इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कोशिका छंटाई आधारित विधि के शोधन और संस्कृति के लिए फ्लोरोसेंट GABAergic या ग्लूटामैटेजिक ंयूरॉंस से neocortex और बाद में चूहों या चूहों के हिप्पोकैम्पस ।
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य या तो gabaergic या glutamatergic ंयूरॉंस से व्युत्पंन शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों उत्पंन है । शुद्ध ंयूरॉंस विट्रो में 16 दिनों के लिए परिभाषित मीडिया में सुसंस्कृत जा सकता है और किसी भी आमतौर पर वियोजित संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं, सहित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, रूपात्मक और उत्तरजीविता विश्लेषण । इन संस्कृतियों का प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में जटिल बाहरी प्रभावों के अभाव में अध्ययन किया जा सकता है, ऐसे glial कोशिकाओं या अंय ंयूरॉन प्रकार से उत्पंन होने के रूप में । जब शुद्ध कोशिकाओं के साथ प्रयोग की योजना बना, तथापि, यह ध्यान दें कि ंयूरॉंस दृढ़ता से glia पर निर्भर अपने विकास और अस्तित्व के लिए वातानुकूलित मीडिया महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापना के लिए गलिया-स्रावित कारकों पर भी निर्भर करता है । इसलिए हम यह भी वर्णन करते हैं कि एक गैर-संपर्क व्यवस्था में तंत्रिका कोशिकाएँ और तंत्रिकाओं के लिए एक विधि है । इन पद्धतियों का प्रयोग करते हुए हमने गैवाजिक और ग्लूटामैटेजिक न्यूरोनल नेटवर्कों के विकास के बीच प्रमुख अंतरों की पहचान की है । इस प्रकार, शुद्ध ंयूरॉंस के अध्ययन संस्कृतियों कैसे तंत्रिका तंत्र विकसित और कार्य के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महान क्षमता है । इसके अलावा, शुद्ध संस्कृतियों औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष कार्रवाई की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, विकास कारकों या विशिष्ट कोशिका प्रकार पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के परिणामों की खोज के लिए । के रूप में अधिक से अधिक ट्रांसजेनिक जानवरों उपलब्ध हो जाते हैं, अतिरिक्त विशिष्ट सेल प्रकार के ब्याज लेबलिंग, हम उंमीद है कि प्रोटोकॉल यहां वर्णित उनकी प्रयोज्यता और क्षमता में वृद्धि होगी ।
कोशिका छंटाई कोशिकाओं के एक विषम मिश्रण से ब्याज की कोशिकाओं के रहने के अलगाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । कोशिकाओं के आकार और आकार मापदंड के आधार पर हल किया जा सकता है, साथ ही फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति1,2। अक्सर, fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी कोशिका विशिष्ट सतह एंटीजन3,4को लक्षित करके अलग सेल प्रकार के लेबल के लिए उपयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक जानवरों या वायरल डिलीवरी सिस्टम को सेल-स्पेसिफिक प्रमोटरों के तहत फ्लोरोफोर्स को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है5,6. ऐतिहासिक रूप से ट्रांसजेनिक टूल्स और जानवरों का विकास महंगा और समय लेने वाला था । हाल ही में, कम लागत और कम तकनीकी कठिनाइयों उपलब्ध रिपोर्टर लाइनों की संख्या में एक नाटकीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है । ट्रांसजेनिक उपकरणों और रिपोर्टर जानवरों की उपलब्धता के रूप में विकसित करने के लिए जारी है, तो भी प्रतिदीप्ति की उपयोगिता और प्रयोज्यता-आधारित सेल छंटाई के तरीकों चाहिए ।
हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि सेल ट्रांसजेनिक पशुओं से छंटाई नियमित रूप से सेल7संस्कृति के लिए तैयार करने में प्राथमिक ंयूरॉंस शुद्ध करने के लिए लागू कर सकते हैं । या तो चूहों या चूहों से कोशिकाओं की छंटाई करके, हम को अलग करने और संस्कृति फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस, जो विशेष रूप से या तो gabaergic या glutamatergic ंयूरॉंस6,8,9में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त कर रहे थे । इन शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों का अध्ययन करके, हम रास्ते में एक महत्वपूर्ण अंतर की पहचान करने में सक्षम थे gabaergic और glutamatergic न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापना के लिए glia-स्रावित कारकों पर निर्भर करता है7. इसके अतिरिक्त, सह द्वारा शुद्ध ंयूरॉंस के साथ glial कोशिकाओं को culturing, हम पिछले महत्वपूर्ण भूमिका है कि glial कोशिकाओं के विकास और10,11ंयूरॉंस के अस्तित्व में खेलने का प्रदर्शन टिप्पणियों पर विस्तार कर रहे थे । इस प्रकार, कोशिका छंटाई और कोशिका संस्कृति के संयोजन के माध्यम से, हम न केवल विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार के अलगाव में विकास का अध्ययन करने में सक्षम थे, लेकिन उनके समारोह पर glial कोशिकाओं के प्रभाव की जांच कर रहे थे ।
हम यहाँ एक प्रोटोकॉल के शुद्धि और GABAergic और ग्लूटामेजिक न्यूरॉन्स के प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस से ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों की संस्कृति के लिए प्रस्तुत करते हैं । हम भी गैर के लिए एक विधि-संपर्क सह शुद्ध ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं की संस्कृति, Geissler एट अल.12से अनुकूलित उपस्थित । आदेश में शुद्ध GABAergic संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए, हम VGAT से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस हल-वीनस-एक Wistar चूहों8 या Vgat-वीनस13चूहों, जो चुनिंदा एक बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण (वीनस) के > 95% में व्यक्त कॉर्टिकल गैबएरोजिक न्यूरॉन्स । शुद्ध glutamatergic संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए, हम NexCre से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस हल किया है; Ai9 चूहों6,9, जो वल्कुट ग्लूटामैटरजिक ंयूरॉंस में tdटमाटो व्यक्त करते हैं । पूरे छंटाई और संस्कृति की प्रक्रिया 3-4 एच के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और प्रतिकृति के सैकड़ों विद्युत शारीरिक, रूपात्मक और सेल उत्तरजीविता विश्लेषण के लिए उपयुक्त को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि सरल है, reproducible और शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों है कि ब्याज की सेल प्रकार के लिए ९७% शुद्ध से अधिक कर रहे है का उत्पादन कर सकते हैं ।
हम यहां एक तरीका है कि छंटाई और प्राथमिक ंयूरॉंस के संवर्धन शुद्ध न्यूरोनल कोशिका संस्कृतियों उत्पंन का उल्लेख का वर्णन । इस विधि के आसपास लेता है 1 अधिक से अधिक एक ठेठ प्राथमिक वियोजित न्यूरोनल संस्कृति प्रोटोकॉल अभी तक दोहराने की सैकड़ों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है विशेष न्यूरोनल प्रकार युक्त संस्कृतियों की नकल । शुद्ध ंयूरॉंस, जो अलग से 16 दिनों के लिए अलगाव में उगाया जा सकता axons और dendrites विस्तार और कार्रवाई की क्षमता की दोहरावदार गाड़ियों आग कर सकते है (चित्रा 2 और 3 चित्रा) । महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं को नियमित रूप से प्राथमिक वियोजित न्यूरोनल संस्कृतियों के रूप में एक ही प्रयोगात्मक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं, विद्युत शारीरिक, रूपात्मक और अस्तित्व के विश्लेषण सहित. इन शुद्ध संस्कृतियों के साथ काम करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के विकास के अलगाव में अध्ययन किया जा सकता है । शुद्ध संस्कृतियों के विकास का समर्थन करने के लिए, हम भी ग्लाइअल कोशिकाओं के साथ शुद्ध ंयूरॉंस सह-culturing के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । के रूप में पहले से दिखाया गया है, सह glial कोशिकाओं के साथ शुद्ध ंयूरॉंस-culturing उनके अस्तित्व, विकास में सुधार और नेटवर्क गठन7 (चित्रा 4) को बढ़ावा कर सकते हैं । इस प्रकार, हम यहां तरीकों का एक संयोजन है कि आगे glia के अध्ययन-ंयूरॉन बातचीत करना चाहिए और विकास और ब्याज के अंय प्रकार के सेल के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है ।
शुद्ध glutamatergic ंयूरॉंस की संस्कृतियों पर अध्ययन के रास्ते में मौलिक अंतर्दृष्टि से पता चला है glial कोशिकाओं कारक है कि न्यूरोनल नेटवर्क और synapse गठन के विकास को बढ़ावा देने के छिपाना16,17,18 . सामांय में, शुद्ध विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार के लिए तरीके और अधिक सफलतापूर्वक किया गया है glutamatergic ंयूरॉंस के बजाय GABAergic ंयूरॉंस के विकास का अध्ययन । इससे हमारी समझ में असमानता आई है कि इन दो कोशिका प्रकारों का विकास कैसे होता है । यह देखते हुए कि GABAergic और glutamatergic ंयूरॉंस उनके शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान और विकासात्मक मूल के संदर्भ में काफी अलग है, यह महत्वपूर्ण है कि हम अपने ही अधिकार में GABAergic ंयूरॉंस का अध्ययन, बेहतर उनके समारोह और शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पहले इस तरह से महत्वपूर्ण भिन्नताओं की पहचान की है, जैसे कि गैवाजिक और ग्लूटामेजिक न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापनाके लिए गैलिया-स्रावित कारकों पर निर्भर करते हैं । इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित करके हम आशा करते है कि अंय ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण बातचीत में आगे अंतर्दृष्टि कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक प्रवाह कोशिका मिति आधारित कोशिका छंटाई पद्धति का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग हमने विभिन्न ट्रांसजेनिक कृंतक रेखाओं से गैवाजिक या ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स को शुद्ध करने के लिए किया है । वीनस सकारात्मक GABAergic ंयूरॉंस से हल किया गया VGAT वीनस चूहों13 या चूहों8 और tdटमाटटमाटर सकारात्मक ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स nexcre से हल किया गया; Ai9 चूहों (मूलतः NexCre9 और Ai9 रिपोर्टर लाइनों6से नस्ल, turko एट अल., २०१८7देखें) । हाल के वर्षों में, तकनीकी प्रगति के कारण, ट्रांसजेनिक जानवरों का उत्पादन काफी आसान हो गया है । इस प्रकार, कई विभिन्न कोशिका प्रकारों में फ्लोरोसेंट अणुओं को व्यक्त करने वाले जंतुओं की उपलब्धता तेजी से बढ़ी है । यह, बारी में, उपयोग और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई के प्रयोज्यता बढ़ गई है । हालांकि ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए वैकल्पिक तरीकों वर्तमान में मौजूद है16,19,20, वे स्वाभाविक रूप से होने वाली सतह के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी की उपलब्धता पर उनकी निर्भरता से कुछ हद तक रुकावट हैं एंटीजन. यह उनकी बहुमुखी प्रतिभा की सीमा जब प्रतिदीप्ति आधारित सेल छंटाई विधियों, जो पहले से ही कई सेल विशिष्ट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर जानवरों है कि पहले से ही उपलब्ध हैं से कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ तुलना में । फिर भी, जब अनुकूलित, एंटीबॉडी आधारित छंटाई तरीकों तेजी से हो सकता है और उच्च उपज है, और बेहतर सेल शरीर रचना की रक्षा कर सकते हैं, उनके axons और dendrites21के साथ कोशिकाओं के शुद्धिकरण की अनुमति देकर । प्रतिपिंड छंटाई विधि इसलिए अभी भी जब एक छंटाई रणनीति पर निर्णय लेने पर विचार किया जाना चाहिए । अंत में, ब्याज की कोशिका प्रकार, आयु जिस पर कोशिकाओं को हल किया जाना है, ट्रांसजेनिक जानवरों या सतह एंटीजन की उपलब्धता और आवश्यक कोशिकाओं की संख्या सबसे उपयुक्त छंटाई रणनीति का चयन करते समय निर्धारित कारक होगा ।
यद्यपि प्रतिदीप्ति-आधारित कोशिका छंटाई, कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक सरल और पुनरुत्पनीय विधि है, लेकिन सेल की गुणवत्ता को संरक्षित करने के लिए प्रोटोकॉल के कुछ चरणों के दौरान सावधानी बरती जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, प्रत्येक अपकेंद्रण कदम के बाद, यह सुनिश्चित करें कि सेल गोली फिर से संभव के रूप में जल्दी से निलंबित कर दिया है और कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बरामद किया गया है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । कभी-कभार, supernatant को हटाने के दौरान सेल गोली परेशान किया जा सकता है । इसलिए यह सलाह दी जाती है, केंद्रायन कदम के बीच, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच करने के लिए बाहर किसी भी व्यापक कोशिका हानि शासन । सेल चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को खिलाने से पहले कम से 1 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दी जानी चाहिए । यदि कोशिकाओं को बहुत जल्द खिलाया जाता है, कुछ कोशिकाओं coverslip से विस्थापित हो सकता है, जिससे संस्कृति घनत्व को कम करने. संस्कृति में 1 ज के बाद, सेल स्वास्थ्य का आकलन करने में समझदारी है । यदि कोशिकाओं को स्वस्थ (स्वस्थ कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्र 2aमें दिखाया गया है) प्रकट नहीं होता है, या एक महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु है, तो यह पृथक्करण या छंटाई प्रक्रिया के दौरान एक समस्या का संकेत हो सकता है । एक और महत्वपूर्ण विचार है, जब किसी भी सेल प्रकार के संवर्धन, देखभाल जब सेल संस्कृति मीडिया के प्रबंध है । एनबीए मीडिया phenol लाल है, जो एक पीएच संकेतक22के रूप में कार्य करता है । यदि मीडिया रंग में भी पीला हो जाता है, तो यह इंगित करता है कि पीएच भी अंलीय है; यदि मीडिया बहुत गुलाबी हो जाता है, तो यह इंगित करता है कि समाधान बहुत alkaline है । स्टॉक समाधान लंबी अवधि के लिए खुला, विशेष रूप से शंक्वाकार ट्यूबों में aliquoted मीडिया, समय के साथ और अधिक alkaline हो जाते हैं । इसलिए यह नए सिरे से पूरा एनबीए मीडिया प्रत्येक सप्ताह और पूरा मीडिया बनाने की सलाह दी है हर दो सप्ताह (वायुमंडलीय परिस्थितियों में मध्यम बफ़र्स और इसलिए अधिक स्थिर होना चाहिए) । ध्यान में इन बिंदुओं को ले यह सेल छंटाई और सेल संस्कृति उपकरण के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला में शुद्ध कोशिका संस्कृतियों की स्थापना संभव होना चाहिए ।
हमारे प्रयोगों के बहुमत में हम एक ही जानवर से शुद्ध संस्कृतियों का उत्पादन किया । हालांकि, जब जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को शुद्ध, यह छंटाई के लिए एक साथ कई जानवरों के पूल के लिए आवश्यक हो सकता है । हम सफलतापूर्वक ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर 8 भ्रूणीय चूहों (भ्रूणीय दिन 13 जानवरों) को हल किया है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हालांकि, अगर अधिक पशुओं को हल किया जा रहे हैं, यह दोनों papain और बीएसए समाधान की मात्रा में वृद्धि (2.1.1 चरण में वर्णित-2.1.4) के लिए ऊतक राशि में वृद्धि को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि अधिक कोशिकाओं संस्कृति में चढ़ाया जाता है, तो एक अधिक बार खिला अनुसूची की आवश्यकता हो सकती है । एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, कोशिकाओं को हर 7 दिन अनुकूलित मीडिया के १०० μL को हटाने और ताजा पूरा एनबीए मीडिया के २०० μL जोड़ने के द्वारा खिलाया जा सकता है । ंयूरॉन व्यवहार्यता के लिए, यदि अधिक पशुओं छंटाई, सोचा था कि जितना संभव हो उतना समय कम से कम करने के लिए दिया जाना चाहिए । यह अक्सर शुद्ध कोशिकाओं के कुशल उपयोग के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है । हम नियमित रूप से ६०० घटनाओं की दरों पर माउस ंयूरॉंस हल/s, 500000 तक-पशु प्रति 800000 कोशिकाओं (प्रसवोत्तर दिन 0-2) । हालांकि, यह छंटाई गति और शर्तों के व्यापक अनुकूलन के बिना था । इसलिए सॉर्टिंग स्पीड और यील्ड में और सुधार संभव होना चाहिए ।
शुद्ध ंयूरॉंस उनके अस्तित्व के लिए glia-वातानुकूलित मीडिया की आवश्यकता है । यह पहले से ही ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के साथ अलग से प्रदर्शन किया गया है, glial वातानुकूलित मीडिया10के साथ ंयूरॉंस उपचार से पहले । हमारे प्रयोगों में, हम अर्द्ध पारगनीय सेल संस्कृति आवेषण, जो कोशिका संस्कृति थाली के अंदर रखा जाता है पर glial कोशिकाओं को संवर्धन द्वारा शुद्ध ंयूरॉंस का समर्थन करने का फैसला किया । इस पद्धति को सफलतापूर्वक glia व्युत्पंन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन और12ंयूरॉंस के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । गैर संपर्क, लेकिन लगातार इस विधि द्वारा प्रदान की समर्थन जब कोशिकाओं की अलग संस्कृति की तुलना में लाभ की एक संख्या है । सबसे विशेष रूप से, सह ंयूरॉंस के साथ glial कोशिकाओं के संस्कृति सतत विनियमन और सेल संस्कृति मीडिया है, जो और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में जैसा दिखता है की कंडीशनिंग के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, निरंतर सह कोशिकाओं के संस्कृति ंयूरॉंस और glia, जो अलग संस्कृतियों में संभव नहीं है के बीच संकेत संभावित प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देता है । हमारे प्रोटोकॉल में, यदि आवश्यक हो, सतत सह संस्कृति विधि आसानी से छोड़ा जा सकता है और glia-वातानुकूलित मीडिया के साथ ंयूरॉंस के एक शास्त्रीय उपचार किया जा सकता है ।
संक्षेप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए एक ठोस नींव से वे अपने शुद्ध कोशिका संस्कृति प्रयोग स्थापित कर सकते है के साथ पाठक प्रदान करना है । हम भविष्यवाणी करते हैं कि निकट भविष्य के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों और वायरल निर्माणों की उपलब्धता में वृद्धि जारी रहेगी । इसलिए, कोशिका छँटाई तकनीक प्रतिदीप्ति के आधार पर और भी अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और मूल्यवान बनने की संभावना है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए उत्कृष्ट तकनीकी प्रवाह Cytometry कोर सुविधा, Deutsches रियोमा Forschungszentrum, बर्लिन में जेनी Kirsch और एना Teichmüller द्वारा प्रदान की सहायता का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम जीवन रक्षा विश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए Jie गीत शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी उसे फ्लोरोसेंट चूहों और ईसाई Ebner के प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए छवियों पर कब्जा करने में मदद के लिए रीता Loureiro शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । VGAT-वीनस ट्रांसजेनिक चूहों डीआरएस द्वारा उत्पन्न किया गया. वाई Yanagawa, एम Hirabayashi और राष्ट्रीय शारीरिक विज्ञान के लिए संस्थान में, Okazaki, जापान, pCS2 का उपयोग कर-वीनस डॉ. ए. मियाजगानी द्वारा प्रदान की. इस काम के जर्मन अनुसंधान परिषद (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, DFG EXC २५७ से चतुर्थ) द्वारा समर्थित था ।
Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
Trypsin / EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | – | Used for trituration of cells |
24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | – |
15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | – |
Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | – |
35 mm Petri dish | Corning | 353001 | – |
100 mm Petri dish | Corning | 353003 | – |
30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | – | To cell count dissociated cells |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |