative induktion og nyttiggørelse svar som skitseret i denne undersøgelse for hver af taxa. Når man er fortrolig med den specifikke anatomi, en passende kirurgisk tilgang, hæmostase, blid vævs manipulation og passende postoperative forvaltning, reproduktive operationer udgør ingen overvældende forhindringer.
The authors have nothing to disclose.
Natalie Calatayud vil gerne takke Dr. Barbara Durrant for uddannelse og assistance med ultralyd og Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) for tildeling af økonomisk støtte til min forskning Associate position på SDZG. Tak til Dr. Kylie Cane for kommentarer til manuskriptet samt til de officielle anmeldere (hvem de end måtte være). Tak til Jonathan Dain vores 2018 sommer stipendiat, San Diego Zoo Institut for bevaring forskning for at give billeder (figur 1a, B). Monica stoops udvider påskønnelse til sammenslutningen af zoologiske haver og akvarier Conservation fond og Disney verdensomspændende bevarings fond for at yde økonomisk støtte til at etablere den bundne Necturus befolkning. Desuden blev støtten også modtaget via private donationer fra padde Advocate MS. iris de la Motte. Tak, er givet til hr. Christopher DeChant og Dr. Mark Campbell for deres betydelige bidrag til forskningen.
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
Hormone | |||
Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |