Summary
Здесь мы вводим метод использования внутрижелудочкового оптического катетера в потупоротивом сердце для выполнения спектроскопии абсорбции через стенку сердца. Полученные данные обеспечивают надежную информацию о напряжении кислорода тканей, а также о использовании субстрата и мембранном потенциале одновременно с показателями сердечной деятельности в этой вездесущей подготовке.
Abstract
Абсорбционная спектроскопия сердечной мышцы обеспечивает неразрушительную оценку цитосолиальной и митохондриальной оксигенации с помощью миоглобина и цитохромной абсорбции соответственно. Кроме того, можно оценить многочисленные аспекты митохондриального метаболического статуса, такие как мембранный потенциал и вход подроттрата. Для выполнения оптической спектроскопии передачи сердечной стены, коммерчески доступные боковой стрельбы оптического волокна катетер помещается в левый желудочек изолированного проникнутого сердца в качестве источника света. Свет, проходящий через стенку сердца, собирается с помощью внешнего оптического волокна для выполнения оптической спектроскопии сердца практически в режиме реального времени. Подход к передаче позволяет избежать многочисленных помех рассеяния поверхностей, возникающих при широко используемых подходах к отражению. Изменения в спектре трансмурфальной абсорбции были deconvolved с помощью библиотеки хромофора справочных спектров, обеспечивая количественные показатели всех известных сердечных хромофор одновременно. Этот спектральный подход к деконволюции устраняет внутренние ошибки, которые могут возникнуть в результате использования общих методов двойной длины волны, применяемых к перекрывающимся спектрам абсорбции, а также обеспечивает количественную оценку доброты подгонки. Для сбора и анализа данных была разработана пользовательская программа, которая позволила следователю следить за метаболическим состоянием препарата во время эксперимента. Эти относительно простые дополнения к стандартной системе перфузии сердца обеспечивают уникальное понимание метаболического состояния стенки сердца в дополнение к обычным мерам сокращения, перфузии и субстрата/ кислородной экстракции.
Introduction
Оптическая абсорбционная спектроскопия для мониторинга нетронутой биохимии органов являетсяшироко используемым подходом из-за его внутренней, неразрушающей природы 1,2,3,4, 6,7,8,9. Абсорбция миоглобина обеспечивает измерение среднего цитосолильного кислородного напряжения10,11,12. Митохондриальные цитохромы предоставляют информацию о вводе субстрата на уровне флавинов, мембранного потенциала от цитохрома bL:bH13,а также доставки кислорода в митохондрии в клетку из цитохрома оксидазы (COX ) состояние редокса14. Glancy et al. продемонстрировали, что деятельность каждого комплекса может быть определена путем измерения потенциала митохондриальной мембраны и скорости обменавеществ 15. Таким образом, с помощью оптической спектроскопии, огромное количество информации может быть получено без необходимости экзогенных зондов или крупных модификаций существующих систем исследования. Целью данной работы является представление надежного метода сбора оптических спектров передачи в обычных проникнутых сердечных препаратов с единственной крупной модификацией, выполняющей исследования в затемненной среде.
Спектроскопия поглощения отражения успешно используется для выполнения оптической спектроскопии пронзаемного сердца3,6,16,17,18,19 как сердце in vivo1. Спектроскопия отражения состоит из посягающего света на поверхность сердца и сбора света, рассеянного через сердце, а также рассеянного и зеркального отраженного света. Таким образом, собранный свет в этом подходе представляет собой состав нескольких механизмов рассеяния, а также ткани хромофора абсорбции интерес. Из-за движения и сложной поверхности сердца, отражение света от поверхности сердца особенно проблематично, изменяя глубину проникновения и количество чисто отраженного света.
Ограничения отражения поглощения спектроскопии, представленные выше, были решены путем введения оптического катетера в полость левого желудочка, что позволяет сбор передаваемого света через левый желудочек свободной стены20. Преимущества спектроскопии передачи для этого типа исследования были оценены в ранних инвазивных исследованиях Tamura et al.9 Текущая реализация обеспечивает очень надежный анализ спектроскопии передачи нетронутого сердца с относится к цитосоликической оксигенации и митохондрии редокс состояние при различных условиях21. Эти первоначальные исследования использовали специально изготовленный катетер с питанием светодиод на кончике ориентированных на создание боковой стрельбы картины белого света через миокард. Тем не менее, относительно большой светодиодный катетер наконечником подходит только для использования на сердцах среднего размера (кролик, морская свинка и т.д.) и требуется пользовательских изготовления. В текущем исследовании представлен метод использования коммерчески доступного 200-микроня бокового обжигаемого оптического волокна в качестве светового направляющего. Вместо проводного светодиода на кончике катетер с наконечником 500 микроперенаправляет свет от внешнего источника, увеличивая универсальность системы. Такой подход позволяет использовать широкий спектр внешних источников света, включая лазеры для таких приложений, как Раман рассеяния спектроскопии. Для количественной оценки этих данных, онлайн полный многокомпонентный спектральный анализ с использованием известных спектральных спектров для повышения точности спектроскопического определения сердечных хромофор представлен как ранее описано20,22. Исходный код для этого анализа будет предоставлен авторами по запросу. Используя этот подход, информация о сердечной биохимии и митохондриальной функции может быть получена одновременно с обычными сердечными функциональными параметрами практически без влияния на сердечную подготовку. Поскольку сердце критически зависит от митохондриальной функции и доставки кислорода, это техническое дополнение к классической проникнутой сердечной системы значительно улучшит интерпретацию и полезность этой важной модели сердечной деятельности.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Национальным комитетом по уходу за животными, легкими и институтам крови и выполнены в соответствии с руководящими принципами, описанными в Законе об уходе за животными и благополучии (7 USC 2142 No 13).
1. Изолированная перфудированная сердечная система и перфусат
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта подготовка очень похожа на предыдущие публикации23.
- Сделать 4 литра модифицированного Перфузата Krebs-Henseleit, состоящего из (в ммоле/л) 137,0 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl2, 0.5 MgCl2, 1.0 Na2HPO4, 10.0 глюкозы, 1.0 лактата, и 10.0 HEPES.
- рН perfusate до 7.4 на 37 c с NaOH и HCl.
- Фильтр perfusate через мембрану 1 мкм поры.
- Промыть все трубки и камеры пронзительной сердечной системы, запустив и слив очищенной воды через систему.
- Перенесите перфусат в бак и оксигенируйте 100% O2 с пузырем, сохраняя при этом температуру при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью нагретой циркулирующей водяной ванны.
- Добавьте 2 из 12 мембранных фильтров и премьер системы с перфузатом во время рециркуляции в режиме Langendorff.
- Прикрепите зажим трубки на трубе прямо над аортной канюлей и отрегулируйте винт так, чтобы аортаточный поток опускался примерно до 10 мл/мин.
2. Кролик сердце иссечение и перфузия
- Иссечение сердца
- Анестезия мужчин Новой Зеландии белых кроликов (около 3 кг) с помощью 1,5 мл внутримышечной инъекции смеси кетамина / ацепромазина (10:1).
- Приблизительно через 10-15 минут вводят 3% изофларан через ингаляцию для полного анестезируемического эффекта.
- Подтвердите надлежащую глубину анестезии, щипая ног, а затем поместите линию в маргинальную ухо вене для введения последующих препаратов.
- Впрысните 1500 единиц (или 1,5 мл из 1000 единиц/мл) гепарина и дайте циркулировать в течение 3 минут.
- Двойная проверка надлежащей глубины анестезии, а затем эвтаназии с 6 mEq (или 3 мл 2 мЭк / мл) KCl.
- Быстро откройте грудную клетку, найдите вершину сердца и аорту. Удалите сердце, разрезая аорту как можно дальше от сердца и разрезая легочные вены как можно ближе к легким.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление легких на этой ранней стадии отличается от предыдущей публикации23, но не влияет на подготовку. - Поместите сердце в небольшой стакан перфузата (так же perfusate как шаг 1.3), сидя в ведро со льдом для транспортировки от операции до перфузии.
- Сердечная каниляция
- Cannulate и связать аорту надежно, убедившись, что не включать любые пузырьки в аорты линии.
- Инициировать поток при 70 мм рт. ст. давление перфузии, удалив трубки зажим на аортальной линии и поддерживать это давление в течение оставшейся части операции и сосуда канистру.
- Отделите легочную артерию от аорты и других сосудов и свяжете полы вены и легочные вены. Удалите жир и соединительную ткань по-прежнему присутствует.
- Каннуляция легочной артерии, чтобы обеспечить меру скорости потока коронарной пазухи и кислородного напряжения.
- Откажитесь от первоначального потока из сердца (около 10 минут) во время подготовки к ликвидации крови и хирургического мусора. После этого периода, рециркулировать perfusate.
3. Боковое сжигание волокна оптическое размещение
- Подключите волоконно-оптический катетер к высокой мощности волоконно-связанных светодиодных белый источник света, чтобы помочь визуализации, а также обеспечить свет для спектроскопии один раз в сердце.
- Вырежьте небольшой придаток левого предсердия, вставьте катетер в левый желудочек через митральный клапан, затем поверните его для достижения освещенной левой стенки желудочка.
- Расположите пикап волоконно-оптической прямо напротив области максимального освещения левого желудочка примерно на 1 см от сердца.
- Соедините другой конец волокна пикапа к быстрому спектрометру сканирования.
4. Оптическая спектроскопия
- Выключите свет в экспериментальной области, чтобы получить полную темноту.
- Запустите пользовательскую программу, включающую драйверы спектрометра для выполнения сбора данных и анализа передаваемого света в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исполняемая версия консолидированной версии программы спектрального приобретения и анализа предоставляется в качестве дополнительного файла кодирования. Исходный код доступен по запросу авторов. - Перейдите через все подсказки, выбирая варианты для проникнутого режима приобретения спектроскопии сердца. На следующей странице укажите, происходит ли вспомогательный сбор данных. Наконец, введите параметры приобретения, включая расположение как хромофорных эталонных спектров, так и данных, которые необходимо сохранить.
- Введите пропускную способность 490-630 нм.
- Введите частоту выборки 2 Гц (т.е. 2 образца/сек).
- Соберите темный ток, или нулевой свет, спектр, чтобы исправить для уровня фонового сигнала, выключив источник света.
- Нажмите, чтобы выбрать хромофор ссылки хотели бы быть использованы в установке рутины.
- На странице Acquire Data отрегулируйте положение катетера и волокна пикапа, чтобы максимизировать передаваемый свет, отображаемый на программном обеспечении, с особым вниманием к амплитуде сигнала в области 500 нм, где кислородом миоглобин абсорбции должны соблюдаться.
- Убедитесь, что передаваемый свет не насыщает детектор в области 600 нм.
- Убедитесь, что никакие внешние источники света не способствуют собранному спектру, выключив освещение катетера и подтвердив, что свет не обнаружен.
- Инициировать сбор данных, нажав на кнопку Сохранить Спектру.
- Нажмите на Set as Control, чтобы просмотреть спектр абсорбции различий от будущих спектров к текущему спектру "контроль".
- Выполняйте любые физиологические возмущения по желанию.
- Протокол 1: Влияние цианида на сердечную производительность и поглощение хромофора
- Прекратите рециркуляцию жидкости из перфузии сердца.
- Используя шприц насос, вводят цианид (2,5 до 75 мм при рН 7) с разной скоростью в перфусат непосредственно перед аортной канюлей для достижения желаемой концентрации цианида (0,025 до 1 мм, рассчитанного из частоты аорты) в потоке в сердце в то время как мониторинг сердечной функции и оптических свойств.
- Остановить цианид шприц насос, когда воздействие на коронарный поток и частоту сердечных потоков вместе с оптической передачи через стенку сердца находятся в стабильном состоянии.
- Протокол 2: Ишемия/Гипоксия
- Остановить настой цианида.
- Через 5 минут переключите кипящий газ со 100% кислорода на 100% азот, чтобы удалить кислород из системы.
- Примерно через 10 минут остановите поток, чтобы имитировать полное ишемическое/гипоксическое состояние.
- Протокол 1: Влияние цианида на сердечную производительность и поглощение хромофора
5. Спектральный анализ данных
- Запустите программу в режиме анализа сердца.
- Выберите подходящий спектрометр.
- Введите траекторию файла данных и справочный спектри файл а также выберите источник света катетера, который загружает предварительно сохраненный спектр источника света катетера.
- Выберите Данные чтения бин.
- Выберите Set Min и Max Wavelength.
- Введите пропускную способность для анализа данных как 490-630 нм.
- Выберите Возвращение вглавное меню .
- Выберите Ссылки на чтение.
- Подтвердите эталонные спектры для использования в анализе.
- Выберите Возвращение вглавное меню .
- Выберите очки времени в основном меню.
- Выберите точку времени T0 в качестве элемента управления и установите диапазон до 100 точек.
- Выберите точку времени T1 в качестве экспериментального периода в диапазоне 100 пунктов.
- Обратите внимание на частоту необработанной разницы во вкладке Averaged Abs. Spectrum.
- Выберите коэффициенты расчета фит, а затем нажмите на вкладку Fit Coefficients, чтобы наметить временной ход референтных спектров.
- Вернитесь в главное меню и выберите Вычислить разница Abs.
- Выберите T0 и NoT1 на всех позициях. Наблюдайте за установленным спектром в окне «Спектр аттерумала» и примеряйте элементы в окне эталонного веса.
- Повторите эту процедуру, чтобы сравнить другие временные точки в эксперименте.
- Возвращение в главное меню.
- Сохраняйте данные и анализ в отчете электронной таблицы, введя желаемое имя и выбрав Сохранить данные для дальнейшего анализа с другими программами.
ПРИМЕЧАНИЕ: если имя не набрано, отчет сохраняется с тем же именем, что и файл ввода. Отчет сохраняется в папке под названием Excel AnalysisFiles, расположенной в той же папке, что и исходный файл ввода.
Representative Results
Система используемая с полки малое животное система сердца perfusion но тяжело была доработана для пользы с сердцем кролика. Изменения были главным образом увеличить размер bore всех тюбингов для того чтобы обеспечить адекватную поставку потока к сердцу кролика. Большое изыскание было сделано, чтобы заверить, при перфузионных давлениях, используемых, скорость потока родной перфузионной системы превысила поток с сердцем прилагается по крайней мере в 5 раз. 2-12 мкм пормеммон-фильтры были помещены параллельно между жидкости насоса и аортальной предзагрузки пузырь ловушки камеры для удаления любого мусора из сердца.
Передаваемый свет от кролика сердца
Рисунок 1 представляет спектр катетера(рисунок 1А) и сырой спектр передаваемого света от стены сердца кролика (рисунок1B). Эти данные показывают очень большое затусание света в синей области спектра, однако полосы абсорбции из миоглобина и митохондриальных цитохромов можно непосредственно наблюдать между 490 и 580 нм в вставке. Важно в этих исследованиях, чтобы обеспечить достаточно передаваемых света обнаруживается в регионе от 490 до 630 нм для получения информации о метаболически реагировать сердечных хромофоров. Позиционирование внешних и внутренних волокон корректируется до сохранения данных, чтобы максимизировать интенсивность света, но не насытить детектор в области 625 нм.
Справка Сниженная минус Окисленная спектра справочных хромофор в сердце.
На рисунке 2 представлены эталонные спектры, используемые в соответствии с спектрами различий, собранными в этих исследованиях. Эти ссылки включают миоглобин, цитохром аа3 (альтернативно цитохром605 и цитохром607, в зависимости от типа возмущения22), цитохром580, цитохром bL, цитохром bH , цитохром c, цитохром c1, FAD, абсорбциа представление инцидента света (обозначается I0, который используется для учета просеянного света, то есть фотоны, которые прошли через ткани, не поглощается), и линия (с различной наклон и перехват для учета рассеяния, не показано на рисунке 2). Некоторые спектры шумные, так как концентрация чистого справочного материала была очень низкой22.
Время, в течение чем референс-спектра подходит во время общего эксперимента
Рисунок 3 представляет собой временной курс типичного эксперимента, рассчитанного в шаге 5.15 протокола. Это состоит из фазы контроля, а затем фазы инъекции цианида, а затем цианид вымывания, а затем фазы дезоксигенации, и, наконец, ишемия. Изменения в отдельных хромофорах (миоглобин, цитохром аа3и цитохром с) с течением времени накладываются с течением времени вместе с коронарным потоком. Изменение оптической плотности каждого хромофора оценивается путем умножения коэффициента соответствия, полученного из режима линейных наименьших квадратов и репрезентативного пика хромофора (или максимального абсорбции указанного хромофора). Например, для миоглобина коэффициент соответствия ссылки миоглобина умножается на значение референтного спектра миоглобина на уровне 580 Нм. Обратите внимание на быструю оксигенацию миоглобина к добавлению цианида сопровождается увеличением потока, но до значительного сокращения цитохромов. Этот эффект частично восстанавливается при вымывании цианида. Наконец, при ишемии получают сяроприенное полное уменьшение цитохромов и дезоксигенации миоглобина. Эти данные свидетельствуют о том, что динамические данные, касающиеся метаболического состояния сердца, могут быть легко получены с помощью этой методологии. Положение спектров, используемых для спектра разницы, отмечено на этом временном курсе как: C базовый уровень, инъекция цианида CN, CNW цианид нойш, H N2 Hypoxia (азот, пузыриваемый в перфузате вместо кислорода), и HI No ишемия потока (нет перфузат течет через сердце).
Различие Спектр цианида Лечение по сравнению с контролем и Fit цианида Разница спектра от Кролик а.
Для получения спектра различий вычитаются две абсолютные спектры. Каждый абсолютный спектр получается путем принятия в среднем много (обычно 100) спектров для оптимизации сигнала к шуму соотношение. Рисунок 4 A представляет собой различие спектра управления (C) и цианида (CN) лечение сердца. Используя эталонные спектры, изложенные на рисунке 2,вычисляется спектр подгонки. Остаточный спектр является вычитание припадка из необработанных данных. Та же схема используется для всех последующих спектральных презентаций. Рисунок 4 B представляет спектра амплитуды эталонных спектров (показано на рисунке 2) используется для приведения рисунок 4A. Сильное увеличение абсорбции большинства цитохромов наблюдается, как поток электронов вниз цитохромной цепи был заблокирован цианидом в устойчивом состоянии. Кроме того, поглощение кислородом миоглобина увеличилось, так как потребление кислорода было ликвидировано цианидом. Рисунок 4 C представляет разницу спектров и соответствия спектра различия от CNW и CN, выявление частичного разворота эффекта цианида. Это было достигнуто путем выбора временных точек в протоколе шаг 5.18, перемещение T0 к CNW и T1 в CN регионе времени курса. Рисунок 4 D представляет собой различие спектра HI и C, который представляет собой полностью дезоксигенированных и снижение состояния цитозоля и митохондрий по сравнению с условием контроля. Опять же, это было выполнено на этапе протокола 5.18, перемещая T0 на C и T1 в HI.
Первоначальный временной курс воздействия цианида на коронарный поток и хромофоры
Рисунок 5 А показывает пример начала цианида эффект на ткани. Подходит для миоглобина, цитохрома605 и цитохрома C вместе с коронарным потоком представлены для одного сердца. Эти временные курсы были созданы на этапе протокола 5.15 для эксперимента с цианидом. Индивидуальная разница по сравнению с исходной линией (позиция 1) показана на рисунке 5B. Спектры были сгенерированы из соответствующего номера позиции (1-4) на временном курсе. Это было достигнуто на этапе протокола 5.18, где T0 всегда был в положении 1, а затем различные спектры (2-4) были созданы путем перемещения T1 на позицию 2, 3 и 4 соответственно. Несколько удивительным было наблюдение, что поток и оксигенация миоглобина увеличилось до значительных изменений в цитохромном состоянии redox. Начало изменений в потоке и поглощении хромофора оценивалось линейной экстраполяцией начальной скорости изменения от базовой линии. Используя этот подход, и устанавливая изменение коронарного потока как нулевое время, увеличение оксигенации миоглобина инициировало 1,71 мин. 0,76 мин. и 4,34 мин. и 0,77 мин, соответственно (п. 8). Эти данные свидетельствуют о том, что цианид расслабляет сосудистый тонус24 до серьезных изменений в состоянии обмена веществ сердечной мышцы. Этот эффект, вероятно, вызвано цианидом, встречающимся с сосудистой гладкой мышцей до достижения эффективной дозы вокруг сердечных миоцитов.
Оценки оксигенации миоглобина в контрольных сердцах
Используя данные о цианисте в качестве оценки общей оксигенации миоглобина и данные ишемии для полностью дезоксигенированного миоглобина, мы оцениваем, что при контрольных условиях миоглобин был только 88,2% и 1,0% (n no 10) насыщен кислородом, в соответствии с предыдущими исследованиями20 , 21 год , 25.
Рисунок 1 : Спектры бокового обжига оптического катетера. (A) Это спектр излучаемого света от удаленного источника света через катетер, обнаруженный с помощью волокна пикапа примерно на 1 см от катетера. В этой геометрии сердце отсутствует, а интенсивность источника света настроена так, чтобы детектор не насыщался. (B) Боковой катетер вставляется в левый желудочек и передается свет от сердца собирается и показывается. Вставка показывает 400 до 580 нм область расширена, выявление сложной передачи света из этого региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Справочные спектры сердечных хромофоров, используемых для спектральной установки. Спектры были собраны с помощью различных методов22 и имеют пониженные - окисленные (для цитохромов) и дезоксигенные - оксигенированные (для миоглобина). Для I0, спектр на рисунке 1А просто преобразуется в абсорбционный термин, чтобы сделать ссылку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Поток и оптические изменения с течением времени. Изменение оптической плотности (ЗОД) каждого хромофора является просто установленным отдельным спектром хромофора при максимальном абсорбции. Максимальные частоты абсорбции были, как ранее описано20,26. Представленный курс времени для одного эксперимента, показывая базовый, а затем инъекции цианида (0,10 мМ при максимальном потоке перфузата), вымывание цианида, гипоксия азота осуществляется путем замены кислорода азотом, а затем полной ишемии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Приспособленные спектры различий различных состояний. (A) Спектр инъекции цианида минус базовый уклад. Спектр приспособления полученный от наименьшей квадратной рутины также построен. Остаточный спектр – это разница между сырыми и подходящими спектрами. (B) Справочные спектры, используемые для создания пригонки, представленной на рисунке 4A. Программа масштабирует ссылки на рисунке 2 на их относительный вклад в текущем спектре различий. (C) То же самое, как в , но показывая разницу спектра вымывания против инъекции цианида. (D) То же самое, что и в A, но показывая разницу спектри ишемии по сравнению с базовым уровнем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Высокое височное разрешение инфузионного эффекта цианида на отдельные цитохромы, миоглобин и сердечный поток. (A) Время течение сердечного потока, дезоксимиоглобин, снижение цитохрома605, и снижение цитохрома c. Числа относятся к положению спектра, принятых по отношению к исходной линии на рисунке 5B. (B) Спектры различий для 4 позиций, обозначенных на рисунке 5А против управления (позиция 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Изолированный ретроградный или рабочий проникнутый сердечный препарат является основой в изучении сердечной физиологии, а также доклиническое исследование методов и препаратов на сердце. Ключом к его использованию стала простота подготовки, надежные функциональные характеристики и контроль экспериментальных параметров, а также способность измерять многие функциональные параметры бьющегося сердца. Оптическая абсорбция спектроскопии обеспечивает понимание оксигенации тканей, а также митохондрий метаболической деятельности. Оптическая спектроскопия в основном проводится в изолированных проникнуты исследования сердца в режиме отражения, что трудно интерпретировать из-за движения и свет рассеяния осложнений.
Мы внедрили оптическую спектроскопию на стенки желудочка (VWTOS), чтобы обеспечить надежный метод мониторинга сердечной ткани метаболических хромофоров. В предыдущей публикации, мы продемонстрировали, что светодиодные проводной к кончику коаксиального кабеля20 делает уникальный внутрисердечный боковой стрельбы источник света, который может быть использован для VWTOS проникнуты сердца. Боковая стрельба относится к проекции света перпендикулярно длинной оси катетера, идеально подходит для освещения стенки желудочка. Светодиодный катетер был достаточно мал, чтобы не влиять на сердечную функцию, но требовал специализированного изготовления в лаборатории. Текущее исследование представляет собой использование 500 микрон коммерческих боковой стрельбы катетер, который может быть связан с любым источником света совместимы с волоконной оптикой. Эти боковые оптические катетеры были коммерчески разработаны для лазерной абляции перпендикулярно длинной оси волокна. Естественно, мы используем световую энергию гораздо ниже, чем требуется для фотоаблирования. Меньшие волокна доступны для использования на небольших препаратов, таких как пронзительный сердце мыши27. Эта волоконно-оптическая система обеспечивает адекватное освещение через стенку сердца в диапазоне длин волн, где сердце хромофоры поглощают (450-630 нм). Использование пикап волокна оптики на внешней стороне сердца, поглощение миоглобина и митохондрий цитохромы могут контролироваться с отличным височным и спектральным разрешением (см. Рисунок 5). Боковой огнем волоконно-оптический подход имеет несколько преимуществ по сравнению с светодиодным катетером для VWTOS, в том числе гораздо меньше поперечного сечения профиля катетера, что сводит к минимуму воздействие катетера на сердце, более гибкое снижение воздействия на сердечный клапан и производительность желудочка, нет электрических соединений, которые могут короткие в солей perfusate, и, наконец, катетер, который использует внешний источник света, что увеличивает гибкость выбора источника света для VWTOS.
Из-за сильного поглощения сердца ниже 490 нм, трудно генерировать много информации о soret полосе цитохромов в области 410-445 нм или NADH на 340 нм. Таким образом, широкое поглощение FAD на 450 нм является самой низкой частотой абсорбции, которая наблюдается, хотя весь пик поглощения этого хромофора не пробы. Использование VWTOS соотношение сигнала к шуму очень высока, как вся стена пробы в отличие от спектроскопии отражения поверхности, обычно используется20, который только образцы поверхности сердца с многочисленными проблемами рассеяния. VWTOS выборки всей стенки сердца является более аналогом ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (NMRS) меры многих сердечных метаболитов, таких как 31P обнаруженный аденозин трифосфат и креатин фосфат28, 13C обнаружены помечены метаболитов29,30 в том числе гиперполяризованных этикетки31,32,и 1H обнаруженных метаболитов33. Поскольку VWTOS может проводиться с использованием немагнитных устройств, вполне возможно, что НМР и VWTOS могут проводиться одновременно. VWTOS не ограничивается эндогенными хромофорами и может быть использован для мониторинга поглощения оптических зондов для рН, Ca2", и плазменной мембраны потенциал.
Мы используем 2 Гц (т.е. 2 образца/сек), который обеспечивает отличный сигнал одного спектра к шуму. Хотя более высокие показатели выборки могут быть достигнуты, что позволяют анализ сердечного цикла, предыдущие исследования показали, что нет бить изменения в абсорбции хромофора, так что никаких усилий, чтобы выборочно собирать свет, как функция сердечного цикла было сделал34. Из-за геометрии VWTOS, обнаружение света менее зависит от движения ткани, чем методы отражения, так как сложные события рассеяния поверхности устраняются. Мы находим, что тяжелое движение может нарушить эти меры, но спектральный анализ в реальном времени быстро выявляет спектральные переходы, несовместимые с переходами хромофора тканей. Опять же, это происходит только тогда, когда сердце движется грубо от сбора волокна резко уменьшая количество собранного передаваемого света.
Данные VWTOS анализируются с использованием полной спектральной установки на основе справочной библиотеки спектров сердечных хромофоров и спектра источника света, как ранее описано20,22,27, 35 с простым линейным подходом наименьших квадратов. Эта процедура спектральной установки компенсировала перекрывающийся спектр абсорбции и не полагается на "изобестические" длины волн. Этот полный анализ спектра устраняет артефакты, связанные собщим двойным лучом (т.е. двухдиапазонным) анализом 1,3,6, который, как было показано, является проблематичным20. Дополнительным преимуществом полного спектрального анализа является генерация добра подгонки из остатков, недоступных в протоколах двойного луча.
В этом исследовании мы сосредоточились на влиянии цианида на оптические свойства сердца. Поскольку цианид блокирует цитохромоксидазы, он подавляет потребление кислорода и по существу приводит к чистому сокращению всех цитохромов, как электроны резервного копирования в цепочке цитохром. Тем не менее, мембранный потенциал, по-видимому, остается высоким, так как изменения редокса в bL и bH очень малы по сравнению с цитохромомc 13. С прекращением потребления кислорода, кислородное напряжение в ткани должны приближаться к перфузату, и мы отметили раннее увеличение кислорода миоглобина с цианидом в соответствии с понятием, что солин проникнуты сердца, даже в ретроградной перфузии режимы, не полностью оксигенации миоглобина в цитозол19,20,21,36. Сравнение максимального воздействия цианида на насыщенный кислородом миоглобин с полностью дезоксигенированным спектром, полученным при ишемии, показывает оксигенацию миоглобина всего около 88%, что соответствует предыдущим исследованиям.
Важно отметить, в этом исследовании, что цианид воздействия на оксигенацию миоглобина и цитохром сокращения были временно решены. Удивительно, что эффекты цианида впервые наблюдались на коронарном потоке и миоглобине до того, как наблюдались значительные изменения в состоянии цитохрома редокса сердца. Раннее заметное увеличение потока свидетельствует о том, что влияние на артериальные гладкие мышцы24,37 может произойти до валового метаболического воздействия в клетках сердца наблюдается. Увеличение потока, потенциально при скромном цианид индуцированном снижении дыхания, вероятно, приводит к немедленному увеличению оксигенированного миоглобина, вызванного увеличением доставки кислорода. С распространением ингибирования цианида к миоцитам наблюдается дальнейшее увеличение коронарного потока (см. регион, отмеченный 3 на рисунке 5а),вероятно, обусловлен многочисленными метаболическими факторами38. Большое раннее воздействие цианида на поток свидетельствует о том, что метаболизм сосудистой гладкой мышцы может быть более мощным в изменении сосудистого тонуса, чем метаболизм миоцитов. Эти данные поддерживают устоявую идею о том, что миоглобин имеет гораздо более низкое сродство к кислороду, чем COX, даже в нетронутом сердце, как оксигенация миоглобина произошло задолго до изменения в состоянии редокс митохондрии(Рисунок 5). Этот высокий уровень дезоксигенированного миоглобина в условиях контроля согласуется с предыдущими исследованиями, предполагающими, что изолированный солен овое сердце может быть частично гипоксическим даже при контрольных условиях9,19, 20,21,27,36, подчеркивая важность мониторинга оксигенации сердечной ткани при использовании этой важной модели в сердечной физиологии.
Мы представляем здесь экспериментальные детали для проведения спектроскопии поглощения передачи на изолированном проникнутом сердце. Мы успешно адаптировали эту технику для использования на сердцах от кролика до мыши с помощью тонкого бокового обжига внутрисердечного оптического волокна. Используя состояние искусства полной спектральной установки процедур, сложное оптическое взаимодействие сердечных хромофоров могут быть легко извлечены обеспечивая, почти в режиме реального времени мера критических элементов метаболизма миокарда одновременно с обычными функциональных мер.
Disclosures
Конфликта интересов не было заявлено.
Acknowledgments
Эта работа была полностью поддержана интрамуральной программой NHLBI (Проект ЗЗА HL00460131).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
| BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
| BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
| Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
| Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
| Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
| Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
| Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
| High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
| Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
| Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
| Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
| PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
| Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
| Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
| Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
| Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
| Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
| Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
| Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |
References
- Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 2 Pt 2 683-697 (1999).
- Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
- Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
- Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
- Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 6 Pt 2 2561-2568 (1995).
- Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
- Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
- Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
- Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, Pt 14 2180-2189 (2015).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
- Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
- Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
- Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
- Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
- Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
- Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
- Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
- Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).
- Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
- Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 1 Pt 2 160-168 (1995).
- Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
- Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
- Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
- Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
- Paul, R. J. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. , American Physiological Society. 201-252 (1980).
- Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).
