Summary
Detta protokoll beskriver en cell sortering baserad metod för rening och kultur av fluorescerande GABAergic eller glutamaterga nerv celler från neocortex och Hippocampus av postnatal möss eller råttor.
Abstract
Det övergripande målet med detta protokoll är att generera renade neuronala kulturer som härrör från antingen GABAergic eller glutamaterga nerv celler. Renade nerv celler kan odlas i definierade medier för 16 dagar in vitro och är mottagliga för alla analyser som vanligt vis utförs på separerade kulturer, inklusive elektro fysiologiska, morfologiska och överlevnad analyser. Den stora fördelen med dessa kulturer är att specifika cell typer kan studeras selektivt i avsaknad av komplexa yttre influenser, såsom de som uppstår från gliaceller andra neuron typer. När man planerar experiment med renade celler är det dock viktigt att notera att neuronerna är starkt beroende av glia-betingade medier för sin tillväxt och överlevnad. Dessutom, glutamatergic nerv celler ytterligare beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission. Vi beskriver därför också en metod för samodling av nerv celler och gliaceller i ett berörings fritt arrangemang. Med hjälp av dessa metoder, har vi identifierat stora skillnader mellan utvecklingen av GABAergic och glutamatergic neuronala nätverk. Att studera kulturer av renade neuroner har således stor potential för att främja förståelsen av hur nerv systemet utvecklas och fungerar. Dessutom kan renade kulturer vara användbara för att undersöka den direkta effekten av farmakologiska agens, tillväxtfaktorer eller för att undersöka konsekvenserna av genetiska manipulationer på specifika cell typer. Eftersom fler och fler transgena djur blir tillgängliga, märkning ytterligare specifika cell typer av intresse, förväntar vi oss att de protokoll som beskrivs här kommer att växa i deras tillämplighet och potential.
Introduction
Cell sortering är ett kraftfullt verktyg för isolering av levande celler av intresse från en heterogen blandning av celler. Celler kan sorteras baserat på storlek och form kriterier, samt uttrycket av fluorescerande markörer1,2. Ofta används fluorophore-konjugerade anti kroppar för att märka distinkta cell typer genom att inrikta sig på cellspecifika ytantigener3,4. Alternativt, transgena djur eller virus leverans system har konstruerats för att uttrycka fluorophores under cellspecifika initiativtagare5,6. Historiskt sett var utvecklingen av transgena verktyg och djur kostsam och tids krävande. På senare tid har minskade kostnader och färre tekniska svårigheter lett till en dramatisk ökning av antalet tillgängliga reporter linjer. Eftersom tillgängligheten av transgena verktyg och reporter djur fortsätter att växa, så också bör nyttan och tillämpligheten av fluorescence-baserade cell sortering metoder.
Vi visade nyligen att cell sortering från transgena djur rutinmässigt kan tillämpas för att rena primära neuroner som förberedelse för cell kultur7. Genom att sortera celler från antingen råttor eller möss, kunde vi isolera och kultur fluorescerande nerv celler, som uttrycker fluorescerande reporter proteiner specifikt i antingen GABAergic eller glutamatergic nerv celler6,8,9. Genom att studera dessa renade neuronala kulturer, kunde vi identifiera en viktig skillnad i hur GABAergic och glutamatergic nerv celler beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission7. Dessutom, genom co-culturing gliaceller celler med renade nerv celler, kunde vi utvidga på tidigare observationer som visar den kritiska roll som gliaceller celler spelar i tillväxt och överlevnad av nerv celler10,11. Således kunde vi genom en kombination av cell sortering och cell kultur studera inte bara utvecklingen av specifika neuron typer isolerat, utan kunde undersöka påverkan av gliaceller på deras funktion.
Vi presenterar här ett protokoll för rening och kultur av GABAergic och glutamatergic nerv celler från cortex och Hippocampus av transgena möss eller råttor. Vi presenterar också en metod för icke-kontaktsamodling av renade nerv celler och gliaceller, anpassade från Geissler et al.12. För att generera renade GABAergic kulturer, vi har sorterat fluorescerande neuroner från VGAT-Venus-A Wistar råttor8 eller Vgat-Venus möss13, som selektivt uttrycker en förstärkt gult fluorescerande protein variant (Venus) i > 95% av kortikala GABAergic nerv celler. För att generera renade glutamatergic kulturer, vi har sorterat fluorescerande neuroner från NexCre; Ai9 möss6,9, som uttrycker tdtomato i kortikala glutamatergic nerv celler. Hela sorterings-och kultur förfarandet kan utföras inom 3-4 h och kan användas för att generera hundratals replikkulturer som lämpar sig för elektro fysiologiska, morfologiska och cell överlevnad analys. Metoden är enkel, reproducerbar och kan producera renade neuronala kulturer som är större än 97% ren för cell typ av intresse.
Protocol
Alla förfaranden och djur underhåll utfördes i enlighet med de institutionella rikt linjerna, den tyska djur skydds lagen och Europeiska rådets direktiv 86/609/EEG om skydd av djur, i närvaro av tillstånd från lokala myndigheter (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Anmärkning: Detta protokoll beskriver kulturen av renade nerv celler från en enda transgena mus eller råtta pup (postnatal dag 0 – 2). Alla tekniker ska utföras under sterila förhållanden. Alla lösningar ska steriliseras med hjälp av ett 0,2 μm filter (se material tabell). Glas överdrag och dissektion verktyg bör värmesteriliseras för 3 h vid 185 ° c.
1. beläggning glas täckglasen med Poly-L-Lysin
- Förbered glas täckglasen genom att avfrostning en 5 mL alikvot av 200 μg/mL Poly-L-Lysin (PLL) lösning. Späd ut denna stam lösning till 20 μg/mL genom att tillsätta 45 mL rent vatten med injektions kvalitet. Filtrera-sterilisera lösningen i ett nytt 50 mL koniskt rör. Märk detta rör som "PLL steril".
Anmärkning: Använd vatten som lagrats i rums temperatur för att påskynda avfrostnings processen. - Tillsätt 100 sterila, runda, 12 mm glastäckslinker till den sterila PLL-lösningen. Skaka röret var 5 – 10 min, för 2 – 3 min, för att säkerställa jämn beläggning. Täck täckglasen på detta sätt för 1 h.
Anmärkning: Tyska-tillverkade runda glas täckglasen (diameter = 12 mm) föredras, eftersom de ger en pålitlig kultur yta och passar lätt in i brunnarna i en 24-brunn cell kultur plattan. - Efter 40 min PLL beläggning, ta 2 bitar av mjuk papper och lägg dem platt i flödet skåpet. Sterilisera papperet med 70% etanol, sedan platta för att ta bort veck och låt torka.
- Efter beläggning av glas täckglasen för 1 h med PLL, ta bort överflödig PLL lösning och tillsätt sterila injektion grade vatten. Skaka försiktigt täckglasen i 2 – 3 s så att överflödig PLL kan avlägsnas. Upprepa detta sköljsteg 2 ytterligare gånger.
- Ta bort överflödigt vatten, och sedan överföra täckglasen till den sterila vävnaden papper. Separera försiktigt varje täckslip med böjda pincett och låt torka.
Anmärkning: Täckglasen som inte lätt separeras kan kasseras. Alternativt kan en liten mängd vatten tillsättas för att hjälpa separation. - När torr, överföra täckglasen till en 24-brunn kultur plattan.
Anmärkning: Täckglasen bör göras klar ca 30 min – 1 h innan dissektion processen påbörjas. Plattorna kan förvaras i en inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 tills det behövs.
2. dissociation av hippocampal och kortikal vävnad
- Beredning av cell odlings lösningar
- För dissociation av nervvävnad, först avfrostning en 40 mL alikvot av cellkulturbuffert (sammansättning [i mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2Po4, 1 MgSO4· 7h2o, 1 CaCl2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O och 25 D-glukos, pH = 7,4). Mät upp 12 mL cellkulturbuffert i ett 15 mL koniskt rör; etiketten som "BSA". Mät upp 5 mL cellkulturbuffert till ett annat 15 mL-rör; etikett som "papain". Inkubera båda rören i ett vatten bad i 15 min vid 37 ° c.
- Filtrera-sterilisera resterande cellkulturbuffert, märk som "Buffertsteril" och förvara vid 4 ° c tills det behövs.
- Väg upp 120 mg bovint serum albumin (BSA) och tillsätt i röret märkt "BSA". Väg upp 7 mg papain och tillsätt i röret märkt "papain". Returnera båda rören till vatten badet i 15 min.
Anmärkning: Det är bra att lägga till en liten mängd buffert till väga båten för att under lätta överföring av papain pulvret. - När alla pulver har lösts, filtrera-sterilisera varje lösning till en fräsch 15 mL konisk tub. För röret papain, märk den filtrerade lösningen som "papain-steril". För slang BSA, dela den sterila BSA-lösningen i 3 tuber, vardera innehåll ande 4 mL BSA-lösning. Märk varje tub som "BSA-steril" och antingen "1", "2" eller "3". Returnera alla rör tillbaka till vatten badet och fortsätta att Inkubera vid 37 ° c tills det behövs.
- Förberedelse för vävnads dissektion
- Ta en enda bit av 35 mm filter papper (se material tabell) och sterilisera med 70% etanol; Låt torka i locket på en 100 mm petriskål i ett flödes skåp.
- Lägg ut saxen, pincett, skalpell och spatel (se tabell över material) som krävs för dissektion av hippocampus och cortex.
- Placera 2 35 petriskålar och en 100 mm petriskål som innehåller sterilt filtrerpapper på en lättillgänglig plats i mitten av flödes skåpet.
- Samla in transgena NexCre; Ai9 och VGAT Venus mus ungar som ska dissekeras. Använd en Lys rörs lampa med lämplig excitation och utsläpp filter (se tabell över material) för att diskriminera fluorescerande ungar från vilda typ littermates.
- Omedelbart innan dissekera djur, fyll varje 35 mm petriskål med kyld, steril cell kultur buffert.
Anmärkning: En petriskål är för rengöring av verktyg mellan dissektioner, och den andra är för att samla in hippocampus och cortex.
- Vävnad dissektion
- Så snart cell kultur buffert hälls, hals huggning en postnatal dag 0-2 transgena mus eller råtta pup med stora, vassa saxar och använda en steril 100 mm petriskål att överföra huvudet i flödet skåpet. Använd pincett, sax och en spatel för att försiktigt överföra hjärnan hos en transgen pup till sterila filtrerpapper.
- Använd en typ 22 skalpell för att dissekera lillhjärnan och separera de 2 halvkloten. Använd en liten spatel för att rulla halvkloten i sidled. På varje halvklotet, tryck ner försiktigt så att hjärn Barken kommer i kontakt med filter papper. Försiktigt flytta mitthjärnan regioner att avslöja hippocampus och cortex.
Anmärkning: Var noga med att inte tillämpa för mycket tryck när du trycker ner på hjärn halvorna eller cellerna kan bli krossade. - Använd en skalpell eller spatel för att separera hippocampus och cortex från varje halvklotet. Överför dissekcted vävnad till en 35 mm petriskål som innehåller kyld cell kultur buffert.
Anmärkning: Om dissekera flera djur, lagra steril cell kultur buffert i en 50 mL konisk tub på is. Efter varje dissektion, överföring dissekera vävnad till kyld cell kultur buffert. - Efter en lyckad dissektion av cortico-hippocampal vävnad, överföra steril papain lösning från vatten badet till flödet skåpet. Använd en 3 mL Pasteur pipett för att överföra dissekcted hippocampus och cortex till locket på en steril 35 mm petriskål. Hacka i en Criss-Cross rörelse, med hjälp av den platta delen av en typ 22 skalpell, tills vävnaden är i små bitar.
- Använd en liten mängd papain lösning för att överföra den hackade vävnaden från locket på petriskål till sterila papain röret. Återlämna papain röret till vatten badet och inkubera vävnaden vid 37 ° c i 25 min.
- Under papain inkubation, make up komplett fluorescens Media lösning. Avfrostning en 1 mL alikvot av B27, en 0,5 mL alikvot av Glutamax och en 0,5 mL alikvot av Pen-STREP. Alikvot 48,5 mL av vilo läge ett lågt fluorescensmedia till ett 50 mL koniskt rör. Tillsätt B27, Glutamax och Pen-STREP till lösningen. Skaka lösningen väl, sedan filtrera-sterilisera och etikett som "Hibernate en komplett media" (med datum och initialer). Inkubera vid 37 ° c i ett vatten bad.
- Efter inkubering av papain, överför papain-röret och sterila BSA-Tubes till flödes skåpet. Använd en 1 mL Pasteur pipett för att ta bort endast cortico-hippocampal vävnad från papain röret i BSA-Tube 1.
Anmärkning: Var noga med att minimera överföringen av överskott papain lösning.
- Dissociation av celler
- För att bryta upp några stora klumpar av vävnad, triturate vävnaden flera gånger med en 1 mL Pasteur pipett. Efter detta, triturate vävnaden 7 gånger med hjälp av en fin spets Pasteur pipett. Lämna vävnaden att stå för 30 s, vilket gör att större bitar av vävnad till sediment.
- Efter 30 s, överför den nedre 1 mL lösning och vävnad från BSA-Tube 1 till BSA-Tube 2. Triturate vävnaden i BSA-Tube 2 flera gånger med hjälp av en fin spets Pasteur pipett.
- Efter triturering, överföring igen den nedre 1 mL vävnad och lösning från BSA-Tube 1, men nu till BSA-Tube 3. Triturate vävnaden i BSA-Tube 3 flera gånger med hjälp av en fin spets Pasteur pipett.
- Efter triturering, överför all lösning och vävnad från rören 2 och 3 till BSA-Tube 1. Triturate ytterligare 2-3 gånger och centrifugera vid 3 000 x g i 3 min.
- Under centrifugering, make up komplett neural basal A media (NBA Media). Alikvot 48,5 mL av NBA-media till en 50 mL konisk tub och inkubera vid 37 ° c i ett vatten bad. Märk detta rör "NBA endast". Dessutom, avfrostning en 1 mL alikvot av B27, en 0,5 mL alikvot av Glutamax och en 0,5 mL alikvot av Pen-STREP vid rums temperatur.
- Efter centrifugering, ta försiktigt bort supernatanten från pelleterade vävnad och återsuspendera cellerna i 2 mL komplett media. Använd en P1000 pipett för att triturera vävnaden upp och ner 20 gånger.
Anmärkning: Var noga med att inte Pipettera cellerna för kraftigt. Om för mycket tryck appliceras kan cellerna skadas. - Använd en 1 mL Pasteur pipett för att filtrera cell SUS pensionen genom en sil med 30 μm cell till ett prov rör av polystyren.
Anmärkning: Om cell SUS pensionen inte passerar omedelbart genom cell sikten, kan det vara nödvändigt att trycka ovanpå sikten med en steril handske för att starta flödet. Detta viktiga steg förhindrar igensättning av cell Sorteraren. - För insamling av neuroner efter sortering, Förbered samlings rören genom att Pipettera 300 μL av hela mediet till erforderligt antal polypropylenrör.
- Cell SUS pensionen är nu klar att tas till cell Sorteraren för sortering. Ta cell SUS pensionen, extra samlings rör och reserv delar kompletta medier om provet spädas ut.
3. cell sortering av renade GABAergic eller Glutamatergic nerv celler
Anmärkning: För att minimera risken för bakteriell kontaminering under sortering skölj prov slangen i Sorteraren med 70% etanol i minst 5 min före sortering. Detaljerade sorterings parametrar varierar mellan olika instrument, grundläggande överväganden är följande.
- Under den första cell sorteringen upprättar du nivåer av bakgrundsfluorescens från omärkta celler genom att sortera och jämföra celler från ett vildtyps djur.
- För varje fluorescerande cell typ som ska sorteras, Välj lämplig magnetisering och utsläpp filter. Excite Venus och TdTomato proteiner med 488 nm eller 531 nm excitation våg längder, respektive. Detektera utsänt ljus genom 530/40 respektive 575/30 utsläpps filter uppsättningar.
- Tillsätt polypropylen samlings rör, innehåll ande 300 μL komplett media, till cell Sorteraren för cell insamling.
- För hög renhet, sortera ljust märkta fluorescerande celler (se figur 1b till exempel punkt diagram av sorterade celler).
- Efter sortering, för optimala resultat, utför ett renhets test av de sorterade cellerna för att uppskatta renhets grader. Observera att den normala återvinnings graden för celler efter sortering är mellan 70 – 80%.
- Anteckna antalet celler som sorteras i varje samlings rör. Detta värde anges av cell sorterings instrumentet.
Anmärkning: Cell sortering kan utföras med hjälp av ett 70 μm munstycke (70 psi slida vätske tryck) eller ett 100 μm munstycke (20 psi slida vätske tryck).
4. odling av sorterade neuroner
- Efter cell sortering, överföra insamlade celler till 2 mL runda botten centrifug rör, med en 1 mL Pasteur pipett. Centrifugera cellerna vid 3 000 x g i 3 min för att bilda en cellpellet.
Anmärkning: För att hjälpa till att identifiera placeringen av cellpelleten, orientera de runda botten centrifugrör med gångjärnet på locket utåt, vilket gör att cellpelleten kan bildas på bak sidan av centrifugrör (dvs. på samma sida av röret som gångjärnet). - Under centrifugering, tillsätt 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax och 0,5 mL av Pen-STREP till 48,5 mL av pre-uppvärmda NBA-media. Skaka lösningen väl, sedan filtrera sterilisera och etikett som "NBA komplett media" (med datum och initialer). Återgå till vatten badet tills det behövs.
- Efter centrifugering, Använd en 1 mL Pasteur pipett för att överföra supernatanten till ett annat centrifugerör (behåll den supernatanten Incase cellpelleten stördes). Återsuspendera cellpelleten i den erforderliga mängden färdigvärmda NBA-medier för att uppnå en cell täthet på 1 000 celler/μL. Återsuspendera cellerna genom att Pipettera upp och ner med en P200-eller P1000-pipett.
- För att bekräfta närvaron av dissocierade celler, kontrol lera cell lösningen under ett Mikroskop, med en 4x eller 10x objektiv. Alternativt kan du Pipettera en liten mängd cell lösning på en täckslip och kontrol lera under Mikroskop. Om det finns ett stort antal celler, kan supernatanten från steg 4,3 kasseras.
- Innan plätering cellerna, virvel på en medelhög hastighet för 2-3 s för att säkerställa en jämn cell SUS pension. Efter vortexing, snabbt Pipettera 10 μL av cell SUS pensionen till mitten av varje täckglasen. Efter pipettering av cellerna, snabbt tillbaka varje platta till inkubator (5% CO2/37 ° c) och inkubera i 1 h.
Anmärkning: Om du lägger till celler till flera 24-well plattor, se till att även celldensiteter genom att vortexa celler mellan plattorna. - Efter 1 h, mata cellerna med 500 μL av pre-värmde kompletta NBA-media och återgå till inkubator.
Anmärkning: Vid utfodring av cellerna, är det viktigt att Pipettera mediet försiktigt ner på sidan av brunnen för att undvika cell avlossning. För korta experiment (< 16 dagar), utfodring på ovanstående densitet är inte nödvändigt. Vid plätering en större densitet av celler, tätare utfodring intervall kan krävas (se diskussion).
5. astrocytberikad Glial stöd kulturer
Anmärkning: Produktionen av glialkulturer14 och användningen av cell kultur skär har beskrivits tidigare12. I korthet, astrocytberikade glia kulturer härrör från cortico-hippocampal vävnad (med meninges bort; P2 – P5), som har odats i en vecka på en 20 μg/mL PLL-belagd 6-well-plattor, i serum kompletterade DMEM-medier.
- För att samodla renade nerv celler och gliaceller, passage konflytande gliaceller till erforderligt antal cell kulturer skär (0,4 μm porstorlek-se tabell över material). För passage av cellerna, ta bort en 6-brunn platta som innehåller konflytande gliaceller från inkubator och tvätta 2 brunnar, 2 gånger, med 2 mL förvärmda (37 ° c) fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS-lösningen och Använd en P1000 pipett för att lägga till 1 mL förvärmda (37 ° c) trypsin (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) lösning till varje brunn.
- Returnera 6-brunnen plattan till inkubator och kontrol lera varje 2-3 min för cell avlossning.
- När signifikant cell avlossning har inträffat, Pipettera cellerna och cell lösningen försiktigt upp och ner med hjälp av en fin spets Pasteur pipett, för att hjälpa ytterligare lossnar och separation av enskilda celler.
- Överför cell lösningen till ett 15 mL koniskt rör och centrifugera vid 3 000 x g i 3 min.
- Återsuspendera cellerna med en P1000-pipett i 5 mL förvärmda (37 ° c) NBA-kompletta medier genom att Pipettera försiktigt upp och ner tills cellpelleten är i lösning.
- Utför en cell räkning med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
Anmärkning: Efter 7 dagar i kultur, cirka 750000-1000000 celler kan skördas från varje brunn av en 6-well tallrik. - Platta 40 000 glialceller till varje cell odlings insats i en 500 μL DROPP (80 celler/μL).
- Efter att cellerna att följa 1 h, använda sterila pincett att överföra Glial täckta cell kultur skär till 24-well plattor som innehåller renade nerv celler. Avlägsna överskotts material från ytan på cell odlings insatserna (cirka 300 μL).
Anmärkning: Som luft bubblor kan ofta fastna under cell kulturen skär, kan det vara nödvändigt att försiktigt luta insatserna för att få bort dessa bubblor. Om fler glialceller tillsätts till cell odlings insatsen kan ytterligare tvätt-och centrifugersteg krävas för att avlägsna överflödigt trypsin, vilket kan vara skadligt för cellernas överlevnad.
Representative Results
Dissociation och cell sortering av fluorescerande neuroner från transgena mus eller råtta cortico-hippocampal vävnad kan utföras i cirka 3-4 h. Resultatet är en population av mycket rena fluorescerande neuroner, som kan odlas i kulturen för 16 dagar.
För att generera renade kulturer identifierades transgena djur först med hjälp av en Lys rörs lampa med lämpliga filter uppsättningar (exempel på fluorescerande neonatal VGAT Venus och NexCre; Ai9 mus ungar visas i figur 1a). Efter identifieringen av transgena djur, dissekerade vävnad separerades, och de starkast fluorescerande neuronerna var sorteras för att producera en renad cell population. Exempel på fluorescensintensitet dot tomter för NexCre; Ai9 och VGAT Venus mus neuroner, som erhållits under FACS, visas i figur 1b. När optimerad, är det möjligt att skörda mellan 500 000 och 800 000 celler från cortex och Hippocampus av enskilda P0-2 NexCre; Ai9-eller VGAT Venus-möss. Celler kan sorteras med en hastighet uppåt av 600 händelser/s. uppskattningar av cell renhet utfördes med hjälp av DAPI som en nukleär markör (figur 1c). Genom att sortera starkt positiva celler, kan en renhet på mer än 97% rutinmässigt uppnås7.
Efter lyckad sortering, bör pläterade nerv celler visas runt i form, har en slät membran och bör ses för att gro neuriter efter cirka 1 h in vitro (figur 2A, B). Med 7 dagar in vitro, även om vissa celldöd kan vara uppenbara, livskraftiga celler bör vara närvarande i alla odlings förhållanden (figur 2C, D). Vid 12 – 16 dagar in vitro, med hjälp av helcellig patch-Clamp inspelningar och biocytin-fyllning15, är det möjligt att undersöka den morfologiska och elektro fysiologiska utvecklingen av renade nerv celler (figur 3). Analys av renade kulturer visar att både glutamaterga och GABAergic nerv celler kunde förlänga axoner och dendriter från deras cell kroppar (figur 3a, B) och behålla förmågan att generera åtgärder potentialer som svar på suprathreshold depolariserande aktuella injektioner (figur 3c, D). Särskilt, emellertid, efter rening, endast GABAergic nerv celler fick betydande mängder spontan synaptisk transmission, och glutamatergic nerv celler får mycket lite synaptisk transmission i avsaknad av gliaceller (figur 3e , F) och 7.
Som vi tidigare har rapporterat, celler i renade kulturer tenderar att överleva mer dåligt än de i osorterade kulturer och har betydligt mindre dendriter och axoner7. För att övervinna dessa underskott har vi anpassat och tillämpat metoder för att stödja utvecklingen av renade kulturer med gliacellerna12,14. Den cellulära sammansättningen av våra glialstöd kulturer (DIV7) visas i figur 4a. Dessa kulturer innehöll övervägande gliaceller fibrillärt surt protein (gfap) positiva astrocyter, men innehöll också några kluster av differentiering molekyl (CD11b) positiva mikroglia och myelin grundläggande protein (MBP) positiva oligodendrocyter. Efter DIV 7, dessa celler kan passas till cell kultur insatser för att ge icke-kontakt stöd av renade nerv celler (figur 4b, C). Analys av glia-neuron co-kulturer visar att cirka 40 000 glialceller var tillräckliga för att förbättra den långsiktiga överlevnad och tillväxt av både renade glutamaterga och GABAergic nerv celler (figur 4D, E)7. Dessutom visar Elektrofysiologisk analys att glutamaterga nerv celler, co-odlade med gliaceller, var mycket aktiva och hade starkt ökad nätverks aktivitet (andel av gliaceller stöds glutamatergic nerv celler skjuter skurar av åtgärder potentialer: 62%; n = 28; Figur 4F , G). Glial stöd är därför viktigt inte bara för att främja neuron tillväxt och överlevnad, men också för att främja synaptisk överföring och etablering av nätverks aktivitet i glutamatergic kulturer.
Figur 1: rening av glutamaterga och GABAergic nerv celler. (A) bilder som visar fluorescerande signal från transgenexpression av TdTomato i NexCre; Ai9 möss (topp) och Venus i VGAT Venus möss (botten). Skal streck = 5 mm. (B) intensitet scatter tomter av TdTomato och Venus fluorescens av cortico-hippocampal separerade celler från NexCre; Ai9 möss (överst) och VGAT Venus-möss (nederst). Starkt fluorescerande TdTomato eller Venus neuroner valdes för sortering (indikeras av gating lådor). (C, vänster) Konfokala bilder av sorterade TdTomato (topp) och Venus (Bottom) positiva nerv celler. (C, höger) Sammanfogad bild som visar celler samfärgas med DAPI (i blå pseudofärg). TdTomato fluorescens är endogent och förblir stark trots fixering (i magenta pseudocolor). Venus uttryck förstärks med hjälp av en kombination av en primär anti kropp riktad mot GFP och Alexa fluor-488-konjugerad sekundär anti kropp (i grön pseudofärg). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cell odling av renade glutamaterga eller GABAergic nerv celler. (A) kombinerade infraröda (ljusa fält) bilder och överlagt fluorescerande signal från TdTomato (vänster) och Venus (höger) positiva nerv celler odlade för 1 h in vitro-. Vita pilar visar platsen för växande neuriter. (B) konfokala bilder av TdTomato (vänster) och Venus (höger) positiva nerv celler odlade för 1 h in vitro-. (C, D) Bright fält (överst) och kombinerade ljusa fält och fluorescerande bilder (botten) av TdTomato (C) och Venus positiva nerv celler (D) odlade i 7 dagar in vitro (DIV). Vita pilar visar placeringen av kondenserade kärnor från döda celler. Färgade pilar identifiera fluorescensmarkerade märkta neuroner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: de renade neuronerna morfologiska, elektro fysiologiska och synaptiska egenskaper. (a, B) Konfokala bilder av TdTomato (A) och Venus positiva nerv celler (B) vid DIV 13 och DIV 14, respektive. Celler presenteras i svart med hjälp av en inverterad look-up tabell för att hjälpa neurite visualisering. Insatser visar den fluorescerande signal som uttrycks av de identifierade neuronerna. (C, D) Spänningen svar från en TdTomato (C) och Venus positiv neuron (D) till hyperpolarizing (200 till-20 pA, i 20 pA steg) och depolariserande (200 pA) ström pulser, erhålls genom hel-cell patch-Clamp inspelningar. Insets visar motsvarande inspelade neuroner. Den vilande membranpotentialen hos varje cell indikeras till vänster om inspelnings spårningen. (E, F) Representativa spännings klämma inspelningar (10 s) erhålls från TdTomato (E) och Venus positiva nerv celler (F). Spontana excitatoriska postsynaptiska händelser (EPSCs) registrerades från TdTomato positiva nerv celler, upprätthålls vid en hållningspotential på 50 mV. Spontant förekommande hämmande postsynaptiska händelser (IPSCs) registrerades från Venus positiva nerv celler upprätthålls på en hållningspotential på 0 mV. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: stödja neuron utveckling med gliaceller co-Culture. A) konfokala bilder av glialkulturer som är immunmärkta för gliaceller fibrillärt surt protein (gfap, vänster), kluster av differentierings molekyl (CD11b, mitten) och myelin bas protein (MBP, höger). Glial celler var odlade för DIV 7. (B) bilder av cell kultur skär som används för att samodla gliaceller med renade nerv celler i ett berörings fritt arrangemang. (C) en schematisk av det rumsliga arrangemang som används för att samodla nerv celler och glia. (D, E) Konfokala bilder av TdTomato (D) och Venus positiva nerv celler (E), odlas i 14 dagar, i avsaknad (vänster) eller närvaro (höger) gliaceller stöd. (F, G) Ström klämma inspelningar (60 s) från TdTomato (F) och Venus positiva nerv celler (G) odlade i 14 dagar i frånvaro (överst) eller närvaro (botten) av gliaceller stöd. Neuronerna registrerades vid deras vilande membran potential (fram till vänster om varje inspelning spår). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi beskriver här en metod som kombinerar sortering och odling av primära neuroner för att generera renade neuronala cell kulturer. Denna metod tar cirka 1 h längre än en typisk primär separerad neuronala kultur protokoll ännu tillåter generering av hundratals replikerade kulturer som innehåller specifika neuronala typer. Renade neuroner, som kan odlas isolerat i minst 16 dagar, utvidga axoner och dendriter och kan avfyra repetitiva tåg av åtgärder potentialer (figur 2 och figur 3). Viktigt är att dessa celler är mottagliga för samma experimentella analyser som vanliga primära separerade neuronala kulturer, inklusive elektro fysiologiska, morfologiska och överlevnads analyser. En stor fördel med att arbeta med dessa renade kulturer är att utvecklingen av specifika cell typer kan studeras isolerat. För att stödja utvecklingen av renade kulturer, presenterar vi också ett protokoll för co-culturing renas nerv celler med gliaceller. Som visats tidigare, co-culturing renade nerv celler med gliaceller celler förbättrar deras överlevnad, tillväxt och kan främja nätverk bildning7 (figur 4). Således presenterar vi här en kombination av metoder som bör ytterligare studiet av glia-neuron interaktioner och kan visa sig användbart för att studera utveckling och interaktion mellan andra cell typer av intresse.
Studier på kulturer av renade glutamaterga neuroner har avslöjat grundläggande insikter i hur gliaceller celler utsöndrar faktorer som främjar utvecklingen av neuronala nätverk och synaps formation16,17,18 . I allmänhet, metoder för rening av specifika neuron typer har mer framgångs rikt tillämpats för att studera utvecklingen av glutamaterga nerv celler snarare än GABAergic nerv celler. Detta har lett till en skillnad i vår förståelse av hur dessa två cell typer utvecklas. Med tanke på att GABAergic och glutamatergic nerv celler skiljer sig avsevärt när det gäller deras anatomi, fysiologi och utvecklingsrelaterade ursprung, det är viktigt att vi studerar GABAergic nerv celler i sin egen rätt, för att bättre förstå deras funktion och fysiologi. Med hjälp av protokollet som presenteras här, har vi tidigare identifierat viktiga skillnader i hur GABAergic och glutamatergic nerv celler beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission7. Genom att publicera detta protokoll hoppas vi att andra kan göra ytterligare insikter i de viktiga interaktioner mellan nerv celler och gliaceller.
I detta protokoll, vi beskriver en flödescytometri baserad cell sortering metod, som vi har använt för att rena GABAergic eller glutamatergic nerv celler från olika transgena gnagare linjer. Venus positiva GABAergic nerv celler sorterades från VGAT Venus möss13 eller råttor8 och tdtomato positiva glutamaterga neuroner sorterades från nexcre; Ai9 möss (uppfödda ursprungligen från NexCre9 och Ai9 reporter linjer6, se Turko et al., 20187). På senare år har det blivit betydligt lättare att generera transgena djur på grund av tekniska framsteg. Som sådan, till gången på djur som uttrycker fluorescerande molekyler, i många olika cell typer, har vuxit snabbt. Detta har i sin tur ökat användningen och tillämpligheten av fluorescerande aktive rad cell sortering. Medan alternativa metoder för att isolera celler av intresse för närvarande finns16,19,20, de är något hindras av deras beroende av till gången på lämpliga anti kroppar till naturligt förekommande yta Antigener. Detta begränsar deras mångsidighet jämfört med fluorescens-baserade cell sorterings metoder, som redan kan användas för att sortera celler från de många cellspecifika transgena reporter djur som redan finns tillgängliga. Trots detta, när optimerade, antikroppsbaserade sorterings metoder kan vara snabb och hög framställning, och kan ännu bättre bevara cellanatomi, genom att tillåta rening av celler med sina axoner och dendriter intakt21. Metoder för sortering av anti kroppar bör därför fortfarande beaktas när man fattar beslut om en sorterings strategi. I ändan kommer den cell typ av intresse, den ålder vid vilken celler ska sorteras, till gången på transgena djur eller ytantigen och antalet celler som behövs vara de avgörande faktorerna när man väljer den lämpligaste sorterings strategin.
Även om fluorescensbaserad cell sortering är en enkel och reproducerbar metod för rening av celler, bör försiktighet iakttas under vissa steg i protokollet för att bevara cell kvaliteten. Till exempel, efter varje centrifugeringssteg, är det viktigt att se till att cellpelleten återsuspenderas så snabbt som möjligt och att cellerna framgångs rikt har återhämtat sig. Ibland kan cellpelleten störas när man tar bort supernatanten. Det rekommenderas därför, mellan centrifugeringssteg, att kontrol lera närvaron av celler under Mikroskop för att utesluta någon omfattande cell förlust. Efter cellplätering bör cellerna tillåtas att hålla sig i minst 1 h före utfodring. Om celler matas för tidigt, kan vissa celler bli lossas från täckglasen, vilket minskar kultur tätheten. Efter 1 h i kulturen, är det klokt att bedöma cell hälsa. Om celler inte verkar friska (ett exempel på friska celler visas i figur 2A), eller om det finns betydande celldöd, kan detta vara en indikation på ett problem under dissociation eller sortering förfarande. En annan viktig faktor, när odla någon cell typ, är att ta hand när man hanterar cell odlings mediet. NBA-media innehåller fenol röd, som fungerar som en pH-indikator22. Om mediet blir för gult i färg, då detta tyder på att pH är för surt; om mediet blir för rosa, då detta tyder på att lösningen är för basisk. Lager lösningar öppna under långa perioder, särskilt Media aliciteras i koniska rör, tenderar att bli mer alkaliska över tiden. Det är därför klokt att göra upp färska kompletta NBA-medier varje vecka och komplett Media varannan vecka (mediet buffertar under atmosfäriska förhållanden och bör därför vara mer stabil). Med dessa punkter i beaktande bör det vara möjligt att etablera renade cell kulturer i alla laboratorier med till gång till cell sortering och cell odlings utrustning.
I de flesta av våra experiment producerade vi renade kulturer från ett enda djur. Men vid rening av celler för biokemiska analyser kan det vara nödvändigt att samla ihop flera djur för sortering. Vi har framgångs rikt sorterat upp till 8 embryonala möss (embryonala dag 13 djur) med hjälp av ovanstående protokoll (data visas inte). Men om fler djur skall sorteras, kan det vara nödvändigt att öka volymen av både papain och BSA-lösningar (beskrivs i steg 2.1.1-2.1.4) för att rymma ökningen av vävnads mängden. Dessutom, om fler celler är klädd i kultur, då en mer frekvent utfodring schema kan krävas. Som utgångs punkt, celler kan matas var 7 dagar genom att ta bort 100 μL av konditionerade medier och lägga 200 μL av färska kompletta NBA-media. För att neuron livs kraft, om sortering mer djur, bör man överväga att minimera sorterings tiden så mycket som möjligt. Detta kräver ofta noggrann optimering av nedströms analyser för effektiv användning av renade celler. Vi har rutinmässigt sorterat mus neuroner till priser av 600 händelser/s, upp till 500000-800000 celler per djur (postnatal dag 0-2). Detta var dock utan uttömmande optimering av sorterings hastigheter och villkor. Därför bör ytterligare förbättringar i sorterings hastighet och avkastning vara möjliga.
Renade nerv celler kräver glia-konditionerade medier för sin överlevnad. Detta har visats tidigare av odling av nerv celler och glialceller separat, innan behandling av nerv celler med gliaceller konditionerade Media10. I våra experiment valde vi att stödja renade nerv celler genom odling av gliaceller på semi-permeabla cell kulturer skär, som är placerade inuti cell odlings plattan. Denna metod har framgångs rikt tillämpats för att studera glia-derived extracellulära matrix proteiner och deras interaktion med nerv celler12. Den icke-kontakt, men kontinuerligt stöd som tillhandahålls av denna metod har ett antal fördelar jämfört med den separata cell kulturen. Framför allt, den co-Culture av gliaceller med nerv celler möjliggör kontinuerlig reglering och konditionering av cell odlings medier, som mer liknar in vivo situationen. Dessutom möjliggör kontinuerlig co-Culture av celler för potentiell feedback signalering mellan nerv celler och glia, vilket inte är möjligt i separerade kulturer. I vårt protokoll, om så krävs, kan den kontinuerliga samkulturmetoden enkelt utelämnas och en klassisk behandling av nerv celler med glia-betingade Media kan utföras.
Sammanfattnings vis syftar det protokoll som presenteras här för att ge läsaren en solid grund från vilken de kan etablera sina egna renade cell kulturer experiment. Vi förutspår att till gången på transgena djur och virala konstruktioner kommer att fortsätta att öka under överskådlig framtid. Därför är cell sortering tekniker som bygger på fluorescens sannolikt att bli ännu mer allmänt använda och värdefulla.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka den utmärkta tekniska stöd som tillhandahålls av Jenny Kirsch och Ana Teichmüller vid Flow Cytometri Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin. Vi skulle vilja tacka Jie Song för hans hjälp med överlevnad analys. Vi vill också tacka Rita Loureiro för hennes hjälp att fånga bilder av fluorescerande möss och Christian Ebner för kritisk läsning av protokollet. VGAT-Venus transgena råttor genererades av Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi och Y. Kawaguchi i Institutet för fysiologiska vetenskaper, Okazaki, Japan, med pCS2-Venus från Dr. A. Miyawaki. Detta arbete stöttades av det tyska forskning rådet (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 till DROPP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J.
- Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
- Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
- Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).
- Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
- Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
