Denne protokollen beskriver en celle sortering basert metode for rensing og kultur av fluorescerende GABAergic eller glutamatergic neurons fra mektig og hippocampus av postnatal mus eller rotter.
Det overordnede målet med denne protokollen er å generere renset neuronal kulturer avledet fra enten GABAergic eller glutamatergic neurons. Renset neurons kan være kultivert i definerte medier for 16 dager in vitro og er mottagelig for noen analyser vanligvis utført på dissosiert kulturer, inkludert elektrofysiologisk, morfologiske og overlevelse analyser. Den store fordelen med disse kulturene er at spesifikke celletyper kan selektivt studert i fravær av komplekse ytre påvirkninger, slik som de som oppstår fra gliacellene celler eller andre Nevron typer. Når du planlegger eksperimenter med renset celler, er det imidlertid viktig å merke seg at nevroner sterkt avhenger av glia medier for deres vekst og overlevelse. I tillegg glutamatergic neurons videre avhenge glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring. Vi beskriver derfor også en metode for dyrking neurons og gliacellene celler i en ikke-kontakt ordning. Ved hjelp av disse metodene, har vi identifisert store forskjeller mellom utviklingen av GABAergic og glutamatergic neuronal nettverk. Således, studere kulturer av renset neurons har stort potensial for å fremme vår forståelse av hvordan nervesystemet utvikler og funksjoner. Videre kan renset kulturer være nyttig for å undersøke direkte handling av farmakologiske midler, vekstfaktorer eller for å utforske konsekvensene av genetiske manipulasjoner på bestemte celletyper. Ettersom mer og mer transgene dyr blir tilgjengelig, merking ekstra spesifikke celletyper av interesse, forventer vi at protokollene som er beskrevet her vil vokse i deres anvendelse og potensial.
Celle sortering er et kraftig verktøy for isolering av levende celler av interesse fra en heterogen blanding av celler. Celler kan sorteres basert på størrelse og form kriterier, samt uttrykk for fluorescerende markører1,2. Ofte brukes fluoroforen antistoffer til å merke forskjellige celletyper ved å målrette mot celle spesifikk overflate antigener3,4. Alternativt, transgene dyr eller viral levering systemer er konstruert for å uttrykke fluorophores under Cell-spesifikke arrangører5,6. Historisk sett var utviklingen av transgene-verktøy og dyr kostbare og tidkrevende. Flere nylig, reduserte kostnader og færre tekniske problemer har ført til en dramatisk økning i antall tilgjengelige reporter linjer. Som tilgjengeligheten av transgene verktøy og reporter dyr fortsetter å vokse, så også bør nytten og anvendelsen av fluorescens-baserte celle sortering metoder.
Vi har nylig demonstrert at celle sortering fra transgene dyr kan rutinemessig brukes til å rense primære neurons i forberedelsene til cellekultur7. Ved å sortere celler fra enten rotter eller mus, var vi i stand til å isolere og kultur fluorescerende neurons, som uttrykker fluorescerende reporter proteiner spesielt i enten GABAergic eller glutamatergic neurons6,8,9. Ved å studere disse renset neuronal kulturer, var vi i stand til å identifisere en viktig forskjell i måten GABAergic og glutamatergic neurons avhenge glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring7. I tillegg, ved co-dyrking gliacellene celler med renset neurons, kunne vi utvide på tidligere observasjoner demonstrere den kritiske rollen som gliacellene celler spille i vekst og overlevelse av neurons10,11. Således, gjennom en kombinasjon av celle sortering og cellekultur, var vi i stand til å studere ikke bare utviklingen av spesifikke Nevron typer isolert sett, men var i stand til å undersøke påvirkning av gliacellene celler på deres funksjon.
Vi presenterer her en protokoll for rensing og kultur av GABAergic og glutamatergic neurons fra cortex og hippocampus av transgene mus eller rotter. Vi presenterer også en metode for ikke-kontakt co-kultur av renset neurons og gliacellene celler, tilpasset fra Geissler et al.12. For å generere renset GABAergic kulturer, har vi sortert fluorescerende neurons fra VGAT-Venus-A Wistar rotter8 eller VGAT-Venus mus13, som selektivt uttrykker en forbedret gul fluorescerende protein variant (Venus) i > 95% av kortikale GABAergic neurons. For å generere renset glutamatergic kulturer, har vi sortert fluorescerende neurons fra NexCre; Ai9 mus6,9, som uttrykker tdTomato i kortikale glutamatergic neurons. Hele sortering og kultur prosedyre kan utføres innen 3-4 h og kan brukes til å generere hundrevis av gjenskape kulturer egnet for elektrofysiologisk, morfologiske og celle overlevelse analyse. Metoden er enkel, reproduserbar og kan produsere renset neuronal kulturer som er større enn 97% ren for cellen type interesse.
Vi beskriver her en metode som kombinerer sortering og dyrking av primære neurons å generere renset neuronal cellekulturer. Denne metoden tar rundt 1 h lenger enn en typisk primær dissosiert neuronal kultur protokoll, men gir mulighet for generering av hundrevis av replikere kulturer som inneholder spesifikke neuronal typer. Renset neurons, som kan dyrkes i isolasjon i minst 16 dager, forlenge axons og dendrites og kan brann repeterende tog av handlingen potensialer (figur 2 og Figur 3). Viktigere er disse cellene mottagelig for de samme eksperimentelle analysene som vanlig primære dissosiert neuronal kulturer, inkludert elektrofysiologisk, morfologiske og overlevelse analyser. En stor fordel med å arbeide med disse renset kulturer er at utviklingen av bestemte celletyper kan bli studert i isolasjon. For å støtte utviklingen av renset kulturer, presenterer vi også en protokoll for co-dyrking renset neurons med gliacellene celler. Som vist tidligere, forbedrer co-dyrking renset neurons med gliacellene celler deres overlevelse, vekst og kan fremme nettverk formasjon7 (Figur 4). Dermed presenterer vi her en kombinasjon av metoder som bør videre studiet av glia-Nevron interaksjoner og kan være nyttig for å studere utvikling og samhandling mellom andre celletyper av interesse.
Studier på kulturer av renset glutamatergic neurons har avdekket grunnleggende innsikt i måten gliacellene celler skiller ut faktorer som fremmer utviklingen av neuronal nettverk og synapse formasjon16,17,18 . Generelt, metoder for rensing spesifikke Nevron typer har blitt mer vellykket brukt til å studere utviklingen av glutamatergic neurons stedet GABAergic neurons. Dette har ført til en forskjell i vår forståelse av hvordan disse to celletyper utvikler seg. Gitt at GABAergic og glutamatergic neurons avvike betydelig i forhold til deres anatomi, fysiologi og utviklingsmessige opprinnelse, er det viktig at vi studerer GABAergic neurons i sin egen rett, for bedre å forstå deres funksjon og fysiologi. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, har vi tidligere identifisert viktige forskjeller i måten GABAergic og glutamatergic neurons avhenge av glia-utskilles faktorer for etablering av Synaptic overføring7. Ved å publisere denne protokollen håper vi at andre kan gjøre ytterligere innsikt i de viktige interaksjoner mellom neurons og gliacellene celler.
I denne protokollen beskriver vi en Flow flowcytometri basert celle sorteringsmetode, som vi har brukt til å rense GABAergic eller glutamatergic neurons fra ulike transgene gnager linjer. Venus positive GABAergic neurons ble sortert fra VGAT Venus mus13 eller rotter8 og TdTomato positive glutamatergic neurons ble sortert fra NexCre; Ai9 mus (avlet opprinnelig fra NexCre9 og Ai9 reporter linjer6, se turko et al., 20187). I de senere årene, på grunn av teknologiske fremskritt, har generering av transgene dyr blitt betydelig enklere. Som sådan, tilgjengeligheten av dyr uttrykker fluorescerende molekyler, i mange forskjellige celletyper, har vokst raskt. Dette har i sin tur økt bruk og anvendelse av fluorescerende aktivert celle sortering. Mens alternative metoder for å isolere celler av interesse i dag finnes16,19,20, de er noe hindret av deres avhengighet av tilgjengeligheten av egnede antistoffer mot naturlig forekommende overflaten Antigener. Dette begrenser deres allsidighet sammenlignet med fluorescens-baserte celle Sorteringsmetoder, som allerede kan brukes til å sortere celler fra de mange celle spesifikke transgene reporter dyrene som allerede er tilgjengelige. Likevel, når optimalisert, antistoff-baserte Sorteringsmetoder kan være rask og høy gir, og kan enda bedre bevare celle anatomi, ved å tillate rensing av celler med sine axons og dendrites intakt21. Antistoff Sorteringsmetoder bør derfor likevel vurderes når de bestemmer seg for en sorterings strategi. Til syvende og sist, cellen type interesse, alder hvor cellene skal sorteres, tilgjengeligheten av transgene dyr eller overflate antigener og antall celler som trengs vil være de avgjørende faktorene når du velger den mest hensiktsmessige sortering strategi.
Selv om fluorescens celle sortering er en enkel og reproduserbar metode for rensing av celler, bør det utvises forsiktighet under visse trinn i protokollen for å bevare celle kvaliteten. For eksempel, etter hvert sentrifugering trinn, er det viktig å sørge for at cellen pellet er re-suspendert så raskt som mulig og at cellene er vellykket gjenopprettet. Noen ganger kan celle pellet bli forstyrret når du fjerner supernatanten. Det er derfor anbefalt, mellom sentrifugering trinn, for å sjekke tilstedeværelsen av celler under mikroskopet for å utelukke eventuelle omfattende celle tap. Etter celle plating, bør cellene få lov til å holde seg i minst 1 time før fôring. Hvis cellene mates for tidlig, kan noen celler bli forskyves fra dekkglass, og dermed redusere kultur tettheten. Etter 1 time i kulturen, er det klokt å vurdere celle helse. Hvis cellene ikke vises sunt (et eksempel på friske celler er vist i figur 2a), eller det er betydelig celle død, så dette kan være en indikasjon på et problem under dissosiasjon eller sortering prosedyre. En ytterligere viktig faktor, når dyrking en hvilken som helst celle type, er å ta forsiktighet når du håndterer cellen kultur Media. NBA Media inneholder fenol rød, som fungerer som en pH-indikator22. Hvis mediene blir for gult i fargen, så indikerer dette at pH er for surt; Hvis mediene blir for rosa, så indikerer dette at løsningen er for alkalisk. Stock løsninger åpne for lange perioder, spesielt Media aliquoted i koniske rør, har en tendens til å bli mer alkalisk over tid. Det anbefales derfor å lage ferske komplette NBA-medier hver uke og komplette medier annenhver uke (medium buffere under atmosfæriske forhold og bør derfor være mer stabile). Tar disse punktene i betraktning bør det være mulig å etablere renset cellekulturer i ethvert laboratorium med tilgang til celle sortering og cellekultur utstyr.
I de fleste av våre eksperimenter produserte vi renset kulturer fra et enkelt dyr. Men når rensende celler for biokjemiske analyser, kan det være nødvendig å samle sammen flere dyr for sortering. Vi har lykkes sortert opp til 8 embryonale mus (embryonale dag 13 dyr) ved hjelp av ovennevnte protokollen (data ikke vist). Imidlertid, hvis flere dyrene er å bli sorterte, den kanskje være på krevd å forhøye det kvantum av begge to Papain og BSA løsninger (beskrevet inne skritt 2.1.1 – 2.1.4) å huse økningen inne tissue beløpet. I tillegg, hvis flere celler er belagt i kultur, deretter en hyppigere fôring tidsplan kan være nødvendig. Som utgangspunkt kan celler mates hver 7. dag ved å fjerne 100 μL av conditioned Media og legge til 200 μL av ferske komplette NBA-medier. For å få til Nevron levedyktighet, hvis sortering flere dyr, tenkte bør gis for å minimere sorterings tiden så mye som mulig. Dette krever ofte forsiktig optimalisering av nedstrøms analyser for effektiv bruk av renset celler. Vi har rutinemessig sortert mus neurons på utbredelsen av 600 hendelser/s, opptil 500000-800000 celler per dyr (postnatal dag 0 – 2). Men dette var uten uttømmende optimalisering av sortering hastigheter og forhold. Derfor bør ytterligere forbedringer i sortering hastighet og yield være mulig.
Renset neurons forlange glia-betinget Media for deres overlevelse. Dette har blitt demonstrert tidligere av dyrking neurons og gliacellene celler separat, før behandling neurons med gliacellene conditioned Media10. I våre eksperimenter, valgte vi å støtte renset neurons av dyrking gliacellene celler på halvgjennomtrengelig cellekultur inserts, som er plassert inne i cellen kultur plate. Denne metoden har blitt brukt for å studere glia-avledet ekstracellulære matrise proteiner og deres interaksjon med neurons12. Den ikke-kontakt, men kontinuerlig støtte fra denne metoden har en rekke fordeler i forhold til den separate kulturen i cellene. Spesielt kan co-kulturen i gliacellene celler med neurons for kontinuerlig regulering og condition av cellen kultur Media, som tettere ligner in vivo situasjonen. I tillegg gir kontinuerlig co-kultur av celler for potensielle feedback signalnettverk mellom neurons og glia, som ikke er mulig i separerte kulturer. I vår protokoll, om nødvendig, den kontinuerlige co-kultur metoden kan enkelt utelates og en klassisk behandling av neurons med glia-conditioned Media kan utføres.
Oppsummert protokollen som presenteres her har som mål å gi leseren et solid fundament som de kan etablere sin egen renset cellekultur eksperimenter. Vi spår at tilgjengeligheten av transgene dyr og virale konstruksjoner vil fortsette å øke i overskuelig fremtid. Derfor, celle sortering teknikker basert på fluorescens er sannsynlig å bli enda mer utbredt og verdifullt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke den utmerkede teknisk støtte fra Jenny Kirsch og Ana Teichmüller ved Flow flowcytometri Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin. Vi vil gjerne takke Jie Song for hans hjelp med overlevelse analyse. Vi vil også gjerne takke Rita Loureiro for hennes hjelp til å fange bilder av fluorescerende mus og Christian Ebner for kritisk lesning av protokollen. VGAT-Venus transgene rotter ble generert av DRS. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i National Institute for fysiologiske Sciences, Okazaki, Japan, ved hjelp av pCS2-Venus levert av Dr. A. Miyawaki. Dette arbeidet ble støttet av det tyske Forskningsrådet (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG eks 257 til IV).
Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
Trypsin / EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | – | Used for trituration of cells |
24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | – |
15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | – |
Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | – |
35 mm Petri dish | Corning | 353001 | – |
100 mm Petri dish | Corning | 353003 | – |
30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | – | To cell count dissociated cells |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |