Studiet av amfibiobiologi ger värdefull information om de reproduktiva, fysiologiska, embryologiska och utvecklingsprocesser som driver organismer i många taxonomiska grupper. Här presenterar vi en omfattande guide om olika metoder som kan användas för att studera ovariell kontroll och övervakning i amfibier.
Ovariell kontroll och övervakning i amfibier kräver en mångfacetterad strategi. Det finns flera program som framgångsrikt kan framkalla reproduktions beteenden och förvärvet av könsceller och embryon för fysiologisk eller molekylär forskning. Amfibier bidra till en-12:45-tredjedel av ryggradsdjur forskning, och av intresse i detta sammanhang är deras bidrag till det vetenskapliga samfundet kunskap om reproduktions processer och embryologisk utveckling. Men de flesta av dessa kunskaper kommer från ett litet antal arter. På senare tid har decimering av amfibier över hela världen krävt ökat ingripande av naturvårdare. De captive-och säkrande kolonierna som fortsätter att dyka upp som svar på risken för utrotning gör befintliga forsknings-och kliniska tillämpningar ovärderliga för överlevnad och reproduktion av amfibier som hålls under mänsklig vård. Framgången för någon fångenskap befolkningen bygger på dess hälsa och reproduktion och förmågan att utveckla livskraftiga avkomma som bär fram den mest varierande genetiska representationen av deras arter. För forskare och veterinärer, förmågan att övervaka och kontrollera äggstocks utveckling och hälsa är därför absolut nödvändigt. Fokus i denna artikel är att belysa de olika assisterad reproduktionsteknik som kan användas för att övervaka och, när det är lämpligt eller nödvändigt, kontrollera äggstocksfunktion i amfibier. Helst bör alla reproduktiva och hälsofrågor minskas genom ordentlig uppfödning, men som med alla djur, frågor om hälsa och reproduktiv patologier är oundvikliga. Icke-invasiva tekniker inkluderar beteendemässiga bedömningar, visuell inspektion och palpation och morphometriska mätningar för beräkning av kroppens kondition index och ultraljud. Invasiva tekniker inkluderar hormonella injektioner, blodprovstagning, och kirurgi. Äggstocks kontroll kan utövas på flera olika sätt beroende på vilken ansökan som krävs och arter av intresse.
Amfibier har länge erkänts som viktiga biologiska och medicinska modeller av ett brett spektrum av forskningsdiscipliner. Uppgifter som erhållits genom att studera särskilda arter som Xenopus laevis och X. tropicalis, leopardgrodan (Lithobates (tidigare Rana) Myggan) och axolotl (Ambystoma mexicanum) har tillämpats på ett antal andra ryggradsdjur, inklusive människor. Veterinär-, djurhållnings-och assisterad befruktning som har uppstått genom att studera dessa och andra amfibier ge stöd till dem som har till uppgift att utveckla framgångsrik vård, underhåll och hållbarhet av ovanligare populationer i fångenskap 1 , 2 , 3 , 4.
Intresset för samtidig användning av in-och ex situ-naturskyddsbaserade metoder för att vända utrotnings tiden för många i riskzonen amfianarter1,2. Denna artikel innehåller de metoder som för närvarande finns tillgängliga för att övervaka och kontrollera amfibier funktionen i modell arter av anurans och Caudates. Dessutom, befintliga tekniker för att ta itu med en gemensam reproduktiv patologi av ägg retention presenteras.
Som i många taxonomiska grupper, Amfibie ovariell kontroll innebär en rad tätt synkroniserade interaktioner mellan miljö och fysiologi. Temperatur och den fotoperiod (känt som närliggande signaler) avkodas av ögat och hjärnan där de snabbt omvandlas till genetiska, hormonella och cirkadiska processer (ultimata signaler)3,4. Metoderna för att övervaka och kontrollera äggstocks funktionen som beskrivs i denna artikel inkluderar invasiva och icke-invasiva tekniker. Institutionsvård och användning kommittén (IACUC) forskning och undervisning krav definiera icke-invasiva tekniker som de som kommer att orsaka minimal till ingen fysisk smärta eller psykisk stress och kräver inga smärtstillande läkemedel5. Här, icke-invasiva tekniker inkluderar visuell inspektion och palpation, beteendemässiga observationer, morfometriska bedömningar och ultraljud. Tvärtom, de metoder för blod insamling, hormon administration och kirurgi (ovariektomi och avlägsnande av kvarhållna ägg) klassificeras som invasiva eftersom de kan resultera i viss smärta eller obehag och kräver anestesi eller post-processuella läkemedelsbehandling.
Icke-invasiva ovariell övervakning tekniker kan enkelt införlivas i den dagliga vården rutin för de flesta captive amfibier. Beroende på arten, äggstocks graviditet kan ofta bestämmas genom enkel visuell inspektion (glas groda). I andra fall kan palpation indikera om en hona är dräktig. Olika organ tillstånds index (BCI) såsom vikt, nos urostyle längd (Sul), nos-Vent längd (SVL) och standardmassa index (SMI) finns tillgängliga för att förutsäga förekomst eller frånvaro av ägg4,6,7, 8,9. Emellertid, försiktighet bör iakttas med tolkningen av resultaten som de flesta inte anser ålder, kroppsform eller sammansättning (t. ex., vatten kvar kontra äggstocks massa eller fett)6. Slutgiltiga reproduktions diagnoser kan uppnås via ultraljud med mer djupgående kunskap om ägg utveckling och iscensättning av äggstocks cykeln4,7. Ultraljud ger också ett sätt att bekräfta och övervaka reproduktiva patologier och tillhörande fysiologiska villkor4,8.
Förutom att ge information om hälsostatus kan blodprovstagning användas för att mäta reproduktionshormoner. Om hormon profilering är det slutliga målet, det är viktigt att undvika stressrelaterade influenser som kan blanda ihop systemiska steroid data. Medan ett potentiellt kraftfullt övervakningsverktyg, det finns ännu inte en studie som visar medfödda endokrinologiska svar på EXOGEN hormon administration i någon amfibo arter. Blod kan säkert tas från flera platser; i grodor Detta inkluderar ventrala buk venen, linguala plexus, lår bens ven och hjärta9,10. I Caudates, blod samlas in från ventrala svans ven. Graden av invasivitet, mängden återhållsamhet som krävs, behovet av bedövningsmedel, den delikatess av det organ som riktas, och storleken på djuret är faktorer som skall beaktas när man väljer en insamlings teknik för den amfianska patienten. Denna artikel kommer att presentera tekniken för blod insamling från ansiktet maxillary eller musculocutaneous ven av grodor som ursprungligen beskrevs av Forzan et al.9.
Ovariell kontroll är artspecifika och, som sådan, hormon protokoll bör testas och optimeras. Annat än säsongsvariationer och tillhörande cirkulerande hormon miljö, äggstocks kontroll kan också vara tätt kopplade till ålder, tid i fångenskap och exponering för upprepad hormon administration, för vilka det finns lite information i litteraturen11 , 12 , 13. genomförandet av hormonbehandlingar för att framkalla reproduktiva beteenden, könscell produktion, mognad och oviposition har blivit ett allmänt rapporterat tillvägagångssätt för att lösa gemensamma reproduktiva problem i samband med fångenskap4, 8,14,15,16. Eftersom mekanismerna för att kontrollera reproduktion hos ryggradsdjur är starkt bevarade finns det ett antal hormoner, neuropeptider och kommersiellt tillgängliga läkemedel som används terapeutiskt i andra taxonomiska grupper som också kan användas på ett tillförlitligt sätt i ett antal groddfisk (tabell 1). Koriongonadotropin releasing hormon (GnRH) och humant koriongonadotropin (hCG) (eller varianter därav, dvs, pmsg och EKG)17,18, antingen individuellt eller i kombination, har använts i stor utsträckning i amfii fångenskap avelsprogram inklusive: Southern Rocky Mountain Boreal (Anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; toaden, Dusky gopher groda, Rana sevosa (Langhorne et al., opublicerade)7; Gulf Coast Waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming padda, Anaxyrus baxteri18; bullgrodan, Rana av21; Amerikanen toaden, Anaxyrus americanus22; gräs grodan, Lymnodyaster tasmaniensis23; den Coqui, Eleutherodactylus Coqui24; Xenopus, Xenopus laevis25; den Gunther ‘ s toadlet, Pseduophryne guentheri26; den norra leoparden groda, Lithobates Myggan; den argentinska Horned-groda, Ceratophrys utsmyckade; den Cranwell ‘ s Horned-groda, C. cranwelli; den amerikanska Ground-Frog, Odontophrynus americanus27; och branden Salamander (Salamandra)228. Steroidhormoner, som progesteron (P4), är mindre vanligt rapporterade men har visat god effekt i framkalla ägglossning och oviposition hos vissa arter av anurans16,18,29. Prostaglandiner (särskilt prostaglandin 2-alfa (PGF2α)) är involverade i ägglossningen tillsammans medkortikosteroider 30,31,32,34 och nå höga nivåer under den ovulatoriska fasen31.
I in vitro-studier är PGF2 α en potent inducerare av ägglossningen31, medan in vivo kan inducera oviposition av behållna ägg i Rana muscosa4,30,32. Hypofys extrakt är också effektiva inducerare av ägglossning15,16,34; farhågor kring biosäkerhet och potentialen för sjukdomsspridning är dock ofta avskräckande för häckningskolonier i fångenskap när man överväger detta tillvägagångssätt35.
Den sista delen av denna artikeldetaljer kirurgiska ingrepp och ger alternativa metoder för att expandera äggstocks studier eller stöd med upplösningen av reproduktiv patologier. Ovariectomies är vanligast utförs i amfibier att få oocyter för embryologisk forskning. Emellertid, det kan också ge ett botemedel för kvarhållna ägg när ett annat alternativ misslyckas. Även om detta förfarande är invasiv, kräver full anestesi och snitt för att exponera ägg massorna, det kräver inte eutanasi. Dessutom, efter partiell ovariektomi, djur kan göra en fullständig återhämtning och fortsätta att vara reproducerbara aktiva efter operationen8,36.
De protokoll som beskrivs nedan beskriver invasiva och icke-invasiva metoder för ovariell kontroll och övervakning i anurans och Caudates. De särskilda arter som valts för att illustrera tekniker i anurans inkluderar R. slemhinnan och X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensisoch A. mexicanum omfattar de arter som används för att på liknande sätt beskriva tekniker i caudates.
Direkt hantering, visuell observation och morphometriska åtgärder ger icke-invasiva tekniker och är de första bedömningskriterierna för att bestämma kvinnlig fortplantnings fas. Denna studie visar dock att dräktiga äggstockar inte alltid kan identifieras på ett tillförlitligt sätt genom palpation. Beroende på art kan dräktiga äggstockar ibland visuellt upptäckas genom halvgenomskinliga (figur 13a, B) eller helt genomskinlig hud på den ventrala sidan av djuret (figur 13c). Kvinnor som har genomgått oviposition kan visa uppenbara förändringar i sitt utseende jämfört med dräktiga honor (t. ex. lös hud och förlust på upp till 30% av kroppsmassan, figur 13D). Under avel, män och kvinnor kommer att visa vissa beteenden som ger information om närhet till ägglossning och oviposition. När det gäller R. muscosa indikationer på att en hona är nära oviposition börja med den kvinnliga in hand stativ.
Tillämpningen av ultraljud teknik för att anurans och Caudates tillåter diagnos av förekomst eller frånvaro av ägg och om oviposition var förknippad med fullständig eller partiell frisättning av utvecklade ägg. Sålunda, denna metod ger en mer komplett och korrekt bedömning av reproduktiv status utan att vara begränsad till att fastställa dräktig/icke-dräktig status via en visualiseringsteknik som varierar med buken huden öppenhet, eller epidermal konsistens bland de olika amfikrararterna. Ultraljud kan utföras med relativ lätthet och med lite stress för djuren (figur 5 och figur 13) och kan användas för att karakterisera reproduktionscykler och för att bestämma reproduktions status4. Det är viktigt att bekanta sig med arten; denna studie visade dock att Necturus och R. muscosa har gemensamma utvecklings tecken i sina reproduktions mönster som möjliggör liknande klassificering av reproduktions stadiet (figur 5). Genom denna teknik finns det nu belägg för att ägg utvecklingen är hög i fångenskap Necturus och R. muscosa och att båda dessa arter följer ett säsongsbetonat mönster. Även om orsakerna till dessa fenomen är okända och kräver ytterligare utredning, utan användning av ultraljud, flera områden av ovariell dysfunktion, såsom ägg retention och partiell oviposition, skulle ha gått oupptäckt. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att användas för att avgöra om honor bör väljas ut för avel under ett givet år och om oviposition är klar.
Ett blod insamlings protokoll, som det som presenteras i R. muscosa, som är både effektivt och orsakar minimalt lidande för djuret, är optimalt att studera hormon profiler i fångenskap och vildfångad anurans (Calatayud, opublicerade). Hittills finns ingen information om den årliga hormon profiler av Captive R. muscosa och, därför, ingen kunskap om hur hormoner påverkar deras hälsa och reproduktion. Dessutom, med bevis för att honor av denna art inte kan vara årliga uppfödare, hormonella profilering kommer att vara en annan metod för att spåra äggstockarna cykler. Tillsammans med ultraljud, hormon analys kan leda till bättre förutsägelse av vad honor kommer att vara redo för oviposition. Under det gångna året har dessutom två fall av intersexuella i den företagsinterna R. muscosa -populationen dokumenterats. Dessutom har utvecklingen av tumme kuddar noterats på några av de äldre grundande honor. Orsakerna till detta är för närvarande under utredning men initiala resultat tyder på att det kan avse förändringar i testosteronnivåer (Calatayud, opublicerade). Kräsna hormonella cykler hos kvinnor i olika åldrar kommer att hjälpa oss att förstå varför honor kan utveckla manliga-associerade sekundära sexuella egenskaper och om detta är att förväntas i en åldrande befolkning.
Exogent hormonbehandling har använts för att övervinna reproduktiv dysfunktioner som ofta påträffas i fångenskap amfibier. Emellertid, för både R. muscosa och Necturus populationer i denna studie, inga signifikanta skillnader i oviposition mellan hormon-behandlade och kontroll kvinnor upptäcktes under en 2 och 5-års period av tid, respektive. Detta kan tyda på att hormon administration protokoll, doser, priming och hormon kombination som används inte var tillräcklig för arten. Närmare analys av enskilda kvinnliga reproduktiva historier antyder R. muscosa får inte uppleva årlig avel, som också kan redogöra för bristen på hormonell effekt observerades hos behandlade honor. Eftersom en viss andel av kvinnor konsekvent hoppade avel varje år, förstå den naturliga historia av arterna kan hjälpa till att avgöra om det finns ett behov av exogena hormoner och när de kan vara mest effektiva. De förfaranden som beskrivs i denna artikel kan tillämpas på ett antal arter, (tabell 1) och är för anurans som sträcker sig från 5 g till 150 g; större djur kan kräva olika sprutor och nålmätare. Placeringen av injektionen varierar med vissa hormoner som kräver intramuskulös, Intra-peritoneal, sub-kutan eller intradermal injektion (figur 7).
Kirurgi i syfte att ovariektomi är en vanlig metod som används i olika amfibo arter för att få oocyter för embryologiska studier. Ovariektomi kan också anges för befolkningskontroll och medicinska problem såsom ägg retention. Vid partiella ovariektomi där äggcell skörd utförs i forskningssyfte måste kirurgi säkerställa att djuret förblir reproduktivt. Administrering av PGF2α har visat några löfte att lösa ägg retention i kvinnlig R. muscosa. Hos flera individer, PGF2α framkallade fullständig avsättning av tidigare bevarade ägg, men i andra endast partiell deposition inträffade kräver manuell strippning för att ta bort alla ägg. Medan PGF2 α kan fungera som ett alternativ till kirurgi för ägg retention i R. muscosa, dess förmåga att avhjälpa liknande patologiska förhållanden i andra amfibier kommer att kräva artspecifika validering. När kirurgiska ingrepp är i uppdrag för Anuran eller Caudate patienten, är det nödvändigt att säkerställa ett adekvat plan av anestesi innan snitt görs. Skarpsinnig observation färdigheter behövs för att bedöma och övervaka de normativa induktion och återhämtning svar som beskrivs i denna studie för varje taxa. När man är bekant med den specifika anatomin, en lämplig kirurgisk strategi, hemostas, mild vävnads manipulation och adekvat postoperativ hantering, reproduktiv operationer utgör inga överväldigande hinder.
The authors have nothing to disclose.
Natalie Calatayud vill tacka Dr Barbara Durrant för utbildning och hjälp med ultraljud och Exploradora de immuebles, S.A. (EISA) för att bevilja ekonomiskt stöd till min forskarassistent position på SDZG. Tack till Dr Kylie Cane för kommentarer till manuskriptet samt till de officiella granskarna (vem de än kan vara). Tack till Jonathan Dain vår 2018 sommar Fellow, San Diego Zoo Institutet för bevarande forskning för att tillhandahålla bilder (figur 1a, B). Monica Stoops förlänger uppskattning till föreningen för djurparker och akvarier bevarande kapital fond och Disney Worldwide Conservation Fund för att ge ekonomiskt stöd för att etablera fångenskap Necturus befolkningen. Dessutom, stöd mottogs också genom privata donationer från amfile advokat MS Iris de La Motte. Tack, ges till Mr Christopher DeChant och Dr Mark Campbell för deras betydande bidrag till forskningen.
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
Hormone | |||
Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |