Här introducerar vi en metod för att använda en intraventrikel optisk kateter i parfymera hjärtan för att utföra absorbansspektroskopi över hjärtväggen. De data som erhålls ger robust information om vävnadens syre spänning samt substrat utilization och membranpotential samtidigt med hjärt prestanda åtgärder i denna allestädsliga beredning.
Absorbans spektroskopi av hjärtmuskeln ger oförstörande bedömning av cytosoliska och mitokondriell syresättning via myoglobin och cytokrom absorbans respektive. Dessutom kan många aspekter av mitokondriell metabolisk status såsom membran potential och substrat inträde också uppskattas. Att utföra kardiell vägg transmission Optisk spektroskopi, en kommersiellt tillgänglig Side-bränning optisk fiber kateter placeras i den vänstra ventrikeln av isolerade parfymera hjärta som en ljuskälla. Ljus som passerar genom hjärtväggen samlas med en extern optisk fiber för att utföra Optisk spektroskopi av hjärtat i nära realtid. Överföringsmetoden undviker många ytspridnings störningar som förekommer i allmänt använda reflektions metoder. Förändringar i transmural absorbansspektra deconvolved med hjälp av ett bibliotek av kromofor Reference Spectra, som ger kvantitativa mått av alla kända hjärtkromophores samtidigt. Denna spektrala deconvolution metod elimineras inneboende fel som kan resultera från att använda gemensamma dubbla våglängd metoder tillämpas på överlappande absorbans spektra, samt som en kvantitativ utvärdering av godhet av passform. Ett anpassat program utformades för datainsamling och analys, vilket tillät prövaren att övervaka preparatets metaboliska tillstånd under experimentet. Dessa relativt enkla tillägg till standard hjärtat perfusion systemet ger en unik inblick i det metabola tillståndet i hjärtväggen utöver konventionella åtgärder av kontraktion, perfusion, och substrat/syre utvinning.
Optisk absorbansspektroskopi för övervakning intakt organ biokemi är en allmänt använd metod på grund av dess inneboende, icke-förstörande natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbans ger ett mått på den genomsnittliga cytosoliska syre spänningen10,11,12. Mitokondriella cytokromer ger information om substrat inträde på nivån av flaviner, membran potential från cytokrom bL: bH13, och syre leverans till mitokondrier i cellen från cytokrom oxidas (Cox ) redox tillstånd14. Glancy et al. visat att verksamheten i varje komplex kan bestämmas genom att mäta mitokondriella membranet potential och ämnesomsättningen15. Därför, med hjälp av optisk spektroskopi, en mängd information kan erhållas utan behov av exogena sonder eller större modifieringar av nuvarande Studiesystem. Målet med denna uppsats är att presentera en robust metod för att samla in optiska spektra av transmission i konventionella parfymerade hjärt preparat med den enda stora modifieringen som utför studier i en mörklagt miljö.
Reflektans absorptionsspektroskopi har använts framgångsrikt för att utföra Optisk spektroskopi av det parfymera hjärtat3,6,16,17,18,19 samt som hjärtat in vivo1. Reflektans-spektroskopi består av att hålla ljuset på hjärtats yta och att samla upp ljuset som sprids genom hjärtat, samt diffust och speglande reflekterat ljus. Sålunda, det insamlade ljuset i detta tillvägagångssätt är en sammansatt av flera spridningsmetoder samt vävnad kromofor absorbanserna av intresse. På grund av den rörelse och komplexa ytan av hjärtat, ljusreflektion från ytan av hjärtat är särskilt problematiskt, ändra djupet av penetration och mängden rent reflekterat ljus.
Begränsningarna av reflektans absorptionsspektroskopi som presenteras ovan löstes genom att införa en optisk kateter i vänster ventrikelhålighet, vilket möjliggör insamling av genomlysnings ljus över vänster kammare fri vägg20. Fördelarna med överföringspektroskopi för denna typ av studie uppskattades i tidiga invasiva studier av Tamura et al.9 den nuvarande implementeringen ger en mycket robust analys av intaktabsorptionsspektroskopi med När det gäller cytosolisk syresättning och mitokona redox tillstånd under en rad olika villkor21. Dessa inledande studier används en speciellt fabricerad kateter med en Powered LED på spetsen orienterade för att generera en Side-bränning mönster av vitt ljus genom hjärtmuskeln. Emellertid, den relativt stora LED tippade katetern är endast lämplig för användning på medelstora hjärtan (kanin, marsvin, etc.) och krävs anpassad tillverkning. I den aktuella studien, en metod för att använda en kommersiellt tillgänglig 200-micron Core Side-bränning optisk fiber som en ljus guide presenteras. Istället för en trådbunden lysdiod vid spetsen omdirigerar katetern med 500-Micro-spetsen ljus från en extern källa som ökar mångsidigheten i systemet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att använda en mängd olika externa ljuskällor, inklusive lasrar för tillämpningar som Raman spridning spektroskopi. För att kvantifiera dessa data presenteras en online-fullständig multikomponentspektralanalys med kända Referensspektra för att förbättra noggrannheten i den spektroskopiska bestämningen av hjärtkromoforer, som tidigare beskrivits20,22. Källkoden för denna analys kommer att tillhandahållas av författarna på begäran. Med hjälp av denna metod, information om hjärtats biokemi och mitokondriell funktion kan erhållas samtidigt med de konventionella hjärt funktionella parametrar med liten eller ingen inverkan på hjärtat preparatet. Eftersom hjärtat är kritiskt beroende av mitokondriell funktion och syre leverans, detta tekniska tillägg till det klassiska parfymera hjärt systemet kommer att avsevärt förbättra tolkningen och nyttan av denna viktiga modell av hjärt prestanda.
Den isolerade retrograd eller arbetar parfymera hjärtat förberedelse är en stöttepelare i studiet av hjärtfysiologi samt preklinisk undersökning av tekniker och droger på hjärtat. Nyckeln till dess användning har varit lätt att förbereda, robusta funktionella egenskaper och kontroll av experimentella parametrar samt förmågan att mäta många funktionella parametrar i det slående hjärtat. Optisk absorbansspektroskopi ger insikt i vävnadsyresättning samt mitokonskens metaboliska aktiviteter. Optisk spektroskopi har i första hand genomförts i de isolerade parfymera hjärt studierna i reflektans läge som är svåra att tolka på grund av rörelse och lätta spridnings komplikationer.
Vi har infört ventrikel vägg transmission Optisk spektroskopi (VWTOS) för att ge en robust metod för övervakning av kardiell vävnad metaboliska chromophores. I en tidigare publikation, vi visade att en LED hårdkodade till spetsen av koaxialkabeln20 gör en unik intrakardiell Side-bränning ljuskälla som kan användas för vwtos parfymera hjärtan. Den Side-bränning hänvisar till projektionen av ljus vinkelrätt mot den långa axeln av katetern, perfekt för belysning av ventrikeln fri vägg. LED-katetern var liten nog att inte påverka hjärtfunktionen men krävde specialiserad tillverkning i laboratoriet. Den aktuella studien presenterar användningen av en 500 micron kommersiell Side-bränning kateter som kan kopplas till någon ljuskälla kompatibel med fiberoptik. Dessa Side-bränning optiska katetrar var kommersiellt utvecklad för laser ablation vinkelrätt mot den långa axeln av fiber. Naturligtvis använder vi ljusstyrka mycket lägre än vad som krävs för photoablation. Mindre fibrer är tillgängliga för användning på mindre preparat såsom parfymerad mus hjärta27. Detta fiberoptiska system som tillräcklig belysning genom hjärtväggen i våglängdsområdet där hjärtats förekommer absorbera (450-630 nm). Med hjälp av en pickup fiberoptik på utsidan av hjärtat, kan absorbans av myoglobin och mitokondierna cytokrom övervakas med utmärkt tidsmässiga och spektrala upplösning (se figur 5). Den Side-bränning fiberoptisk strategi har flera fördelar jämfört med LED-katetern för VWTOS, inklusive en mycket mindre tvärsnitts profil av katetern som minimerar effekten av katetern på hjärtat, mer flexibel minska påverkan på hjärtklaffen och ventrikeln prestanda, inga elektriska anslutningar som kan kort ut i saltlösning perfusate, och slutligen en kateter som använder en extern ljuskälla som ökar flexibiliteten i ljuskälla val för VWTOS.
På grund av den starka absorbans av hjärtat under 490 nm, är det svårt att generera mycket information om Soret band av cytokrom i regionen 410-445 nm eller NADH vid 340 nm. Sålunda, den breda absorbans av FAD vid 450 nm är den lägsta frekvensen absorbans som observeras, även om hela absorptionen toppen av denna förekommer inte samplas. Använda VWTOS signal-brus-förhållande är mycket hög eftersom hela väggen samplas i motsats till ytan reflektion spektroskopi, vanligen används20, som bara prover ytan av hjärtat med många spridnings frågor. VWTOS provtagning hela hjärtväggen är mer jämförbar med kärnmagnetisk resonans spektroskopi (NMRS) åtgärder av många hjärtmetaboliter såsom 31P detekterat adenosintrifosfat och kreatinfosfat28, 13C detekterad märkta metaboliter29,30 inklusive hyperpolariserade etiketter31,32och 1H detekterade metaboliter33. Eftersom VWTOS kan utföras med hjälp av icke-magnetiska enheter, är det helt möjligt att NMR och VWTOS kan genomföras samtidigt. Vwtos är inte begränsat till endogena förekommer och kan användas för att övervaka absorption från optiska sonder för pH, ca2 +, och plasmamembran potential.
Vi använder 2 Hz (dvs. 2 prover/SEK) som ger utmärkt enda spektrum signal till brus. Även om högre samplingsfrekvenser kan uppnås som tillåter hjärt cykel analys, tidigare studier har visat att det finns ingen Beat att slå variation i kromofor absorbans, så ingen ansträngning för att selektivt samla in ljus som en funktion av hjärt cykeln var Made34. På grund av VWTOS geometri är detektering av ljus mindre beroende av vävnads rörelse än reflektions metoder, eftersom de komplexa ytspridnings händelserna elimineras. Vi finner att svår rörelse kan störa dessa åtgärder, men realtid spektralanalys snabbt avslöjar spektralöver gångar som är oförenliga med vävnad kromofor övergångar. Återigen, detta sker endast när hjärtat rör sig grovt bort från att samla fiber dramatiskt minska mängden insamlade genomlysnings ljus.
Vwtos data analyseras med hjälp av fullständig spektralmontering rutin baserad på ett referens bibliotek av spektra av hjärtats Kromoforer och spektrumet av ljuskällan som tidigare beskrivits20,22,27, 35 med en enkel linjär minsta kvadratmetoden. Detta spektrala monterings förfarande kompenserade för överlappande absorbans spektrum och förlitar sig inte på “isobestic” våglängder. Denna fullständiga spektrum analys eliminerar artefakter i samband med gemensamma Dual beam (dvs. två våglängd) analys1,3,6 som har visat sig vara problematiskt20. Den extra fördelen med full spektralanalys är generering av en godhet av passform från RESIDUALS, inte finns i Dual beam protokoll.
I denna studie fokuserade vi på effekten av cyanid på de optiska egenskaperna hos hjärtat. Som cyanid blockerar cytokrom oxidas, det hämmar syreförbrukning och i huvudsak resulterar i en nettominskning av alla cytokrom som elektronerna tillbaka upp i cytokrom kedjan. Dock är membranet potential tydligen fortfarande hög, eftersom redox förändringar i bL och bH är mycket små jämfört med cytokrom c13. Med upphörande av syreförbrukning, syre spänningen i vävnaden bör närma sig parfymen och vi noterade en tidig ökning av oxygenerade myoglobin med cyanid förenligt med uppfattningen att saltlösning parfymerat hjärta, även i retrograd perfusion lägen, är inte helt syresätta myoglobin i Cytosol19,20,21,36. Jämföra den maximala effekten av cyanid på syresatt myoglobin med helt deoxygenerade spektrum som erhållits med ischemi avslöjar en myoglobin syresättning av endast ca 88%, i överensstämmelse med tidigare studier.
Det är viktigt att notera i denna studie att cyanideffekterna på myoglobin syresättning och cytokrom reduktion var temporally lösta. Det är förvånande att effekterna av cyanid först observerades på koronarflöde och myoglobin innan stora förändringar i hjärtats cytokrom redox tillstånd observerades. Den tidiga markant ökning av flödet tyder på att en effekt på arteriell glatta muskler24,37 kan förekomma innan brutto metabola effekter i hjärtat celler observeras. Ökningen av flödet, potentiellt med en blygsam cyanid inducerade minskning av andning, sannolikt resulterar i den omedelbara ökningen av oxygenerade myoglobin orsakas av ökningen av syre leverans. Med spridningen av cyanidhämning till myocyterna, en ytterligare ökning av koronarflöde observeras (se regionen märkt 3 i figur 5a), troligen driven av många metabola faktorer38. Den stora tidiga effekten av cyanid på flödet tyder på att metabolismen av den vaskulära glatta muskeln kan vara mer potent i att förändra vaskulär ton än metabolismen av myocyter. Dessa data stöder den väletablerade uppfattningen att myoglobin har en mycket lägre affinitet för syre än COX, även i intakt hjärta, som myoglobin syresättning inträffade långt före förändringar i mitokonsamen redox tillstånd (figur 5). Denna höga nivå av deoxygenerade myoglobin under kontrollförhållanden är förenlig med tidigare studier som tyder på att den isolerade saltlösning perfunderade hjärtat kan vara delvis hypoxisk även under kontrollvillkor9,19, 20,21,27,36, understryker vikten av att övervaka hjärtvävnad syresättning när du använder denna viktiga modell i hjärtats fysiologi.
Vi presenterar här de experimentella detaljerna för att bedriva transmissionabsorptionsspektroskopi på det isolerade parfymera hjärtat. Vi har framgångsrikt anpassat denna teknik för användning på hjärtan från kanin till musen genom att använda en tunn Side-bränning intrakardiell optisk fiber. Utnyttja toppmoderna full spektrala montering rutiner, den komplexa optiska interaktionen av hjärtats förekommer kan lätt extraheras ger, en nära realtid mått av kritiska element av myokardmetabolism samtidigt med konventionella funktionella åtgärder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes fullt ut av NHLBI interna program (Project # ZIA HL00460131).
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |