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Bioengineering

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

doi: 10.3791/58954 Published: March 15, 2019

Summary

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

Abstract

제 3 세대 단일 분자 DNA 시퀀싱 기술 제공 훨씬 더 이상 읽을 길이 복잡 한 유전자 및 복잡 한 구조 이체의 분석의 어셈블리를 촉진할 수 있다. Nanopore 플랫폼 직접 숨 구멍을 통해 DNA 통행에 의해 중재 현재 변화를 측정 하 여 단일 분자 시퀀싱을 수행 하 고 최소한의 자본 비용으로 kilobase (kb) 읽기의 수백을 생성할 수 있습니다. 이 플랫폼은 다양 한 응용 프로그램에 대 한 많은 연구자에 의해 채택 되었습니다. 긴 연속 읽기 길이 달성 nanopore 시퀀싱 플랫폼의 가치를 활용 하는 가장 중요 한 요소입니다. 매우 긴 읽기를 생성 하려면 특별 한 고려 DNA 파손 방지 및 생산성 시퀀싱 서식 파일을 생성 하는 효율을 얻이 필요 합니다. 여기, 우리는 매우 긴 DNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 셀, 기계적 전단 또는 transposase 조각화, 도서관 건축에서에서 고 분자량 (HMW) DNA 추출 및 nanopore 장치에서 시퀀싱의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. HMW DNA의 20-25 µ g에서 메서드 N50 읽기 50-70 kb 기계적 전단의 길이 달성할 수 있다 고 90-100의 transposase 길이 읽기 N50 중재 조각화 합니다. 프로토콜 구조 변형 및 게놈 어셈블리의 검색을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 수행 하기 위해 포유류 세포에서 추출한 DNA를 적용할 수 있습니다. DNA 추출 및 효소 반응에 대 한 추가 개선 또한 읽기 길이 증가 하 고 그것의 유틸리티를 확장 합니다.

Introduction

지난 10 년 동안 대규모 병렬 하 고 매우 정확 하 게 2 세대 높은 처리량 시퀀싱 기술 주도 생물 발견 및 기술 혁신1,2,3의 폭발. 기술 진보에도 불구 하 고 2 세대 플랫폼에 의해 생성 된 짧은 읽기 데이터 복잡 한 게놈 영역 해결에 효과가 및 게놈 구조 변형 (SVs), 인간에서 중요 한 역할을의 검출에 제한 됩니다. 진화와 질병4,5. 또한, 짧은 읽기 데이터 반복 변화를 확인할 수 없습니다 하 고 분별 haplotype 유전 이체6의 단계적 적합 하지 않습니다.

단일 분자 시퀀싱 제공 훨씬 더 최근 진행 길이, SVs7,,89, 전체 스펙트럼 및 제공 정확 하 고 완벽 한 복잡 한 검색을 용이 하 게 수 읽기 미생물 및 포유류 게놈6,10. Nanopore 플랫폼 직접 모11,,1213DNA 통행에 의해 중재 현재 변화를 측정 하 여 단일 분자 시퀀싱을 수행 합니다. 모든 기존 DNA 시퀀싱 화학, 달리 nanopore 시퀀싱을 생성할 수 있습니다 오래 (kilobases 수천 수만) 읽기 실시간 중 합 효소 활동에 의존 하지 않고 또는 인공 DNA 샘플의 증폭. 따라서, nanopore 긴-읽기 (NLR-seq) 낮은 복잡성 또는 반복 풍부한에서 특히 크게 게놈 및 생물 의학 분석14사전 것, 100kb 이상의 매우 긴 읽기 길이 생성 하기 위한 위대한 약속을 보유 하 고 시퀀싱 게놈15의 영역입니다.

Nanopore 시퀀싱의 독특한 기능은 잠재적인 긴 생성을 이론적인 길이 제한 없이 읽습니다. 따라서, 읽기 길이 DNA 무결성 및 시퀀싱 템플릿 품질에 의해 영향을 받는 직접 DNA의 물리적 길이에 따라 달라 집니다. 또한, 조작 및 단계, pipetting 세력 및 추출 조건 등의 수의 정도 따라 DNA의 품질이 매우 다양 합니다. 따라서, 그것은 단지 표준 DNA 추출 프로토콜 및 제조업체의 제공 된 라이브러리 공법을 적용 하 여 긴 읽기를 한 도전 이다. 이 끝으로, 우리는 강력한 개발 했습니다 매우 긴 생성 하는 방법 읽기 (kilobases 수백) 시퀀싱 데이터 수확된 셀 펠 릿에서 시작. 우리는 DNA 추출 및 라이브러리 준비 절차에서 여러 개선 채택. 우리는 DNA 저하 및 손상 시키는 불필요 한 절차를 제외 하려면 프로토콜을 간소화. 이 프로토콜은 고 분자량 (HMW)의 구성 된 DNA 추출, 매우 긴 DNA 도서관 건축 및 연속 nanopore 플랫폼에. 잘 훈련 된 분자 생물학에 대 한 일반적으로 걸리는 6 h HMW DNA 추출, 90 분 또는 도서관 건설 깎는 방법, 그리고 DNA 연속을 위한 추가 48 h 8 h의 완료에 수확 하는 세포에서. 프로토콜을 사용 하는 게놈 복잡성에 대 한 우리의 이해를 개선 하 여 인간의 질병에 게놈 변이에 새로운 통찰력을 얻을 유전체학 커뮤니티 권한을 부여 합니다.

Protocol

참고: NLR seq 프로토콜 3 연속 단계로 구성: 1) 추출 높은 분자의 무게 (HMW) 게놈 DNA; 2) 매우 긴 DNA 도서관 건설, 원하는 크기로 HMW DNA의 분열 그리고 DNA 시퀀싱 어댑터의 결 찰 포함 종료; 그리고 3) nanopores (그림 1)의 배열에 어댑터 출혈 DNA의 로드.

1. HMW DNA 추출

  1. 시 약 설치 합니다. PBS의 100 mL를 추가 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 버퍼 (1000 mL) x 1를 확인 (10 배) 900 ml의 물과 잘 혼합. 세포의 용 해 버퍼 (50 mL) 물 43.5 mL 50 mL 튜브에 추가 하 여 확인 합니다. 트리 스 (1 M, pH 8.0), 염화 나트륨 (NaCl) (5 M)의 1 mL의 500 μ ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.5 M, pH 8.0)의 2.5 mL을 추가 하 고 나트륨 라우릴의 2.5 mL 튜브 (SDS) (10%, wt/vol)을 황산과 잘 섞어.
    참고:이 PBS 버퍼 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 6 개월까지. Premade 세포의 용 해 버퍼 최대 2 개월까지 실시간에 저장할 수 있습니다.
  2. 세포 사망을 확인 하 고는 셀. 라이브 비율 > 85% 이며 전체 휴대폰 번호는 30 x 106확인 합니다.
    참고: 셀이이 프로토콜에 사용 되는 HG00733 셀 라인, 구조 변화 분석을 위한 1000 게놈 컨소시엄에서 널리 이용 되는 푸에 토 리코 근원의 인간 lymphoblastoid 셀 라인에서 (주문 정보에 대 한 자료의 표 참조)에 속한 하 국제 게놈 샘플 리소스.
  3. 실시간 삭제 매체에서 5 분 동안 200 x g 에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 1 x PBS 버퍼의 5 mL와 함께 셀 펠 릿 (30 x 106 셀) resuspend. 200 x g RT 5 분에 다시 원심 및 삭제는 상쾌한.
    참고: 25-35 x 106 세포의이 접근에 대 한 사용할 수 있습니다. 더 셀 사용 금액 변동 추가 최적화를 합니다. 셀 펠 릿 −80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
  4. 1 x PBS 버퍼의 200 μ에 셀 펠 릿을 resuspend. 고정된 셀 펠 릿을 사용 하 여, 1 x PBS 버퍼의 5 mL로 세척 한다. RT에 5 분 동안 200 x g 에서 솔루션 원심, 삭제는 상쾌한 고 PBS 버퍼 x 1의 200 μ 셀 resuspend.
  5. 50 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 준비 합니다. 3 미 품 1 h 37 ° C에서 솔루션에 대 한 세포의 용 해 버퍼 및 최고 속도로 소용돌이를 200 μ 세포 현 탁 액을 추가 합니다.
  6. lysate를 2 μ의 RNase A (100 mg/mL)를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 샘플 50 mL 튜브를 회전 합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 솔루션을 품 어.
  7. lysate를 50 μ 가수분해 K (20 mg/mL)를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 샘플 50 mL 튜브를 회전 합니다. 2 h 50 ° C에서 솔루션을 품 어. 부 화, 동안 부드럽게 혼합 샘플 마다 30 분.
  8. 50 ° C에서 50 mL 튜브를 제거 하 고 RT에 5 분 동안 서 보자.
  9. lysate를 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1, vol/vol/vol)의 페 놀 층의 10 mL를 추가 하 고 회전 믹서에 튜브를 회전 ( 재료의 표참조) 10 분에 대 한 20 rpm에서 증기 두건에서 RT에서 누설을 방지 하기 위해 parafilm으로 튜브 캡 포장 동안 회전입니다.
  10. 실시간에서 2 분 동안 1500 x g 에서 centrifuging 여 두 50 mL 젤 튜브 ( 재료의 표참조)를 준비
    참고: 젤 수성 단계 포함 하는 핵 산 및 유기 용 매 사이의 안정적인 장벽을 형성 한다.
  11. 단계 1.10에서 젤 튜브 준비 50 mL 중에 샘플/페 놀 솔루션을 붓으십시오. 실시간에서 10 분 동안 3000 x g 에서 솔루션을 원심
  12. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 하 거 라. (25:24:1, vol/vol/vol) 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 페 놀 층의 10 mL을 추가 하 고 10 분 20 rpm에서 증기 두건에서 RT에서 회전 믹서에 튜브를 회전.
  13. 준비와 한번 단계 1.11 젤 튜브를 반복 합니다.
  14. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 하 거 라. 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올의 25 mL를 추가 하 고 부드럽게 돌려 튜브 손으로 DNA 침전 (그림 2).
    참고: 강수량 접근 HMW DNA를 안정 시킬 수 있습니다.
  15. 후크를 만들 20 μ 팁 벤드. 조심 스럽게 꺼내는 후크와 HMW DNA와 액체 방울을 풀어.
  16. HMW DNA를 포함 하는 70% 에탄올 40 mL 50 mL 튜브에 놓습니다. 부드럽게 반전 튜브 3 번 하 여 DNA를 씻어.
  17. 반복 단계 1.15 번 70% 에탄올 튜브에서 DNA를 수집 합니다.
  18. 70% 에탄올의 1.8 mL를 포함 하는 2 mL 튜브에 HMW DNA를 놓습니다.
  19. 10000 x g 3에서 씻어 HMW DNA를 원심 pipetting으로 가능한 잔여 에탄올의 실시간 제거에서 s.
    참고: 때 잔여 에탄올 pipetting DNA 펠 렛을 방해 하지 마십시오.
  20. 뚜껑을 샘플 건조 오픈 10 분 동안 37 ° C에서 2 mL 튜브를 품 어.
    1. 와 계속 2.1 (와 기계적 전단 1 D 결 찰 시퀀싱 키트) 단계, 2 mL 튜브에 테 (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8.0)의 1 mL를 추가 합니다.
    2. 10 mm Tris (pH 8.0) 0.02 %200 μ 추가 계속 단계 2.2 (transposase 기반 조각화 및 급속 한 시퀀싱 키트), 트라이 톤 X-100.
      참고: DNA 펠 렛을 방해 하지 마십시오. 어둠 속에서 4 ° C에서 48 h에 대 한 서 관 시키는 완전히 resuspend 샘플을 도움이 됩니다. HMW DNA는 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장할 수 있습니다. 긴 저장 시간 또는 다른 저장 조건 더 짧은 파편을 발생할 수 있습니다.

2. 매우 긴 DNA 도서관 건축

참고: nanopore 시퀀싱 키트와 결합 하 여 두 개의 다른 기울이기 방법에 따라 매우 긴 DNA 라이브러리를 구성 하는 두 가지 방법이 있다. 기계적 전단 기반 라이브러리 라이브러리 건설에 8 h 약을 복용 하는 50-70 킬로바이트의 N50 사용 하 여 데이터를 생성 합니다. Transposase 조각화 기반 라이브러리 라이브러리 건설에 대 일 분만 복용의 90-100 kb 데이터 N50 생성 합니다. 기계적 전단 프로토콜 같은 DNA 시퀀싱 어댑터와 nanopore 흐름 셀의 품질의 동일한 버전을 사용 하 여 입력에서 높은 수익률을 제공 합니다.

  1. 기계적 전단 기반 도서관 건축
    1. 해 동 하 고 믹스는 결 찰에서 시 약 키트 ( 재료의 표참조). Thaw FFPE DNA 버퍼와 얼음, 그 소용돌이에 최종 수리/다-미행 버퍼를 복구 및 혼합 아래로 회전. 섞어 녹여 내려 어댑터 믹스 (AMX)와 얼음, 그리고 피 펫 스핀에 어댑터 비드 바인딩 버퍼 (ABB). 연료 혼합 (RBF) 실행 버퍼 및 차입 버퍼 (ELB) RT, 그리고 소용돌이 스핀에 내려 섞어 녹여. RT와 피 펫을 사용 하기 전에 혼합 라이브러리 로드 구슬 (LLB)를 녹여.
      1. 일단 해 동, 얼음에 모든 키트 구성 요소를 계속. 필요할 때만 효소를 꺼내. 사용 하기 위해 RT 자석 구슬가지고.
        참고: 사용 하는 자석 구슬에 추천 자료의 테이블 참조.
    2. 단계의 1.21.1 HMW DNA의 양과 품질을 확인 합니다. HMW DNA 튜브 넓은 p 200를 사용 하 여 세 가지 다른 위치에서 새로운 1.5 mL 튜브에 DNA의 20 μ 밖으로 피 펫 팁을 낳았다. 읽고 UV를 사용 하 여 품질과 fluorometer를 사용 하 여 농도 검출 하기 위하여 3 개의 aliquots에서 1 μ를 가져가 라. 여러 번 확인 결과를 확인 합니다.
      참고: 그림 3A에서 예상 된 결과가 표시 됩니다. OD260/280 값은 약 1.9 하 고 OD260/230 값은 약 2.3.
    3. 전송 P1000 넓은 50 mL 튜브 캡으로 HMW DNA의 나머지 940 μ 팁을 낳았다.
    4. 바늘 없는 주사기를 1 mL에 모든 DNA를 발음.
    5. 27 G 니 들을 주사기에 넣고 부드럽게 그리고 천천히 뚜껑으로 모든 DNA를 추출 (~ 10 s). 27 G 바늘 주사기에서 벗어.
    6. 바늘을 통해 30 패스의 총 29 시간 2.1.4-2.1.5 단계를 반복 합니다.
      참고: 전단된 HMW DNA 24 h. 품질 관리 (QC) 최대 펄스 분야 젤 전기 이동 법으로 좋습니다 하지만 비용과 시간이 소요 그것은 어둠 속에서 4 ° C에서 저장할 수 있습니다. 자동된 펄스 분야 젤 전기 이동 법 기계에 QC를 수행 하는 경우 실행 20 h 5-150 kb 프로토콜을 사용 합니다. 예상된 결과 그림 4에 나와 있습니다.
    7. 깎인된 HMW DNA의 100 μ를 추가 하 여 0.2 mL 튜브에 DNA 수리 반응 준비 (20 μ g), FFPE DNA 수리 버퍼의 15 μ, FFPE DNA 수리 믹스의 12 μ 및 16 μ nuclease 무료 물. 6 번 부드럽게 터치 하 여 반응 혼합 하 고 제거 거품 아래로 회전.
    8. P200 넓은 구멍 팁 새로운 1.5 mL 튜브에 60 분 전송 20 ° C에서 반응 샘플을 품 어.
    9. 마그네틱 구슬 pipetting 또는 vortexing resuspend. DNA 수리 반응과 믹스를 143 μ 구슬 (1 x) 추가 부드럽게 터치 튜브 6 번 하 여. 30 분 20 rpm에서 RT에서 회전 믹서에 튜브를 회전 합니다.
    10. 스핀에서 1000 x g 2에 대 한 샘플 다운 실시간 장소 10 분에 대 한 자석 선반에 튜브에서 s 자석 선반에 튜브를 유지 하 고는 상쾌한 삭제.
    11. 마그네틱 선반에 튜브를 유지, 펠 릿을 방해 하지 않고 갓된 70% 에탄올의 400 μ를 추가 합니다. 30 후 70% 에탄올을 제거 s.
    12. 2.1.11 단계를 한 번 반복 합니다.
    13. 스핀에서 1000 x g 2에 대 한 샘플 다운 튜브 자석 선반에 다시 실시간 장소 s. 모든 잔여 에탄올을 제거 하 고 공기 건조 30 s. 펠 릿 이상 건조 하지 마십시오.
    14. 마그네틱 선반에서 튜브를 제거 하 고 테 (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8.0)의 103 μ를 추가. 부드럽게 톡 구슬, 버퍼에 적용 되 고 30 분에 대 한 RT에서 회전 믹서에 부드럽게 품 어 튜브 튜브 마다 5 분 터치 물의 resuspension 펠 릿의 원조 하.
    15. 작은 자석 선반에 구슬 와이드 P200와 eluate의 적어도 10 분 전송 100 μ 0.2 mL 관으로 팁을 지루하게 하는 대.
    16. 수리 HMW DNA의 100 μ, 최종 수리/다-미행 버퍼의 14 μ 및 최종 수리/다-미행 믹스의 7 μ를 추가 하 여 최종 수리 및 0.2 mL 튜브에 다 미행 반응 준비. 6 번 부드럽게 터치 하 여 반응 혼합 하 고 제거 거품 아래로 회전.
    17. 품 어 20 분, 65 ° c 60 분 동안 20 ° C에서 반응 하 고 22 ° c.에서 개최 넓은 p 200를 사용 하 여 새로운 1.5 mL 튜브에 샘플 보어 전송 팁.
    18. 마그네틱 구슬 pipetting 또는 vortexing resuspend. 구슬의 48 μ 추가 (0.4 x) 최종 수리/다-미행 반응을 부드럽게 터치 튜브 6 번 하 여 혼합. 30 분 20 rpm에서 RT에서 회전 믹서에 튜브를 회전 합니다.
    19. 한 번 2.1.10-2.1.13 단계를 반복 합니다.
    20. 마그네틱 선반에서 튜브를 제거 하 고 33 μ 테 (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8.0)의 추가. 부드럽게 톡 구슬, 버퍼에 적용 되 고 30 분에 대 한 RT에서 회전 믹서에 부드럽게 품 어 튜브 튜브 마다 5 분 터치 물의 resuspension 펠 릿의 원조 하.
    21. 작은 자석 선반에 구슬 와이드 P200와 eluate의 적어도 10 분 전송 30 μ 구멍 팁 새로운 1.5 mL 튜브에 대 한. fluorometer을 사용 하 여 농도 검출 하 여분 1-2 μ를 가져가 라.
      참고:이 단계에서 5-6 μ g의 복구 예정입니다.
    22. 준비 끝 수리 HMW DNA의 추가 30 μ에 의해 1.5 mL 샘플 튜브에 결 찰 반응, 어댑터 믹스 (1 D AMX)의 20 μ, 블런트/TA 결 찰 마스터 믹스의 50 μ. 각 순차적 추가 및 제거 거품 아래로 회전 사이 6 번 부드럽게 터치 하 여 반응 혼합.
    23. 60 분에 대 한 RT에 반응을 품 어.
    24. 마그네틱 구슬 pipetting 또는 vortexing resuspend. 추가 40 μ 구슬 (0.4 x) 결 찰 반응을 부드럽게 터치 튜브 6 번 하 여 혼합. 30 분 20 rpm에서 RT에서 회전 믹서에 튜브를 회전 합니다.
    25. 2.1.10 단계를 한 번 반복 합니다.
    26. 튜브에 어댑터 비드 바인딩 (ABB) 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 6 번 부드럽게 구슬 resuspend으로 튜브를 터치 합니다. 버퍼에서 구슬을 분리 하 고 상쾌한 삭제 하 자석 선반에 다시 튜브를 놓습니다.
    27. 한 번 2.1.26 단계를 반복 합니다.
    28. 스핀에서 1000 x g 2에 대 한 샘플 다운 튜브 자석 선반에 다시 실시간 장소 s. 모든 잔여 버퍼를 제거 하 고 공기 건조 30 s. 펠 릿 이상 건조 하지 마십시오.
    29. 마그네틱 선반에서 튜브를 제거 하 고 차입 버퍼의 43 μ에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 톡 구슬 버퍼에 적용 되 고 30 분에 대 한 RT에서 회전 믹서에 부드럽게 품 어 튜브 튜브 마다 5 분 터치 물의 resuspension 펠 릿의 원조 하.
    30. 작은 자석 선반에 구슬 와이드 P200와 eluate의 적어도 10 분 전송 40 μ 구멍 팁 새로운 1.5 mL 튜브에 대 한. fluorometer을 사용 하 여 농도 검출 하 여분 1-2 μ를 가져가 라.
      참고:이 단계에서 1-2 μ g의 복구 예정입니다. 기계적 전단 기반 라이브러리 로딩에 대 한 준비가 되어있습니다. 도서관 저장할 수 있습니다 최대 2 h ice에 시퀀싱에 대 한 로드까지 필요한 경우.
  2. Transposase 조각화 기반 도서관 건축
    1. 재개는 transposase에서 시 약 키트 ( 재료의 표참조). 녹여 조각화 믹스 (FRA)와 섞어 얼음과 피 펫에 빠른 어댑터 (랩). Thaw 시퀀싱 버퍼 (SQB), 구슬 (파운드) 로드, 플러시 버퍼 (FLB)와 RT에 밧줄 (FLT) 플러시 혼합 플라스틱. 로드 구슬 (파운드) RT와 피 펫을 사용 하기 전에 혼합에 녹여 일단 해 동, 얼음에 모든 키트 구성 요소를 계속. 필요할 때만 효소를 꺼내.
    2. 단계의 1.21.2 HMW DNA의 양과 품질을 확인 합니다. HMW DNA 튜브 넓은 p 200를 사용 하 여 세 가지 다른 위치에서 새로운 1.5 mL 튜브에 DNA의 20 μ 밖으로 피 펫 팁을 낳았다. 읽고 UV를 사용 하 여 품질과 fluorometer를 사용 하 여 농도 검출 하기 위하여 3 개의 aliquots에서 1 μ를 가져가 라. 여러 번 확인 결과를 확인 합니다.
      참고: 그림 3B에서 예상 된 결과가 표시 됩니다. OD260/280 값은 약 1.9 하 고 OD260/230 값은 약 2.3.
    3. HMW DNA, 10 mM Tris (pH 8.0) 조각화의 0.02% 트라이 톤 X-100 그리고 1 μ와 혼합 (FRA)의 1 μ의 22 μ를 추가 하 여 DNA tagmentation 반응 0.2 mL 튜브에서를 준비 합니다. 믹스와 와이드 P200 pipetting으로 낳았다 팁 가능한 천천히 6 번 거품을 소개 하도록 하지.
    4. 품 어 1 분 뒤에 1 분 동안 80 ° C에 30 ° C에서 반응 하 고 4 ° c.에서 개최 P200 광범위 새로운 1.5 mL 튜브에 혼합 전송 팁 및 즉시 다음 단계로 이동을 낳았다.
    5. 1.5 mL 샘플 튜브를 1 μ 빠른 어댑터 (랩)를 추가 합니다. 믹스와 와이드 P200 pipetting으로 낳았다 팁 가능한 천천히 6 번 거품을 소개 하도록 하지.
    6. 60 분에 대 한 RT에 반응을 품 어.
      참고: transposase 조각화 기반 라이브러리는 로드에 대 한 준비. 도서관 저장할 수 있습니다 최대 2 h ice에 시퀀싱에 대 한 로드까지 필요한 경우.

3입니다. 연속 nanopore 장치에

  1. Nanopore 시퀀싱 장치 검사 ( 재료의 표참조). 소프트웨어와 하드웨어와 충분 한 저장 공간이 있는지 확인 합니다.
  2. 흐름 셀을 확인 합니다. 새로운 흐름 셀 열고 nanopore 장치로 흐름 셀을 삽입 합니다. 위치 흐름 셀의 상자 (X1-X5)에 삽입 된 확인 하십시오. 정확한 흐름 셀 유형을 선택 합니다. 흐름 세포 확인 워크플로 클릭 합니다. 테스트 시작 버튼 흐름 셀 QC 분석 시작을 클릭 합니다.
    참고: 보고 된 총 활성 공 수 800 미만 이면 시퀀싱에 대 한 다른 새로운 흐름 셀을 사용 합니다.
  3. 못쓰게 버퍼를 준비 합니다. 기계적 전단 기반 라이브러리에 대 한 추가 연료 혼합 (RBF) 버퍼와 624 576 μ μ nuclease 무료 물 1.5 mL 튜브에의. 와 동 그리고 믹스 못쓰게 버퍼 아래로 회전. Transposase 조각화 기반 라이브러리에 대 한 플러시 버퍼 (FLB)의 튜브를 플러시 밧줄 (편 명)의 30 μ를 추가 합니다. 와 동 그리고 믹스 못쓰게 버퍼 아래로 회전.
  4. 흐름 세포에서 못쓰게 포트 커버를 못쓰게 포트 노출 시계 방향으로 이동 합니다.
  5. P1000 피펫으로 100 μ를 설정 하 고 팁 못쓰게 포트에 삽입. 흐름 세포에서 모든 거품을 제거 하려면 버퍼 (30 μ)의 작은 볼륨을 다시 그립니다. 일단 노란색 액체의 작은 양의 입력 팁 pipetting 중지 합니다.
  6. P1000 피 펫을 사용 하 여 못쓰게 포트를 통해 흐름 셀으로 못쓰게 믹스의 800 μ를 로드. 소개 하는 거품을 피하기 위해, 먼저, 못쓰게 포트의 상단을 커버 다음 팁 못쓰게 포트에 넣고 천천히 못쓰게 혼합의 나머지를 추가 못쓰게 혼합의 30 μ를 추가 합니다. 약 50 μ 왼쪽 때 팁을 가져가 라. 못쓰게 포트 상단 못쓰게 혼합의 나머지를 추가 합니다. 액체는 자체적으로 안에 갈 것입니다.
  7. 설치 5 분 동안 품 어 둡니다. 한편, 라이브러리를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 라이브러리 믹스를 준비 합니다.
    참고: 기계적 전단 기반 라이브러리에 대 한 추가 35 µ L의 DNA 도서관의 40 µ L를 연료 혼합 (RBF)와 버퍼를 실행 합니다. Transposase 조각화 기반 라이브러리에 대 한 추가 시퀀싱 버퍼 (SQB)의 34 µ L 16 µ L 25 µ L의 DNA 도서관을 nuclease 무료 물.
  8. 샘플 포트를 노출 하는 부드럽게 흐름 셀 샘플 포트 덮개를 엽니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 3.5 단계에서 설명한 대로 못쓰게 포트를 통해 못쓰게 믹스 200 μ 흐름 셀에 추가. 못쓰게 혼합 샘플 포트를 통해 흐름 셀에 로드 되지 않은 다는 것을 확인 하십시오.
  9. 80 μ P200 피 펫을 설정 합니다. 믹스 넓은와 부드럽게 라이브러리 로드 직전 6 번 위아래로 pipetting으로 팁을 낳았다.
  10. 로드 라이브러리 믹스 dropwise 샘플 포트를 통해 흐름 셀에. 이전 드롭 포트에 완전히 로드 된 후에 각 방울을 추가 합니다.
  11. 다시 샘플 포트 커버 부드럽게 넣고 샘플 포트 완전히 덮여 있는지 확인 하십시오. 못쓰게 포트 커버 못쓰게 포트 커버 반시계 이동 합니다. 장치 뚜껑을 닫습니다.
  12. 새로운 실험 워크플로 클릭 합니다. 라이브러리 이름을 입력 하 고 사용, 절차에 따라 정확한 키트 선택한 설정이 올바른 (48 개의 h 실행, 실시간 자료 전화에) 확인.
  13. 시작 실행을클릭 합니다. 10 분 후 흐름 셀 ID와 실행된 정보에서 활성 nanopore 숫자 (총 수 및 각 4 개 그룹의 숫자)를 기록 합니다.
  14. 데이터 분석입니다. 언제 든 지 시퀀싱의 실행이 완료 되 면 로컬 컴퓨터 또는 클러스터에 데이터를 복사 합니다. Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2)를 사용 하 여 참조 게놈 시퀀스 데이터 정렬. NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot)에 의해 원시 시퀀스 데이터는 정렬에서 시퀀싱 성능 요약.

Representative Results

매우 긴 DNA 시퀀싱 프로토콜 라이브러리 건설 HMW DNA를 적용합니다. 따라서, 그것은 라이브 비율 잘 경작된 한 세포를 선택 하는 중요 한 > 셀 수확 단계에서 85%. HMW DNA의 양과 질, DNA 추출에 사용 되는 셀의 크기에 영향을 미칩니다. 세포 세포의 용 해는 너무 많은 세포로 시작 하는 경우에 잘 작동 하지 않습니다. HMW DNA 강수량 고속 원심 분리 대신 손으로 부드러운 회전을 사용 하 여 수행 되기 때문에 너무 몇 가지 셀을 사용 하 여 라이브러리 건설에 대 한 충분 한 DNA을 생성 하지 않습니다. 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올을 추가 하 고 회전 그림2에서 흰 목화 같은 침전으로 표시 됩니다 후 HMW DNA의 예입니다.

그것은 도서관 건축을 시작 하기 전에 입력 DNA의 품질을 확인 해야 합니다. 저하, 잘못 된 정량화, 오염 (예: 단백질, RNAs, 세제, 계면 활성 제, 그리고 잔여 석탄 산 또는 에탄올) 및 낮은 분자량 DNA 길이 읽고 마지막에 후속 절차에 상당한 효과 가질 수 있습니다. HMW DNA를 포함 하는 관에서 세 가지 다른 위치에서 DNA를 사용 하 여 품질 분석을 수행 하는 것이 좋습니다. UV HMW DNA에 대 한 결과 읽어에서 OD260/OD280 값 약 1.9 이며 OD260/OD230 값은 약 2.3 (그림 3AB). 이러한 비율 값은 좋은 HMW DNA 샘플에 대 한 세 가지 테스트 간에 일관. 다른 깎는 방법 입력된 DNA의 다른 볼륨을 필요 합니다. HMW DNA의 농도 필요 > 기계적 전단 필요 동안에 µ 200 ng/L > transposase 조각화에 대 한 µ 1 µ g/L. fluorometer에 의해 감지 농도 UV 읽기 보다 조금 낮습니다. 그러나, 동일한 HMW DNA 샘플의 농도의 변이 계수는 fluorometer와 UV 분석 실험을 읽고 미만 15% 필요 합니다. 기계적 전단 주사기 바늘을 통해 전달의 수 전단된 DNA의 크기에 영향을 줍니다 마지막 읽을 길이 있도록 HMW DNA를 바늘으로 적용 됩니다. 후 바늘 HMW DNA의 대부분을 위해 전단은 그림 4에서 볼 수 있듯이 50 kb 보다 큰 크기 품질 관리를 수행 하는 것이 좋습니다. 기계적 전단 방식에서 30 패스 길이 출력을 고려 최고의 시퀀싱 결과 생성.

기계적 전단 기반 라이브러리의 N50 transposase 조각화 기반 라이브러리는 90-100 킬로바이트 50-70 킬로바이트입니다. HG00733 셀 라인을 사용 하 여 4 개의 실행 결과 표 1에 표시 됩니다. 모든 4 개의 실행 100 kb 보다 긴 길이와 이상의 2300 읽기 있다. 최대 길이 transposase 조각화 기반 라이브러리에서 (455 kb 및 489 kb) 기계적 전단 기반 라이브러리 (348 kb 및 387 kb)와 비교 된 더 긴 동안 후자 더 총 읽습니다, 높은 수익률을 나타내는. 그것은 몇몇 짧은 조각을 소개 합니다 있도록 transposase 조각화 기반 라이브러리 건설 적은 단계와 짧은 준비 시간 있다. Transposase를 사용 하 여 두 개의 실행 긴 평균 길이 (> 30 kb)와 중간 길이 (> 10 kb). 또한, 데이터에서 모든 실행을 (평균 품질 평가 점수는 약 10.0, ~ 90% 기본 정확도) 일관 된 높은 품질을 보여줍니다. 총 기초의 97% 이상 인간의 참조 게놈 (hg19) Minimap216 을 사용 하 여 기본 설정으로 정렬 했다. 원시 읽기의 예상된 크기 분포는 그림 5에 나와 있습니다. 모든 실행 동안 transposase 조각화 기반 라이브러리는 매우 긴 읽기 (예: > 100 kb)의 높은 비율 50 kb 이상의 데이터의 큰 비율이 있다. 이 프로토콜은 여러 개의 인간 세포 라인 (보충 표 1)에 성공적으로 적용 되었다.

Figure 1
그림 1: nanopore 긴 읽기 시퀀싱 (NLR-seq) 워크플로의 도식 개요. 오렌지, 복잡 한 transposase입니다. 노란색-녹색, nanopore 어댑터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 페 놀-클로 프롬 적 출 방법에서 대표 DNA 강수량. 흰색 화살표 HMW DNA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: UV 독서에서 HMW DNA의 예제 QC 결과. 1.21.1 기계적 전단 기반 도서관 건축을 위한 준비 단계에서의 (A) HMW DNA 단계 1.21.2 transposase 라이브러리 조각화 기반 건설에서에서의 (B) HMW DNA 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 바늘의 QC 결과 펄스 분야 젤 전기 이동 법에 의해 HMW DNA 전단. L1: 빠른 부하 1 kb DNA 사다리; L2: 빠른 로드 1 kb DNA 사다리 확장. 1-8: DNA 전단 하는 바늘을 통해 다른 지나가는 시간. 1-3, 전단; 4, 10 번; 5, 20 번; 6, 30 시간; 7, 40 번; 8, 50 번입니다. 이 품질 관리 단계는 선택 사항입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: nanopore 매우 긴 DNA 라이브러리의 크기 분포를 예상. MS, 기계적 전단 기반 라이브러리입니다. TF, transposase 조각화 기반 라이브러리 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

기계 shearing_rep1 기계 shearing_rep2 Transposase fragmentation_rep1 Transposase fragmentation_rep2
셀 라인 HG00733 HG00733 HG00733 HG00733
읽기의 N50 55,180 63,007 98,237 95,629
100kb 이상 읽기 수 2500 3,082 2,386 2,355
총 읽기 수 97,859 80,465 24,166 21,032
최대 길이 (bp) 348,482 387,113 454,660 489,426
평균 길이 (bp) 17,861 20,395 33,528 38,175
중간 길이 (bp) 5,335 5,894 10,249 15,656
읽기의 품질을 의미 10.0 10.1 9.9 10.0
원시 읽기의 총 기초 1,747,849,822 1,641,058,932 810,229,733 802,886,304
정렬 된 읽기의 총 기초 1,693,300,832 1,607,975,925 791,422,077 778,417,627
총 기초 (hg19, Minimap2)의 매핑된 비율 96.9% 98.0% 97.7% 97.0%
활성 숨 구멍의 수 1225: 480, 402, 254, 89 1058: 480, 356, 176, 46 958: 452, 328, 148, 30 1092: 487, 367, 195, 43

표 1: 다른 전단 프로토콜 성능 통계 요약에서 실행 됩니다.

도서관 1 도서관 2
셀 라인 K562 GM19240
세포 주문 정보 ATCC, 고양이입니다. 아니요. CCL-243 Coriell 연구소, 고양이입니다. 아니요. GM19240
프로토콜 기계적 전단 기계적 전단
읽기의 N50 60,063 55,295
총 읽기 수 193,783 120,807
중간 길이 (bp) 1,843 4,688
평균 길이 (bp) 9,825 17,408
최대 길이 (bp) 548,780 212,338
원시 읽기의 총 기초 1,903,989,686 2,103,015,331
정렬 된 읽기의 총 기초 1,837,350,047 1,997,419,761
총 기초 (hg19, Minimap2)의 매핑된 비율 96.6% 95.0%
활성 숨 구멍의 수 1111: 482, 371, 203, 55 1032: 447, 333, 196, 56

기계적 전단 프로토콜 다른 셀 라인을 사용 하 여 두 NLR seq의 보충 표 1: 요약.

Discussion

원칙적으로, nanopore 시퀀싱 길이11,,1213megabase 읽기 100 킬로바이트를 생성할 수 있다. 4 주요 요인 시퀀싱 실행 및 데이터 품질의 성능에 영향을 미칠 것입니다: 1) 활성 공 숫자와 모 공;의 활동 nanopore를 통과 하는 DNA의 속도 제어 하는 2) 모터 단백질 3) DNA 템플렛 (길이, 순도, 품질, 질량); 4) 시퀀싱 어댑터 결 찰 효율성, 입력된 샘플에서 유용한 DNA를 결정 합니다. 처음 두 가지 요소는 흐름 세포와 제조업체에서 제공 하는 시퀀싱 키트의 버전에 따라 달라 집니다. 두 번째 두 가지 요소 (HMW DNA 추출, 전단 및 결 찰)이이 프로토콜에 중요 한 단계가 있습니다.

이 프로토콜에는 인 내와 연습이 필요합니다. HMW DNA의 품질은 매우 긴 DNA 라이브러리6중요 합니다. 높은 생존 된 셀으로 시작 하는 프로토콜 (> 85% 가능한 셀 선호), 죽은 세포에서 저하 DNA를 제한. (예를 들어, 강력한 방해, 떨고, 소용돌이, 여러 pipetting, 반복 중지 및 재개) DNA에 손해를 도입할 수 있는 어떤 가혹한 과정은 피해 야 한다. 프로토콜의 디자인에 우리는 전체 DNA 추출 과정에서 pipetting 생략 합니다. 넓은 구멍 팁 pipetting 필요한 경우 도서관 건설 중 기계 전단 및 시퀀싱 후 사용할 필요가 있다. nanopores 챔버 버퍼12에서 화학 물질에 민감한 때문에, 이어야 한다 적은 잔여 오염 물질 (예를 들어, 세제, 계면 활성 제, 페 놀, 에탄올, RNAs 단백질, 등) 가능한 DNA에서. 길이 및 수율을 고려 하면 페 놀 추출 방법 지금까지 테스트 하는 여러 다른 추출 방법에 비해 최고의 그리고 가장 재현성 결과 보여 줍니다.

이 프로토콜의 생산 능력을 오래 읽기 시퀀스에 불구 하 고 몇 가지 제한이 여전히 남아 있다. 첫째,이 프로토콜 nanopore 시퀀싱 장치 간행물;의 시간에 사용할 수에 따라 최적화 되었다 따라서, 그것은 선택적 nanopore 기반 시퀀싱 화학 제한 되며 다른 유형의 긴 읽기 시퀀싱 장치에서 수행 하는 경우 최적이 될 수 있습니다. 둘째, 결과 매우 시작 물자 (조직 또는 세포)에서 추출한 DNA의 품질에 의존 합니다. 읽기 길이 시작 DNA 이미 저하 또는 손상 된 경우 손상 될 것 이다. 셋째, 여러 품질 관리 단계는 DNA 품질을 확인 하려면 프로토콜에 통합 됩니다, 비록 최종 수율과 읽기의 길이 흐름 세포에 의해 영향을 받을 수 및 활동, nanopore 시퀀싱 플랫폼의 초기 단계에서 변수를 수 있는 기 공 개발입니다.

설명 하는 프로토콜은 여기 DNA 추출에 대 한 인간의 현 탁 액 셀 라인 샘플을 사용 합니다. 우리는 바늘 전단, transposase와 설명된 결과를 내 고 시간을 HMW DNA의 비율에에서 지나가는 시간을 최적화 했습니다. 프로토콜 4 가지 방법으로 확장 될 수 있다. 첫째, 사용자가 다른 경작된 한 포유류 세포와 세포, 조직, 임상 샘플, 또는 다른 생물의 다른 금액으로 시작할 수 있습니다. 세포 배양 시간, 반응 볼륨 및 원심 분리에 더 최적화가 필요 합니다. 둘째, 그것은 매우 긴 읽기 시퀀싱에 대 한 대상 크기를 예측 하기 어렵다. 읽기 길이 예상 보다 짧은 경우에, 사용자가 기계적인 전단 기반 방법에 지나가는 시간을 조정 하거나 transposase 조각화 기반 메서드에서 transposase을 HMW DNA의 비율을 변경할 수 있습니다. 바인딩 및 차입 장시간 정리 단계 동안 HMW DNA는 높은 점성 때문에 도움이 됩니다. 셋째, 다른 nanopore 시퀀싱 장치와 하나 양과 DNA 시퀀서의 기준을 충족의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 넷째, 시퀀싱 어댑터에 출혈 하는 DNA에만 시퀀싱 합니다. 추가로 결 찰 효율성을 개선 하기 위해, 하나의 어댑터와 리가 농도 적정 시도할 수 있습니다. 수정된 결 찰 시간 및 분자 크롤 링 에이전트 못18 등 미래에 적용할 수 있습니다. CRISPR19,20 와 함께 매우 긴 DNA 시퀀싱 프로토콜 대상 농축 시퀀싱을 위한 효과적인 도구를 제공할 수 있습니다.

Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

저자는 원고에 대 한 그녀의 의견에 대 한 당 주를 감사합니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P30CA034196에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 부분적으로 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023
Agencourt AMPure XPbeads Beckman A63881 magnetic beads for cleanup
BD conventional needles Becton Dickinson 305136 27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe Becton Dickinson 309628 for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228 for cell counting
EDTA Invitrogen AM9261 pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106 R9.4.1
HG00773 cells Coriell Institute HG00733 cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK108 nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes Qiagen 129073 gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix NEB M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB M7546S
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS Gibco 70011044 10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA Invitrogen AM9730
Proteinase K Qiagen 19131 20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit Oxford Nanopore Technologies SQK-RAD004 nanopore transposase kit
RNase A Qiagen 19101 100 mg/mL
SDS Invitrogen AM9822 10% (wt/vol)
Sodium chloride solution Invitrogen AM9759 5.0 M
TE buffer Invitrogen AM9849 pH 8.0
Tris Invitrogen AM9856 pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 ~10%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler Bio-Rad 1851196EDU
Centrifuge 5810R Eppendorf 22628180
Countess II FL Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000 for cell counting
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf 5382000023 for incubation
Freezer LabRepCo LHP-5-UFMB
GridION Oxford Nanopore Technologies GridION X5 nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D rotator mixer
MicroCentrifuge Benchmark Scientific C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-1000 for UV reading
Pippin Pulse Sage Science PPI0200 pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216 fluorometer
Refrigerator LabRepCo LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-A236
Water bath VWR 89501-464

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References

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Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).More

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).

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