Her introduserer vi en metode for å bruke en intra-ventrikkel optisk kateter i perfusert hjerter til å utføre absorbansen spektroskopi over hjertet veggen. Dataene innhentet gir robust informasjon om vev oksygen spenning samt substrat utnyttelse og membran potensial samtidig med CARDIAC ytelse tiltak i denne allestedsnærværende forberedelse.
Absorbansen spektroskopi av hjertemuskelen gir ikke-destruktiv vurdering av cytosolic og mitokondrie oksygenering via myoglobin og cytokrom absorbansen hhv. I tillegg kan mange aspekter av mitokondrie metabolske status som membran potensial og substrat oppføring også anslås. For å utføre CARDIAC veggen overføring optiske spektroskopi, en kommersielt tilgjengelig side-avfyring optisk fiber kateter plasseres i venstre ventrikkel av isolerte perfusert hjerte som lyskilde. Lys passerer gjennom hjertet veggen er samlet med en ekstern optisk fiber for å utføre optiske spektroskopi av hjertet i nær sanntid. Overføringen tilnærmingen unngår mange overflate spredning forstyrrelser forekommer i mye brukt refleksjon tilnærminger. Endringer i transmuralt absorbansen Spectra ble deconvolved ved hjelp av et bibliotek med kromoforen referanse Spectra, gi kvantitative tiltak av alle kjente CARDIAC chromophores samtidig. Denne Spectral deconvolution-tilnærmingen eliminert iboende feil som kan oppstå som følge av at vanlige metoder for dobbel bølgelengde brukes på overlappende absorbansen Spectra, i tillegg til en kvantitativ evaluering av den gode tilpasningen. Et egendefinert program ble utviklet for datainnsamling og analyse, som tillot etterforsker å overvåke metabolsk tilstand av preparatet under eksperimentet. Disse relativt enkle tilskuddene til standard hjerte-system gir et unikt innblikk i metabolsk tilstand av hjerte veggen i tillegg til konvensjonelle tiltak av sammentrekning, og substrat/oksygen utvinning.
Optisk absorbansen spektroskopi for overvåking intakt organ biokjemi er en mye brukt tilnærming på grunn av sin egen verdi, ikke-destruktive natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbansen gir et mål på gjennomsnittlig cytosolic oksygen spenning10,11,12. Mitokondrie cytokromer gi informasjon om substrat oppføring på nivå med flavins, membran potensial fra cytokrom bL: bH13, og oksygen levering til mitokondrier i cellen fra cytokrom oksidase (Cox ) Redox stat14. Glancy et al. demonstrert at aktivitetene til hver komplekser kan bestemmes ved å måle mitokondrie membran potensialet og metabolske rate15. Derfor, ved hjelp av optiske spektroskopi, kan et vell av informasjon fås uten behov for eksogene sonder eller store modifikasjoner av dagens studie systemer. Målet med denne utredningen er å presentere en robust metode for å samle overføring optiske Spectra i konvensjonelle perfusert hjerte preparater med den eneste store endringen som utfører studier i et mørkt miljø.
Refleksjon absorpsjon spektroskopi har blitt brukt til å utføre optiske spektroskopi av perfusert hjerte3,6,16,17,18,19 i tillegg som hjertet i vivo1. Refleksjon spektroskopi består av impinging lys på hjerte overflaten og samler lyset spredt gjennom hjertet, så vel som diffus og speilende utheving reflektert lys. Dermed er den innsamlede lys i denne tilnærmingen en sammensatt av flere spredning mekanismer samt vev kromoforen absorbances av interesse. På grunn av bevegelse og komplekse overflaten av hjertet, lys refleksjon av overflaten av hjertet er spesielt problematisk, endre dybden av penetrasjon og mengde rent reflektert lys.
Begrensningene for refleksjon absorpsjon spektroskopi presentert ovenfor ble løst ved å innføre en optisk kateter inn i venstre ventrikkel hulrom, tillater innsamling av overført lys over venstre ventrikkel gratis vegg20. Fordelene ved overføring spektroskopi for denne type studier ble verdsatt i tidlig invasiv studier av Tamura et al.9 den nåværende gjennomføringen gir en svært robust overføring absorpsjon spektroskopi analyse av intakt hjertet med hensyn til cytosolic oksygenering og mitokondrier Redox tilstand under en rekke forhold21. Disse innledende studiene brukt et spesielt fabrikkert kateter med en drevet LED på spissen orientert for å generere en side-avfyring mønster av hvitt lys gjennom myokard. Imidlertid er det relativt store LED tippet kateter bare hensiktsmessig for bruk på middels store hjerter (kanin, marsvin, etc.) og nødvendig tilpasset fabrikasjon. Inne det aktuelle studere, en metoden av benytter en kommersielt anvendelig 200-mikron kjernen side-skyting optisk fiber som lyset guide er forevist. I stedet for en kablet LED på tuppen, omdirigerer kateteret med 500-mikro-spissen lys fra en ekstern kilde som øker allsidigheten til systemet. Denne tilnærmingen tillater bruk av en rekke eksterne lyskilder inkludert lasere for applikasjoner som Raman spredning spektroskopi. Å kvantifisere disse dataene, en online full multikomponent Spectral analyse bruker kjent referanse Spectra å forbedre nøyaktigheten av spektroskopiske bestemmelse av CARDIAC chromophores presenteres som tidligere beskrevet20,22. Kildekoden for denne analysen vil bli gitt av forfatterne på forespørsel. Ved hjelp av denne tilnærmingen, informasjon om CARDIAC biokjemi og mitokondrie funksjon kan fås samtidig med de konvensjonelle CARDIAC funksjonelle parametre med liten eller ingen innvirkning på hjertet forberedelse. Ettersom hjertet er kritisk avhengig av mitokondrie funksjon og oksygen levering, denne tekniske tillegg til den klassiske perfusert hjerte systemet vil i stor grad forbedre tolkningen og nytten av denne viktige modellen av CARDIAC ytelse.
Den isolerte retrograd eller arbeider perfusert hjerte forberedelse er en bærebjelke i studiet av hjerte fysiologi samt prekliniske gransking av teknikker og rusmidler på hjertet. Nøkkelen til bruken har vært enkel forberedelse, robuste funksjonelle egenskaper og kontroll av eksperimentelle parametre samt evne til å måle mange funksjonelle parametre av bankende hjerte. Optisk absorbansen spektroskopi gir innsikt i vev oksygenering samt mitokondrier metabolske aktiviteter. Optisk spektroskopi har hovedsakelig gjennomført i den isolerte perfusert hjerte studier i refleksjon modus som det er vanskelig å tolke på grunn av bevegelse og lysspredning komplikasjoner.
Vi har innført ventrikkel veggen overføring optiske spektroskopi (VWTOS) for å gi en robust metode for overvåking CARDIAC vev metabolske chromophores. I en tidligere publikasjon, viste vi at en LED fastkoblet til spissen av koaksialkabel20 gjør en unik intrakardielle side-avfyring lyskilde som kan brukes til VWTOS perfusert hjerter. Side-avfyring refererer til projeksjon av lys vinkelrett på den lange aksen av kateteret, ideelt for å belyse ventrikkel fri vegg. LED-kateteret var lite nok til å ikke påvirke hjertefunksjon, men krevde spesialisert fabrikasjon i laboratoriet. Den nåværende studien presenterer bruken av en 500 mikron kommersielle side-avfyring kateter som kan kobles til en lyskilde kompatibel med fiberoptikk. Disse side-avfyring optiske katetre ble kommersielt utviklet for laser ablasjon vinkelrett på den lange aksen av fiber. Naturligvis bruker vi lys kraft mye lavere enn det som er nødvendig for photoablation. Mindre fibre er tilgjengelig for bruk på mindre preparater som perfusert mus hjerte27. Dette fiberoptisk system gitt tilstrekkelig belysning gjennom hjertet veggen i bølgelengdeområdet der CARDIAC chromophores absorbere (450-630 NM). Ved hjelp av en pickup fiberoptisk på utsiden av hjertet, kan absorbansen av myoglobin og mitokondrier cytokromer overvåkes med utmerket Temporal og Spectral oppløsning (se figur 5). Den side-avfyring fiberoptisk tilnærming har flere fordeler fremfor LED-kateter for VWTOS, inkludert en mye mindre tverrsnitt profil av kateteret som minimerer virkningen av kateteret på hjertet, mer fleksibel redusere innvirkning på hjerte-ventil og ventrikkel ytelse, ingen elektriske tilkoblinger som kan korte ut i saltvann perfusate, og til slutt et kateter som bruker en ekstern lyskilde som øker fleksibiliteten til lys kildevalg for VWTOS.
På grunn av den sterke absorbansen av hjertet under 490 NM, er det vanskelig å generere mye informasjon om Soret-båndet i cytokromer i regionen 410 – 445 NM eller NADH ved 340 NM. Dermed er den brede absorbansen av FAD på 450 nm den laveste frekvensen absorbansen som er observert, selv om hele absorpsjon toppen av denne chromophores ikke er samplet. Bruke VWTOS signalet til støyforhold er svært høy som hele veggen er samplet i motsetning til overflaten refleksjon spektroskopi, vanligvis brukt20, som bare prøver overflaten av hjertet med mange spredning problemer. VWTOS prøvetaking hele hjerte veggen er mer analog til Nuclear magnetisk resonans spektroskopi (NMRS) tiltak av mange CARDIAC metabolitter som 31P oppdaget adenosin trifosfat og kreatin fosfat28, 13C oppdaget merket metabolitter29,30 inkludert hyperpolarized etiketter31,32og 1H oppdaget metabolitter33. Som VWTOS kan gjennomføres ved hjelp av ikke-magnetiske enheter, er det helt gjennomførbart at NMR og VWTOS kunne gjennomføres samtidig. VWTOS er ikke begrenset til endogene chromophores og kunne brukes til å overvåke absorpsjon fra optiske sonder for pH, ca2 +, og plasma membran potensial.
Vi bruker 2 Hz (dvs. 2 prøver/sek) som gir utmerket enkelt spektrum signal til støy. Selv om høyere samplingsfrekvenser kan oppnås som tillater CARDIAC syklus analyse, tidligere studier har vist at det er ingen beat å slå variasjon i kromoforen absorbansen, så ingen innsats for å selektivt samle lys som en funksjon av CARDIAC syklus var laget34. På grunn av VWTOS geometri er påvisning av lys mindre avhengig av vev bevegelse enn refleksjon metoder, siden de komplekse overflate spredning hendelser er eliminert. Vi finner at alvorlig bevegelse kan forstyrre disse tiltakene, men sanntid Spectral analyse raskt avslører Spectral overganger uforenlig med vev kromoforen overganger. Igjen, dette bare oppstår når hjertet beveger seg grovt bort fra innsamling fiber dramatisk redusere mengden av innsamlet overført lys.
VWTOS data analyseres ved hjelp av full Spectral tilpasning rutine basert på et referanse bibliotek med Spectra CARDIAC chromophores og spekteret av lyskilden som tidligere beskrevet20,22,27, 35 med en enkel lineær minst kvadrater tilnærming. Denne Spectral montering prosedyre kompensert for overlappende absorbansen spektrum og ikke stole på “isobestic” bølgelengder. Denne hele spekteret analysen eliminerer gjenstander forbundet med felles dual Beam (dvs. to bølgelengde) analyse1,3,6 som har vist å være problematisk20. Den ekstra fordelen med full Spectral analyse er generering av en godhet passe fra rester, ikke tilgjengelig i dual Beam protokoller.
I denne studien, fokuserte vi på effekten av cyanid på de optiske egenskapene til hjertet. Som cyanid blokker cytokrom oksidase, hemmer det oksygenforbruk og i hovedsak resulterer i en netto reduksjon av alle cytokromer som elektroner tilbake opp i cytokrom kjeden. Imidlertid er membranen potensialet tilsynelatende høy, som Redox endringer i bL og bH er svært små i forhold til cytokrom c13. Med opphør av oksygenforbruk, oksygen spenninger i vevet bør nærme seg perfusate og vi noterte en tidlig økning i oksygen myoglobin med cyanid i samsvar med forestillingen om at saltvann perfusert hjerte, selv i retrograd moduser, er ikke fullt oksygennivået myoglobin i stoffer19,20,21,36. Sammenligning av maksimal effekt av cyanid på oksygenrikt myoglobin med fullt deoxygenated spektrum innhentet med iskemi avslører en myoglobin oksygenering av bare ca 88%, i samsvar med tidligere studier.
Det er viktig å merke seg i denne studien at cyanid effekter på myoglobin oksygenering og cytokrom reduksjon ble midlertidig løst. Det er overraskende at virkningene av cyanid først ble observert på koronar strømning og myoglobin før store forandringer i hjertets cytokromer Redox tilstand ble observert. Tidlig markert økning i Flow tyder på at en effekt på arteriell glatt muskel24,37 kan oppstå før brutto metabolske virkninger i hjerte cellene er observert. Økningen i flyt, potensielt med en beskjeden cyanid indusert reduksjon i respirasjon, sannsynlige resultater i umiddelbar økning i oksygenert myoglobin forårsaket av økningen i oksygen levering. Med spredningen av cyanid hemming til myocytter, en ytterligere økning i koronar flyt er observert (se regionen merket 3 i figur 5a), sannsynligvis drevet av mange metabolske faktorer38. Den store tidlige virkningen av cyanid på flyt tyder på at metabolismen av vaskulære glatt muskel kan være mer potent i å endre vaskulær tone enn metabolismen av myocytter. Disse dataene støtter den veletablerte forestillingen om at myoglobin har en mye lavere affinitet for oksygen enn COX, selv i intakt hjerte, som myoglobin oksygenering skjedde godt før endringer i mitokondrier Redox tilstand (figur 5). Dette høye nivået av deoxygenated myoglobin under kontroll forhold er i overensstemmelse med tidligere studier som tyder på at det isolerte saltvanns perfusert hjerte kan være delvis hypoxic selv under kontroll forhold9,19, 20,21,27,36, understreker viktigheten av å overvåke CARDIAC vev oksygenering når du bruker denne viktige modellen i hjerte fysiologi.
Vi presenterer her de eksperimentelle detaljene for å gjennomføre overføring absorpsjon spektroskopi på isolerte perfusert hjertet. Vi har med hell tilpasset denne teknikken for bruk på hjertene fra kaninen til musa ved hjelp av en tynn side-avfyring intrakardielle optisk fiber. Utnytte State of the art full Spectral montering rutiner, kan den komplekse optiske samspillet av CARDIAC chromophores enkelt trekkes ut gir, en nær sanntids mål på kritiske elementer av hjerteinfarkt metabolisme samtidig med konvensjonelle funksjonelle tiltak.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble fullstendig støttet av NHLBI intramural program (Project # ZIA HL00460131).
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |