Summary
Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.
Abstract
A espectroscopia da absorvência do músculo cardíaco fornece a avaliação não-destrutiva da oxigenação citosólico e mitochondrial através do mioglobina e da absorvência do citocromo respectivamente. Além disso, inúmeros aspectos do estado metabólico mitocondrial, como potencial de membrana e entrada de substrato, também podem ser estimados. Para executar a espectroscopia óptica da transmissão da parede cardíaca, um cateter de fibra óptica lado-acendimento comercialmente disponível é coloc no ventrículo esquerdo do coração perfundidos isolado como uma fonte luminosa. A luz que passa através da parede do coração é coletada com uma fibra óptica externa para executar a espectroscopia ótica do coração em tempo real próximo. A aproximação da transmissão evita a interferência de espalhamento de superfície numeroso que ocorre em aproximações amplamente utilizadas da reflexão. As mudanças nos espectros transmurais da absorvência foram desvolvido usando uma biblioteca de espectros de referência do cromóforo, fornecendo medidas quantitativas de todos os cromóforos cardíacos conhecidos simultaneamente. Esta abordagem de desvolução espectral eliminou os erros intrínsecos que podem resultar do uso de métodos comuns de comprimento de onda duplos aplicados a sobreposição de espectros de absorvência, bem como forneceu uma avaliação quantitativa da bondade do ajuste. Um programa personalizado foi projetado para aquisição e análise de dados, o que permitiu ao investigador monitorar o estado metabólico da preparação durante o experimento. Estas adições relativamente simples ao sistema padrão da perfusão do coração fornecem uma introspecção original no estado metabólico da parede do coração além do que medidas convencionais da contração, da perfusão, e da extração da carcaça/oxigênio.
Introduction
A espectroscopia óptica da absorvência para monitorar a bioquímica intacta do órgão é uma aproximação extensamente-usada devido a sua natureza intrínseca, não-destrutiva1,2,3,4,5, 6,7,8,9. A absorbância da mioglobina fornece uma medida da tensão de oxigênio citosólica média10,11,12. Citocromos mitocondriais fornecem informações sobre a entrada de substrato no nível de flavinas, potencial de membrana do citocromo bL: bH13e entrega de oxigênio para as mitocôndrias na célula da citocromo oxidase (Cox ) estado redox14. Glancy et al. demonstraram que as atividades de cada complexo podem ser determinadas medindo-se o potencial da membrana mitocondrial e a taxa metabólica15. Daqui, usando a espectroscopia ótica, uma riqueza da informação pode ser obtida sem a necessidade de pontas de prova exógenas ou de modificações principais de sistemas atuais do estudo. O objetivo deste trabalho é apresentar um método robusto para a coleta de espectros ópticos de transmissão em preparações cardíacas de perfundidos convencionais com a única modificação importante realizando estudos em um ambiente escurecido.
A espectroscopia de absorção de reflectância foi utilizada com sucesso para realizar espectroscopia óptica do coração perfundidos3,6,16,17,18,19, bem como o coração in vivo1. A espectroscopia da reflectância consiste na luz de incidem na superfície do coração e em coletar a luz dispersada através do coração assim como a luz refletida difusa e especular. Assim, a luz coletada nesta abordagem é um composto de múltiplos mecanismos de espalhamento, bem como os absorvetos de cromossomos teciduais de interesse. Devido ao movimento e à superfície complexa do coração, a reflexão da luz fora da superfície do coração é particularmente problemática, alterando a profundidade de penetração e quantidade de luz puramente refletida.
As limitações da espectroscopia de absorção de refletância apresentadas acima foram resolvidas pela introdução de um cateter óptico na cavidade ventricular esquerda, permitindo a coleta de luz transmitida através da parede livre do ventrículo esquerdo20. Os benefícios da espectroscopia de transmissão para este tipo de estudo foram apreciados em estudos invasivos precoces por Tamura et al.9 a implementação atual fornece uma análise de espectroscopia de absorção de transmissão muito robusta do coração intacto com respeito à oxigenação citosólico e ao estado redox das mitocôndria uma variedade de circunstâncias21. Estes estudos iniciais usaram um cateter especialmente fabricado com um diodo emissor de luz alimentado na ponta orientada para gerar um teste padrão do lado-acendimento da luz branca através do myocardium. Entretanto, o cateter derrubado relativamente grande do diodo emissor de luz é somente apropriado para o uso em corações do tamanho médio (coelho, cobaia, etc.) e fabricação feita encomenda exigida. No estudo atual, um método de usar uma fibra óptica do lado-acendimento do núcleo do 200-mícron comercialmente disponível como um guia claro é apresentado. Em vez de um diodo emissor de luz prendido na ponta, o cateter com a ponta 500-micro redireciona a luz de uma fonte externa que aumenta a versatilidade do sistema. Esta abordagem permite o uso de uma ampla variedade de fontes de luz externas, incluindo lasers para aplicações como espectroscopia de espalhamento Raman. Para quantificar esses dados, uma análise espectral multicomponente on-line completa utilizando espectros de referência conhecidos para melhorar a acurácia da determinação espectroscópica de cromophores cardíacos é apresentada como descrito anteriormente20,22. O código fonte para esta análise será fornecido pelos autores, mediante solicitação. Usando esta aproximação, a informação na bioquímica cardíaca e na função mitochondrial pode ser obtida simultaneamente com os parâmetros funcionais cardíacos convencionais com pouco ou nenhum impacto na preparação do coração. Como o coração é criticamente dependente da função mitocondrial e do fornecimento de oxigênio, esta adição técnica ao sistema cardíaco clássico perfundidos melhorará muito a interpretação e utilidade deste importante modelo de desempenho cardíaco.
Protocol
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Nacional de cuidados e uso de animais do Instituto do coração, pulmão e sangue e realizados de acordo com as diretrizes descritas na lei de cuidado animal e bem-estar (7 USC 2142 § 13).
1. sistema de coração e Perfusate perfused isolados
Nota: esta preparação é muito semelhante às publicações anteriores23.
- Faça 4 litros do perfusato modificado de Krebs-Henseleit compor de (em mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CAcl2, 0,5 MgCl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 glicose, 1,0 lactato, e 10,0 HEPES.
- pH o perfusato a 7,4 em 37 ° c com NaOH e HCL.
- Filtre o perfusato através de uma membrana de poros de 1 μm.
- Enxágüe todos os tubos e câmaras do sistema cardíaco perfundidos executando e drenando a água purificada através do sistema.
- Transfira o perfusato no tanque e oxigenate com 100% o2 com o Bubbler ao manter a temperatura em 37 ° c usando um banho de água de circulação heated.
- Adicionar 2 de 12 μm de filtros de membrana de poros e prime o sistema com o perfusato enquanto recircula no modo Langendorff.
- Prenda uma braçadeira da tubulação na direita do tubo acima da cânula aórtica e ajuste o parafuso de modo que o fluxo aórtico caia a aproximadamente 10 mL/min.
2. excisão e perfusão do coração do coelho
- Excisão do coração
- Anestesie os coelhos brancos da Nova Zelândia masculina (cerca de 3 kg) através de uma injeção intramuscular de 1,5 mL de mistura de cetamina/acepromazina (10:1).
- Aproximadamente 10 – 15 minutos depois, administre 3% de isoflurano via inalação para um efeito anestésico completo.
- Confirme a profundidade apropriada da anestesia pelo beliscar do dedo do pé e coloc então uma linha na veia marginal da orelha para a administração de drogas subseqüentes.
- Injete 1.500 unidades (ou 1,5 mL de 1.000 unidades/mL) de heparina e deixe circular por 3 minutos.
- Verifique a profundidade adequada da anestesia e, em seguida, eutanizar com 6 mEq (ou 3 mL de 2 mEq/mL) de KCl.
- Abra rapidamente o tórax, localize o ápice do coração e a aorta. Retire o coração cortando a aorta o mais longe possível do coração e cortando as veias pulmonares o mais próximo possível dos pulmões.
Nota: a remoção de pulmões nesta fase inicial é diferente da publicação anterior23 , mas não tem impacto na preparação. - Coloc o coração em uma taça pequena do perfusato (mesmo perfusato como a etapa 1,3) que senta-se em uma cubeta do gelo para o transporte da cirurgia à perfusão.
- Canulação do coração
- Cannulate e amarre a aorta firmemente, certificando-se não incluir nenhumas bolhas na linha aórtica.
- Iniciar o fluxo em 70 mmHg pressão de perfusão, removendo a braçadeira da tubulação na linha aórtica e manter esta pressão durante o restante da cirurgia e canulação do vaso.
- Separar a artéria pulmonar da aorta e outros vasos e ligadura a veia cava e veias pulmonares. Retire o tecido adiposo e conjuntivo ainda presente.
- Cannulate a artéria pulmonaa para fornecer uma medida da taxa de fluxo da cavidade coronária e da tensão do oxigênio.
- Descarte o fluxo inicial para fora do coração (por cerca de 10 minutos) durante a preparação para eliminar sangue e detritos cirúrgicos. Após este período, recircule o perfusate.
3. lado-queima de fibra óptica colocação
- Conecte o cateter de fibra óptica a uma fonte de luz branca acoplada a fibra de alta potência para ajudar a visualização, bem como fornecer a luz para espectroscopia uma vez no coração.
- Corte um pequeno apêndice do átrio esquerdo, insira o cateter no ventrículo esquerdo através da válvula mitral e, em seguida, gire-o para alcançar uma parede livre de ventrículo esquerdo iluminado.
- Posicione a fibra óptica da captação diretamente oposto à região da iluminação máxima do ventrículo esquerdo em aproximadamente 1 cm do coração.
- Conecte a outra extremidade da fibra de captação a um espectrómetro de digitalização rápido.
4. espectroscopia óptica
- Desligue as luzes na área experimental para obter a escuridão completa.
- Inicie o programa personalizado, incorporando drivers de espectrómetro para realizar a aquisição de dados e análise em tempo real da luz transmitida.
Nota: uma versão executável da versão consolidada do programa de aquisição e análise espectral é fornecida como um arquivo de codificação suplementar. O código fonte está disponível por solicitação aos autores. - Navegue por todos os prompts, selecionando opções para o modo de aquisição de espectroscopia cardíaca perfundidos. Na próxima página, indique se a coleta de dados auxiliares está ocorrendo. Finalmente, insira os parâmetros de aquisição, incluindo a localização de ambos os cromossomos espectros de referência e dados a serem salvos.
- Insira uma largura de banda de 490 – 630 nm.
- Introduza uma taxa de amostragem de 2 Hz (i.e. 2 amostras/seg.).
- Colete uma corrente escura, ou zero de luz, espectro para corrigir os níveis de sinal de fundo, transformando a fonte de luz fora.
- Clique para selecionar as referências cromophore desejadas para ser usado na rotina de encaixe.
- Na página adquirir dados , ajuste a posição do cateter e da fibra de captação para maximizar a luz transmitida exibida no software com atenção específica à amplitude do sinal na região de 500 nm, onde a mioglobina oxigenada devem ser observadas absorvências.
- Certifique-se de que a luz transmitida não está saturando o detector na região de 600 nm.
- Assegure-se de que nenhuma fonte luminosa externa contribua ao espectro coletado desligando a iluminação do cateter e confirmando que nenhuma luz é detectada agora.
- Inicie a coleta de dados clicando no botão salvar espectros .
- Estale sobre o jogo como o controle para ver o espectro da absorvência da diferença dos espectros futuros ao espectro atual do "controle".
- Realize qualquer perturbação fisiológica conforme desejado.
- Protocolo 1: efeito do cianeto no desempenho cardíaco e na absorção de Cromophore
- Pare de recirculação de fluido da perfusão cardíaca.
- Usando uma bomba da seringa, injete o cianeto (2,5 a 75 milímetros em pH 7) em taxas diferentes no perfusato apenas antes da cânula aórtica para conseguir concentrações desejadas do cianeto (0, 25 a 1 milímetro, calculado da taxa de fluxo aórtica) no perfusato de fluxo no coração quando monitorização da função cardíaca e das propriedades ópticas.
- Pare a bomba da seringa do cianeto quando os efeitos no fluxo coronário e na frequência cardíaca junto com a transmissão ótica através da parede do coração estiverem no estado estacionário.
- Protocolo 2: isquemia/hipóxia
- Pare a infusão de cianeto.
- Após 5 minutos, troque o gás de borbulhagem de 100% de oxigênio para 100% de nitrogênio para remover o oxigênio do sistema.
- Após aproximadamente 10 minutos, pare o fluxo para simular uma condição isquêmica/hypoxic total.
- Protocolo 1: efeito do cianeto no desempenho cardíaco e na absorção de Cromophore
5. análise espectral dos dados
- Execute o programa no modo de análise de coração perfundidos.
- Selecione o espectrómetro apropriado.
- Incorpore o trajeto do arquivo de dados e o arquivo dos espectros de referência e selecione a fonte luminosa do cateter, que carrega o espectro pre-Saved da fonte luminosa do cateter.
- Selecione ler dados do compartimento.
- Selecione definir min e Max comprimento de onda.
- Insira a largura de banda para a análise de dados como 490 – 630 nm.
- Selecione voltar ao menu principal.
- Selecione ler referências.
- Confirme os espectros de referência a serem usado na análise.
- Selecione voltar ao menu principal.
- Selecione pontos temporais no menu principal.
- Selecione um ponto de tempo T0 como controle e defina o intervalo para 100 pontos.
- Selecione um ponto de tempo T1 como o período experimental em uma escala de 100 pontos.
- Observe o espectro de diferença bruta na guia ABS. Spectrum em média .
- Selecione calcular coeficientes de ajuste e clique na guia coeficientes de ajuste para observar o curso de tempo do ajuste de espectros de referência.
- Retorne ao menu principal e selecione calcular diferença ABS.
- Selecione T0 e ΔT1 em todas as posições. Observe o espectro ajustado na janela diferença de espectro e nos elementos de encaixe na janela peso de referência .
- Repita este procedimento para comparar outros pontos de tempo no experimento.
- Retorne ao menu principal.
- Salve dados e análises em um relatório de planilha digitando um nome desejado e selecionando salvar dados para análise posterior com outros programas.
Observação: se nenhum nome é digitado, o relatório é salvo com o mesmo nome que o arquivo de entrada. O relatório é salvo em uma pasta denominada arquivos de análise do Excel, localizada na mesma pasta que o arquivo de entrada original.
Representative Results
O sistema usado é um fora do sistema de coração de perfusão animal pequena prateleira, mas foi fortemente modificada para uso com um coração de coelho. As modificações foram principalmente para aumentar o tamanho do furo de todos os tubos para garantir a entrega adequada do fluxo para o coração de coelho. O grande cuidado foi feito para assegurar, nas pressões de perfusão usadas, a taxa de fluxo do sistema nativo da perfusão excedeu o fluxo com o coração Unido por pelo menos 5 vezes. 2 – os filtros de membrana de poros de 12 μm foram colocados em paralelo entre a bomba de fluido e a câmara de armadilha da bolha pré-carga aórtica para remover quaisquer detritos do coração.
Luz transmitida do coração do coelho
A Figura 1 apresenta o espectro do cateter (Figura 1a) e o espectro cru da luz transmitida da parede livre do coração de coelho (Figura 1B). Estes dados revelam uma atenuação muito grande da luz na região azul do espectro, porém as faixas da absorvência do mioglobina e dos citocromos mitochondrial podem diretamente ser observadas entre 490 e 580 nanômetro na inserção. É importante nestes estudos para assegurar bastante luz transmitida é detectado na região de 490 a 630 nanômetro para obter a informação nos chromophores cardíacos metabolicamente responsivos. O posicionamento das fibras externas e internas é ajustado antes de salvar os dados para maximizar a intensidade da luz, mas não saturar o detector na região de 625 nm.
Referência reduzida menos espectros oxidados de Cromophores de referência no coração.
A Figura 2 apresenta os espectros de referência utilizados para ajustar os espectros de diferença coletados nesses estudos. Estas referências incluem mioglobina, citocromo AA3 (Alternativamente citocromo a605 e citocromo a607, dependendo do tipo de perturbação22), citocromo a580, citocromo bL, citocromo bH , citocromo c, citocromo c1, FAD, uma representação de absorvência da luz incidente (denotado I0, que é usado para dar conta da luz peneirada, ou seja, fótons que atravessou o tecido sem ser absorvido), e uma linha (com variação inclinação e interceptação para dar conta do espalhamento, não mostrado na Figura 2). Alguns espectros são barulhentos, pois a concentração do material de referência puro foi muito baixa22.
Tempo de curso de espectros de referência se encaixa durante o experimento total
A Figura 3 representa o curso de tempo de um experimento típico calculado na etapa 5,15 do protocolo. Trata-se de uma fase de controle, seguida de uma fase de injeção de cianeto, seguida de uma lavagem de cianeto, seguida de uma fase de Desoxigenação e, finalmente, de isquemia. As alterações nos cromoforos individuais (mioglobina, citocromo AA3e citocromo c) ao longo do tempo são plotadas ao longo do tempo, juntamente com a taxa de fluxo coronariano. A variação da densidade óptica de cada cromophore é estimada multiplicando-se o coeficiente de ajuste obtido a partir da rotina de mínimos quadrados lineares e o pico representativo do cromophore (ou a absorvência máxima do referido cromophore). Por exemplo, para a mioglobina, o coeficiente de ajuste da referência de mioglobina é multiplicado pelo valor do espectro de referência da mioglobina a 580 nm. Observe que a rápida oxigenação da mioglobina para a adição de cianeto é compensada pelo aumento do fluxo, mas é antes da redução significativa dos citocromos. Este efeito é recuperado parcialmente com o washout do cianeto. Finalmente, a redução completa dos citocromos e da Desoxigenação da mioglobina é obtida com isquemia. Esses dados demonstram que dados dinâmicos sobre o estado metabólico do coração podem ser facilmente obtidos com essa metodologia. A posição dos espectros usados para os espectros da diferença é marcada neste curso do tempo como: linha de base de C, injeção do cianeto da NC, washout do cianeto de CNW, H N2 Hypoxia (o nitrogênio que está sendo borbulhou no perfusato em vez do oxigênio), e o Hi nenhuma isquemia do fluxo (nenhum perfusato que flui através do coração).
Espectro da diferença do tratamento do cianeto contra o controle e o ajuste do espectro da diferença do cianeto do coração do coelho.
Para obter um espectro de diferença, dois espectros absolutos são subtraída. Cada espectro absoluto é obtido tomando uma média de muitos (tipicamente 100) espectros para aperfeiçoar a relação sinal/ruído. Figura 4 A representa o espectro da diferença do coração Tratado do controle (C) e do cianeto (CN). Usando os espectros de referência descritos na Figura 2, o espectro de ajuste é calculado. O espectro residual é a subtração do ajuste dos dados brutos. O mesmo esquema é usado para todas as apresentações espectrais subsequentes. Figura 4 B apresenta as amplitudes espectros dos espectros de referência (mostrados na Figura 2) utilizadas para caber na Figura 4a. Os aumentos fortes na absorvência da maioria dos citocromos são observados porque o fluxo dos elétrons para baixo a corrente do citocromo foi obstruído pelo cianeto no estado estacionário. Além disso, a absorvância da mioglobina oxigenada aumentou à medida que o consumo de oxigênio foi eliminado por cianeto. Figura 4 C apresenta os espectros de diferença e o ajuste do espectro de diferença de CNW e CN, revelando a reversão parcial do efeito cianeto. Isto foi conseguido selecionando os pontos do tempo na etapa 5,18 do protocolo, movendo T0 ao CNW e T1 à região do CN do curso do tempo. Figura 4 D apresenta o espectro de diferença de Hi e C, que representa o estado totalmente desoxigenado e reduzido do citosol e das mitocôndrias versus a condição de controle. Novamente, isso foi realizado na etapa de protocolo 5,18, movendo T0 para C e T1 para HI.
Curso de tempo inicial de efeitos de cianeto no fluxo coronariano e cromophores
Figura 5 A mostra um exemplo da iniciação do efeito cianeto no tecido. Os ajustes para o myoglobin, o citocromo um605 e o citocromo c junto com o fluxo coronário são apresentados para um único coração. Estes cursos do tempo foram criados na etapa 5,15 do protocolo para o experimento do cianeto. A diferença individual versus a linha de base (posição 1) é mostrada na Figura 5B. Os espectros foram gerados a partir do número de posição correspondente (1-4) no curso do tempo. Isto foi realizado na etapa de protocolo 5,18, onde T0 estava sempre na posição 1, e subseqüentemente os espectros diferentes (2 – 4) foram criados movendo T1 para posicionar 2, 3, e 4 respectivamente. Um tanto surpreendente era a observação que o fluxo e o oxigenação do mioglobina aumentaram antes das mudanças significativas no estado redox do citocromo. A iniciação das mudanças no fluxo e na absorvência do cromóforo foi estimada pela extrapolação linear da taxa inicial de mudança da linha de base. Usando essa abordagem, e definindo a mudança no fluxo coronariano como tempo zero, o aumento da oxigenação da mioglobina iniciou 1,71 min ± 0,39 min após a mudança no fluxo, enquanto a absorvência citocromo A605 e citocromo c eram quase idênticas, mas muito mais lentas a 4,24 min ± 0,76 min e 4,34 min ± 0,77 min, respectivamente (n = 8). Estes dados sugerem que o cianeto relaxa o Tom vascular24 antes que uma mudança principal no estado metabólico do músculo cardíaco ocorra. Este efeito é causado provavelmente pelo cianeto que encontra o músculo liso vascular antes de alcangar a dose eficaz em torno dos myocytes cardíacos.
Estimativas de oxigenação de mioglobina em corações de controle
Utilizando os dados de cianeto como estimativa da oxigenação total da mioglobina e dos dados de isquemia para a mioglobina totalmente desoxigenada, estimamos que, em condições de controle, a mioglobina foi de apenas 88,2% ± 1,0% (n = 10) oxigenada, consistente com estudos anteriores20 , 21 anos de , a 25.
Figura 1 : Espectros do cateter óptico de disparo lateral. (A) este é um espectro da luz emitida da fonte luminosa remota através do cateter detectado com a fibra do coletor em aproximadamente 1 cm do cateter. Nesta geometria, o coração está ausente e a intensidade da fonte luminosa é ajustada de modo que o detector não saturate. (B) o cateter de queima lateral é inserido no ventrículo esquerdo e a luz transmitida do coração é coletada e mostrada. A pastilha mostra a região de 400 a 580 nm expandida, revelando a complexa transmissão da luz desta região. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Espectros de referência de cromossomos cardíacos utilizados para o encaixe espectral. Os espectros foram coletados por meio de uma variedade de métodos22 e são de redução – oxidado (para os citocromos) e desoxigenados – oxigenados (para mioglobina). Para I0, o espectro na Figura 1 a é simplesmente convertido em um termo de absorbância para fazer a referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Mudanças ópticas e de fluxo ao longo do tempo. A mudança óptica da densidade (δod) de cada cromóforo é simplesmente o espectro individual cabido do cromóforo em sua absorbância máxima. As frequências máximas de absorbância foram descritas anteriormente20,26. O curso de tempo apresentado é para um experimento, mostrando uma linha de base, seguida de injeção de cianeto (0,10 mM no fluxo máximo de perfusato), lavagem de cianeto, hipóxia nitrogenada realizada pela substituição do oxigênio por nitrogênio e, em seguida, completa isquemia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Espectros ajustados da diferença de várias circunstâncias. (A) espectro da injecção de cianeto menos a linha de base. O espectro de ajuste obtido a partir da rotina menos quadrada também é plotado. O espectro residual é a diferença entre os espectros brutos e aptos. (B) os espectros de referência utilizados para criar o ajuste apresentado na Figura 4a. O programa dimensiona as referências na Figura 2 para sua contribuição relativa no espectro de diferença atual. (C) mesmo que em a, mas mostrando o espectro de diferença de washout versus injeção de cianeto. (D) mesmo que em a, mas mostrando o espectro de diferença de isquemia versus basal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Alta resolução temporal do efeito da infusão de cianeto em citocromos selecionados, mioglobina e fluxo cardíaco. (A) tempo de fluxo cardíaco, desoximioglobina, redução do citocromo a605e redução do citocromo c. os números referem-se à posição dos espectros tomados em relação à linha de base na Figura 5B. (B) espectros de diferença para as 4 posições rotuladas na Figura 5A versus controle (posição 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O retrógrado isolado ou o trabalho de preparação do coração perfundidos é um esteio no estudo da fisiologia cardíaca, bem como a investigação pré-clínica de técnicas e drogas no coração. A chave para seu uso tem sido a facilidade de preparo, características funcionais robustas e controle de parâmetros experimentais, bem como a capacidade de medir muitos parâmetros funcionais do coração batendo. A espectroscopia óptica da absorvência fornece a introspecção na oxigenação do tecido assim como atividades metabólicas da mitocôndria. A espectroscopia óptica tem sido realizada principalmente nos estudos cardíacos de perfundidos isolados no modo de reflectância que é difícil de interpretar devido a complicações de movimento e espalhamento de luz.
Nós introduzimos a espectroscopia ótica da transmissão da parede do ventrículo (VWTOS) para fornecer um método robusto de monitorar chromophores metabólicos do tecido cardíaco. Em uma publicação anterior, Nós demonstramos que um diodo emissor de luz hardwired à ponta do cabo coaxial20 faz uma única fonte de luz do lado-acendimento intracardiac que possa ser usada para corações perfundidos de vwtos. A queima lateral refere-se à projeção da luz perpendicular ao eixo longo do cateter, ideal para iluminar a parede livre do ventrículo. O cateter do diodo emissor de luz era pequeno bastante para não impactar a função cardíaca mas exigiu a fabricação especializada no laboratório. O presente estudo apresenta o uso de um cateter de queima lateral comercial de 500 mícron que pode ser acoplado a qualquer fonte de luz compatível com fibra óptica. Estes cateteres ópticos de disparo lateral foram desenvolvidos comercialmente para a ablação do laser perpendicular ao eixo longo da fibra. Naturalmente, nós estamos usando o poder claro muito mais baixo do que exigido para a fotoablação. As fibras menores estão disponíveis para o uso em preparações menores tais como o coração perfundidos27do rato. Este sistema da fibra óptica forneceu a iluminação adequada através da parede do coração na escala do comprimento de onda onde os cromóforos cardíacos absorvem (450-630 nanômetro). Usando uma fibra óptica da captação na parte externa do coração, a absorvência da mioglobina e dos citocromos da mitocôndria pode ser monitorada com definição temporal e espectral excelente (veja Figura 5). A abordagem de fibra óptica de queima lateral tem várias vantagens sobre o cateter de LED para VWTOS, incluindo um perfil transversal muito menor do cateter que minimiza o impacto do cateter no coração, reduzindo o impacto mais flexível na válvula cardíaca e desempenho do ventrículo, nenhumas conexões elétricas que podem short para fora no perfusate salino, e finalmente um cateter que use uma fonte luminosa externa que aumente a flexibilidade da seleção da fonte luminosa para VWTOS.
Devido à forte absorvância do coração abaixo de 490 nm, é difícil gerar muita informação sobre a faixa de Soret dos citocromos na região de 410 – 445 nm ou NADH a 340 nm. Assim, a ampla absorvência da FAD a 450 nm é a absorvância de menor frequência observada, embora o pico de absorção total deste cromossomos não seja amostrado. Usando VWTOS a relação sinal-ruído é muito alta, pois toda a parede é amostrada em contraste com a espectroscopia de reflexão de superfície, comumente usada20, que apenas amostras da superfície do coração com inúmeras questões de espalhamento. VWTOS amostragem de toda a parede do coração é mais análoga às medidas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMRS) de muitos metabólitos cardíacos, como 31P detectado trifosfato de adenosina e creatina fosfato28, 13C detectado os metabolitos rotulados29,30 incluindo as etiquetas hyperpolarizada31,32, e 1H detectaram Metabolites33. Como o VWTOS pode ser conduzido usando dispositivos não-magnéticos, é completamente viável que RMN e VWTOS possam ser conduzidos simultaneamente. O VWTOS não se limita a cromóforos endógenos e pode ser usado para monitorar a absorção de sondas ópticas para pH, CA2 +e potencial de membrana plasmática.
Nós usamos 2 hertz (isto é 2 amostras/segundo) que fornece o único sinal excelente do espectro ao ruído. Embora as taxas de amostragem mais elevadas possam ser conseguidas que permitem a análise do ciclo cardíaco, os estudos precedentes demonstraram que não há nenhuma batida para bater a variação na absorvância do cromóforo, assim que nenhum esforço para coletar seletivamente a luz em função do ciclo cardíaco era feito34. Devido à geometria de VWTOS, a deteção da luz é menos dependente do movimento do tecido do que métodos da reflexão, desde que os eventos de espalhamento de superfície complexos são eliminados. Nós achamos que o movimento severo pode interromper essas medidas, mas a análise espectral em tempo real revela rapidamente transições espectrais inconsistentes com as transições de cromossomos de tecido. Mais uma vez, isso só ocorre quando o coração se move grosseiramente longe da fibra de coleta drasticamente reduzindo a quantidade de luz transmitida recolhida.
Os dados de vwtos são analisados utilizando-se a rotina completa de encaixe espectral com base em uma biblioteca de referência de espectros de cromossomos cardíacos e o espectro da fonte luminosa como descrito anteriormente20,22,27, 35 com uma aproximação linear simples dos mínimos quadrados. Este procedimento de encaixe espectral compensado para sobrepor o espectro da absorvância e não confia em comprimentos de onda "isobestic". Esta análise de espectro completa elimina artefatos associados com a análise de feixe duplo comum (ou seja, dois comprimentos de onda)1,3,6 que se mostrou problemático20. A vantagem adicional da análise espectral completa é a geração de uma bondade do ajuste dos resíduos, não disponível em protocolos duplos do feixe.
Neste estudo, focamos o efeito do cianeto nas propriedades ópticas do coração. Como o cianeto bloqueia a citocromo oxidase, inibe o consumo de oxigênio e, essencialmente, resulta em uma redução líquida de todos os citocromos como os elétrons de volta na cadeia do citocromo. No entanto, o potencial de membrana aparentemente permanece alto, pois as alterações redox em bL e bH são muito pequenas quando comparadas ao citocromo c13. Com a cessação do consumo de oxigênio, a tensão de oxigênio no tecido deve se aproximar do perfusato e observamos um aumento precoce da mioglobina oxigenada com cianeto consistente com a noção de que o coração perfumado de soro fisiológico, mesmo em perfusão retrógrada os modos, não é totalmente oxigenante mioglobina no citosol19,20,21,36. A comparação do efeito máximo do cianeto na mioglobina oxigenada com o espectro totalmente desoxigenado obtido com isquemia revela uma oxigenação de mioglobina de apenas cerca de 88%, consistente com estudos prévios.
É importante notar neste estudo que os efeitos do cianeto sobre a oxigenação da mioglobina e a redução do citocromo foram resolvidos temporalmente. É surpreendente que os efeitos do cianeto foram observados primeiramente no fluxo coronariano e no mioglobina antes que as grandes mudanças no estado redox dos citocromos do coração fossem observadas. O aumento marcado adiantado no fluxo sugere que um efeito no músculo liso arterial24,37 possa ocorrer antes que os efeitos metabólicos brutos nas pilhas de coração sejam observados. O aumento do fluxo, potencialmente com uma diminuição modesta induzida por cianeto na respiração, provavelmente resulta no aumento imediato da mioglobina oxigenada causada pelo aumento do fornecimento de oxigênio. Com a disseminação da inibição do cianeto para os miócitos, observa-se um aumento adicional no fluxo coronariano (ver a região marcada 3 na Figura 5a), provavelmente impulsionada por inúmeros fatores metabólicos38. O grande impacto precoce do cianeto no fluxo sugere que o metabolismo do músculo liso vascular pode ser mais potente na alteração do tônus vascular do que no metabolismo dos miócitos. Esses dados sustentam a noção bem estabelecida de que a mioglobina tem uma afinidade muito menor para o oxigênio do que a COX, mesmo no coração intacto, pois a oxigenação da mioglobina ocorreu bem antes das alterações no estado redox das mitocôndrias (Figura 5). Este alto nível de mioglobina desoxigenada condições de controle é consistente com estudos anteriores sugerindo que o coração perusado isolado de soro fisiológico pode ser parcialmente hipóxico mesmo condições de controle9,19, 20,21,27,36, ressaltando a importância de monitorar a oxigenação do tecido cardíaco quando se utiliza este importante modelo em fisiologia cardíaca.
Nós apresentamos aqui os detalhes experimentais para conduzir a espectroscopia da absorção da transmissão no coração perfundidos isolado. Nós adaptamos com sucesso esta técnica para o uso nos corações do coelho ao rato usando uma fibra ótica intracardiac do lado-acendimento fina. Utilizando as rotinas de encaixe espectral cheias do estado da arte, a interação ótica complexa dos cromóforos cardíacos pode facilmente ser extraída que fornece, uma medida em tempo real próxima de elementos críticos do metabolismo miocárdico simultaneamente com convencional medidas funcionais.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi totalmente apoiado pelo programa intramural NHLBI (projeto # ZIA HL00460131).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
| BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
| BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
| Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
| Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
| Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
| Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
| Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
| High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
| Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
| Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
| Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
| PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
| Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
| Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
| Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
| Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
| Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
| Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
| Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |
References
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