Detta protokoll beskriver en cell sortering baserad metod för rening och kultur av fluorescerande GABAergic eller glutamaterga nerv celler från neocortex och Hippocampus av postnatal möss eller råttor.
Det övergripande målet med detta protokoll är att generera renade neuronala kulturer som härrör från antingen GABAergic eller glutamaterga nerv celler. Renade nerv celler kan odlas i definierade medier för 16 dagar in vitro och är mottagliga för alla analyser som vanligt vis utförs på separerade kulturer, inklusive elektro fysiologiska, morfologiska och överlevnad analyser. Den stora fördelen med dessa kulturer är att specifika cell typer kan studeras selektivt i avsaknad av komplexa yttre influenser, såsom de som uppstår från gliaceller andra neuron typer. När man planerar experiment med renade celler är det dock viktigt att notera att neuronerna är starkt beroende av glia-betingade medier för sin tillväxt och överlevnad. Dessutom, glutamatergic nerv celler ytterligare beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission. Vi beskriver därför också en metod för samodling av nerv celler och gliaceller i ett berörings fritt arrangemang. Med hjälp av dessa metoder, har vi identifierat stora skillnader mellan utvecklingen av GABAergic och glutamatergic neuronala nätverk. Att studera kulturer av renade neuroner har således stor potential för att främja förståelsen av hur nerv systemet utvecklas och fungerar. Dessutom kan renade kulturer vara användbara för att undersöka den direkta effekten av farmakologiska agens, tillväxtfaktorer eller för att undersöka konsekvenserna av genetiska manipulationer på specifika cell typer. Eftersom fler och fler transgena djur blir tillgängliga, märkning ytterligare specifika cell typer av intresse, förväntar vi oss att de protokoll som beskrivs här kommer att växa i deras tillämplighet och potential.
Cell sortering är ett kraftfullt verktyg för isolering av levande celler av intresse från en heterogen blandning av celler. Celler kan sorteras baserat på storlek och form kriterier, samt uttrycket av fluorescerande markörer1,2. Ofta används fluorophore-konjugerade anti kroppar för att märka distinkta cell typer genom att inrikta sig på cellspecifika ytantigener3,4. Alternativt, transgena djur eller virus leverans system har konstruerats för att uttrycka fluorophores under cellspecifika initiativtagare5,6. Historiskt sett var utvecklingen av transgena verktyg och djur kostsam och tids krävande. På senare tid har minskade kostnader och färre tekniska svårigheter lett till en dramatisk ökning av antalet tillgängliga reporter linjer. Eftersom tillgängligheten av transgena verktyg och reporter djur fortsätter att växa, så också bör nyttan och tillämpligheten av fluorescence-baserade cell sortering metoder.
Vi visade nyligen att cell sortering från transgena djur rutinmässigt kan tillämpas för att rena primära neuroner som förberedelse för cell kultur7. Genom att sortera celler från antingen råttor eller möss, kunde vi isolera och kultur fluorescerande nerv celler, som uttrycker fluorescerande reporter proteiner specifikt i antingen GABAergic eller glutamatergic nerv celler6,8,9. Genom att studera dessa renade neuronala kulturer, kunde vi identifiera en viktig skillnad i hur GABAergic och glutamatergic nerv celler beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission7. Dessutom, genom co-culturing gliaceller celler med renade nerv celler, kunde vi utvidga på tidigare observationer som visar den kritiska roll som gliaceller celler spelar i tillväxt och överlevnad av nerv celler10,11. Således kunde vi genom en kombination av cell sortering och cell kultur studera inte bara utvecklingen av specifika neuron typer isolerat, utan kunde undersöka påverkan av gliaceller på deras funktion.
Vi presenterar här ett protokoll för rening och kultur av GABAergic och glutamatergic nerv celler från cortex och Hippocampus av transgena möss eller råttor. Vi presenterar också en metod för icke-kontaktsamodling av renade nerv celler och gliaceller, anpassade från Geissler et al.12. För att generera renade GABAergic kulturer, vi har sorterat fluorescerande neuroner från VGAT-Venus-A Wistar råttor8 eller Vgat-Venus möss13, som selektivt uttrycker en förstärkt gult fluorescerande protein variant (Venus) i > 95% av kortikala GABAergic nerv celler. För att generera renade glutamatergic kulturer, vi har sorterat fluorescerande neuroner från NexCre; Ai9 möss6,9, som uttrycker tdtomato i kortikala glutamatergic nerv celler. Hela sorterings-och kultur förfarandet kan utföras inom 3-4 h och kan användas för att generera hundratals replikkulturer som lämpar sig för elektro fysiologiska, morfologiska och cell överlevnad analys. Metoden är enkel, reproducerbar och kan producera renade neuronala kulturer som är större än 97% ren för cell typ av intresse.
Vi beskriver här en metod som kombinerar sortering och odling av primära neuroner för att generera renade neuronala cell kulturer. Denna metod tar cirka 1 h längre än en typisk primär separerad neuronala kultur protokoll ännu tillåter generering av hundratals replikerade kulturer som innehåller specifika neuronala typer. Renade neuroner, som kan odlas isolerat i minst 16 dagar, utvidga axoner och dendriter och kan avfyra repetitiva tåg av åtgärder potentialer (figur 2 och figur 3). Viktigt är att dessa celler är mottagliga för samma experimentella analyser som vanliga primära separerade neuronala kulturer, inklusive elektro fysiologiska, morfologiska och överlevnads analyser. En stor fördel med att arbeta med dessa renade kulturer är att utvecklingen av specifika cell typer kan studeras isolerat. För att stödja utvecklingen av renade kulturer, presenterar vi också ett protokoll för co-culturing renas nerv celler med gliaceller. Som visats tidigare, co-culturing renade nerv celler med gliaceller celler förbättrar deras överlevnad, tillväxt och kan främja nätverk bildning7 (figur 4). Således presenterar vi här en kombination av metoder som bör ytterligare studiet av glia-neuron interaktioner och kan visa sig användbart för att studera utveckling och interaktion mellan andra cell typer av intresse.
Studier på kulturer av renade glutamaterga neuroner har avslöjat grundläggande insikter i hur gliaceller celler utsöndrar faktorer som främjar utvecklingen av neuronala nätverk och synaps formation16,17,18 . I allmänhet, metoder för rening av specifika neuron typer har mer framgångs rikt tillämpats för att studera utvecklingen av glutamaterga nerv celler snarare än GABAergic nerv celler. Detta har lett till en skillnad i vår förståelse av hur dessa två cell typer utvecklas. Med tanke på att GABAergic och glutamatergic nerv celler skiljer sig avsevärt när det gäller deras anatomi, fysiologi och utvecklingsrelaterade ursprung, det är viktigt att vi studerar GABAergic nerv celler i sin egen rätt, för att bättre förstå deras funktion och fysiologi. Med hjälp av protokollet som presenteras här, har vi tidigare identifierat viktiga skillnader i hur GABAergic och glutamatergic nerv celler beror på glia-utsöndras faktorer för upprättandet av synaptisk transmission7. Genom att publicera detta protokoll hoppas vi att andra kan göra ytterligare insikter i de viktiga interaktioner mellan nerv celler och gliaceller.
I detta protokoll, vi beskriver en flödescytometri baserad cell sortering metod, som vi har använt för att rena GABAergic eller glutamatergic nerv celler från olika transgena gnagare linjer. Venus positiva GABAergic nerv celler sorterades från VGAT Venus möss13 eller råttor8 och tdtomato positiva glutamaterga neuroner sorterades från nexcre; Ai9 möss (uppfödda ursprungligen från NexCre9 och Ai9 reporter linjer6, se Turko et al., 20187). På senare år har det blivit betydligt lättare att generera transgena djur på grund av tekniska framsteg. Som sådan, till gången på djur som uttrycker fluorescerande molekyler, i många olika cell typer, har vuxit snabbt. Detta har i sin tur ökat användningen och tillämpligheten av fluorescerande aktive rad cell sortering. Medan alternativa metoder för att isolera celler av intresse för närvarande finns16,19,20, de är något hindras av deras beroende av till gången på lämpliga anti kroppar till naturligt förekommande yta Antigener. Detta begränsar deras mångsidighet jämfört med fluorescens-baserade cell sorterings metoder, som redan kan användas för att sortera celler från de många cellspecifika transgena reporter djur som redan finns tillgängliga. Trots detta, när optimerade, antikroppsbaserade sorterings metoder kan vara snabb och hög framställning, och kan ännu bättre bevara cellanatomi, genom att tillåta rening av celler med sina axoner och dendriter intakt21. Metoder för sortering av anti kroppar bör därför fortfarande beaktas när man fattar beslut om en sorterings strategi. I ändan kommer den cell typ av intresse, den ålder vid vilken celler ska sorteras, till gången på transgena djur eller ytantigen och antalet celler som behövs vara de avgörande faktorerna när man väljer den lämpligaste sorterings strategin.
Även om fluorescensbaserad cell sortering är en enkel och reproducerbar metod för rening av celler, bör försiktighet iakttas under vissa steg i protokollet för att bevara cell kvaliteten. Till exempel, efter varje centrifugeringssteg, är det viktigt att se till att cellpelleten återsuspenderas så snabbt som möjligt och att cellerna framgångs rikt har återhämtat sig. Ibland kan cellpelleten störas när man tar bort supernatanten. Det rekommenderas därför, mellan centrifugeringssteg, att kontrol lera närvaron av celler under Mikroskop för att utesluta någon omfattande cell förlust. Efter cellplätering bör cellerna tillåtas att hålla sig i minst 1 h före utfodring. Om celler matas för tidigt, kan vissa celler bli lossas från täckglasen, vilket minskar kultur tätheten. Efter 1 h i kulturen, är det klokt att bedöma cell hälsa. Om celler inte verkar friska (ett exempel på friska celler visas i figur 2A), eller om det finns betydande celldöd, kan detta vara en indikation på ett problem under dissociation eller sortering förfarande. En annan viktig faktor, när odla någon cell typ, är att ta hand när man hanterar cell odlings mediet. NBA-media innehåller fenol röd, som fungerar som en pH-indikator22. Om mediet blir för gult i färg, då detta tyder på att pH är för surt; om mediet blir för rosa, då detta tyder på att lösningen är för basisk. Lager lösningar öppna under långa perioder, särskilt Media aliciteras i koniska rör, tenderar att bli mer alkaliska över tiden. Det är därför klokt att göra upp färska kompletta NBA-medier varje vecka och komplett Media varannan vecka (mediet buffertar under atmosfäriska förhållanden och bör därför vara mer stabil). Med dessa punkter i beaktande bör det vara möjligt att etablera renade cell kulturer i alla laboratorier med till gång till cell sortering och cell odlings utrustning.
I de flesta av våra experiment producerade vi renade kulturer från ett enda djur. Men vid rening av celler för biokemiska analyser kan det vara nödvändigt att samla ihop flera djur för sortering. Vi har framgångs rikt sorterat upp till 8 embryonala möss (embryonala dag 13 djur) med hjälp av ovanstående protokoll (data visas inte). Men om fler djur skall sorteras, kan det vara nödvändigt att öka volymen av både papain och BSA-lösningar (beskrivs i steg 2.1.1-2.1.4) för att rymma ökningen av vävnads mängden. Dessutom, om fler celler är klädd i kultur, då en mer frekvent utfodring schema kan krävas. Som utgångs punkt, celler kan matas var 7 dagar genom att ta bort 100 μL av konditionerade medier och lägga 200 μL av färska kompletta NBA-media. För att neuron livs kraft, om sortering mer djur, bör man överväga att minimera sorterings tiden så mycket som möjligt. Detta kräver ofta noggrann optimering av nedströms analyser för effektiv användning av renade celler. Vi har rutinmässigt sorterat mus neuroner till priser av 600 händelser/s, upp till 500000-800000 celler per djur (postnatal dag 0-2). Detta var dock utan uttömmande optimering av sorterings hastigheter och villkor. Därför bör ytterligare förbättringar i sorterings hastighet och avkastning vara möjliga.
Renade nerv celler kräver glia-konditionerade medier för sin överlevnad. Detta har visats tidigare av odling av nerv celler och glialceller separat, innan behandling av nerv celler med gliaceller konditionerade Media10. I våra experiment valde vi att stödja renade nerv celler genom odling av gliaceller på semi-permeabla cell kulturer skär, som är placerade inuti cell odlings plattan. Denna metod har framgångs rikt tillämpats för att studera glia-derived extracellulära matrix proteiner och deras interaktion med nerv celler12. Den icke-kontakt, men kontinuerligt stöd som tillhandahålls av denna metod har ett antal fördelar jämfört med den separata cell kulturen. Framför allt, den co-Culture av gliaceller med nerv celler möjliggör kontinuerlig reglering och konditionering av cell odlings medier, som mer liknar in vivo situationen. Dessutom möjliggör kontinuerlig co-Culture av celler för potentiell feedback signalering mellan nerv celler och glia, vilket inte är möjligt i separerade kulturer. I vårt protokoll, om så krävs, kan den kontinuerliga samkulturmetoden enkelt utelämnas och en klassisk behandling av nerv celler med glia-betingade Media kan utföras.
Sammanfattnings vis syftar det protokoll som presenteras här för att ge läsaren en solid grund från vilken de kan etablera sina egna renade cell kulturer experiment. Vi förutspår att till gången på transgena djur och virala konstruktioner kommer att fortsätta att öka under överskådlig framtid. Därför är cell sortering tekniker som bygger på fluorescens sannolikt att bli ännu mer allmänt använda och värdefulla.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka den utmärkta tekniska stöd som tillhandahålls av Jenny Kirsch och Ana Teichmüller vid Flow Cytometri Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin. Vi skulle vilja tacka Jie Song för hans hjälp med överlevnad analys. Vi vill också tacka Rita Loureiro för hennes hjälp att fånga bilder av fluorescerande möss och Christian Ebner för kritisk läsning av protokollet. VGAT-Venus transgena råttor genererades av Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi och Y. Kawaguchi i Institutet för fysiologiska vetenskaper, Okazaki, Japan, med pCS2-Venus från Dr. A. Miyawaki. Detta arbete stöttades av det tyska forskning rådet (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 till DROPP).
Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
Trypsin / EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | – | Used for trituration of cells |
24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | – |
15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | – |
Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | – |
35 mm Petri dish | Corning | 353001 | – |
100 mm Petri dish | Corning | 353003 | – |
30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | – | To cell count dissociated cells |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |