Her presenterer vi en protokoll for å generere pseudotyped partikler i BSL-2 omgivelser omfatter spike protein svært patogene virus Midtøsten åndedretts syndrom og alvorlig akutt åndedretts syndrom coronaviruses. Disse pseudotyped partikler inneholder et luciferase reporter gen slik at kvantifisering av viruset inn i vert målcellene.
Protokollen skal generere coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped partikler med murine leukemi virus (MLV) core og luciferase reporter, med en enkel transfection prosedyre tilgjengelig HEK-293T celle linje. Når dannet og løslatt fra produsent celler, innlemme disse pseudovirions en luciferase reporter genet. Siden de bare inneholde heterologous coronavirus pigge protein på overflaten deres, partikler oppfører seg som sine opprinnelige coronavirus kolleger for oppføringen trinn. Som sådan, er de gode privat bruk av opprinnelige virions for å studere viral inn i verten cellene. Vellykkede innreise og infeksjon i målcellene, luciferase reporteren blir integrert i vert celle genomet og uttrykkes. Bruker en enkel luciferase analysen, kan transduced celler lett kvantifiseres. En viktig fordel av prosedyren er at det kan utføres i biosikkerhet nivå 2 (BSL-2) fasiliteter i stedet for BSL-3 fasiliteter som kreves for arbeid med svært patogene coronaviruses som Midtøsten åndedretts syndrome coronavirus (MERS-CoV) og alvorlig akutte åndedretts syndrome coronavirus (SARS-CoV). En annen fordel kommer fra allsidigheten som det kan brukes på konvolutt proteiner tilhører alle tre klasser av viral fusion proteiner, som klassen jeg influensa hemagglutinin (HA) og Ebola-viruset glykoprotein (GP), klasse II Semliki skog viruset E1 protein eller klasse III vesicular stomatitt virus G glykoprotein. En begrensning av metodikken er at det bare kan recapitulate virus oppføring trinnene formidles av konvolutten protein etterforsket. For å studere andre viral livssyklus trinn, kreves andre metoder. Eksempler på disse pseudotype partikler kan brukes i mange programmer er verten celle mottakelighet og tropism og testing av virus oppføring hemmere å dissekere viral oppføring stier brukt.
Verten celleoppføring utgjør forbokstaven skritt av viral smittsomme levetid. Innhyllet virus involverer dette binding til en enkelt vert celle reseptor eller flere reseptorer, etterfulgt av sammensmelting av viral og mobilnettet membraner. Disse viktige funksjoner utføres av viral konvolutten glykoproteiner1,2. Coronavirus konvolutt glykoprotein heter spike (S) protein og er medlem av klassen jeg viral fusion proteiner2,3,4,5,6. Studere viral konvolutten glykoproteiner er avgjørende for å forstå mange kjennetegn til et gitt virus, som: lifecycle innvielsen, sin vert og mobilnettet tropism, Inter overføring, viral patogenesen, samt verten celle oppføring veier. Viral pseudotyped partikler, også kalt pseudovirions, er kraftige verktøy som enkelt studere funksjonen av viral fusion proteiner. Pseudotyped partikler eller pseudovirions er chimeric virions som består av en surrogat viral kjerne med en heterologous viral konvolutten protein på overflaten deres. Protokollen Hovedformålet er å vise hvordan å oppnå coronavirus spiker pseudotyped partikler som er basert på en murine leukemi virus (MLV) kjerne og inneholder en luciferase reporter genet. Som eksempler, metoden å produsere pseudotyped partikler med spike proteiner av svært patogene alvorlig akutt åndedretts syndrom (SARS) og Midtøsten åndedretts syndrom (MERS) coronaviruses presenteres. Protokollen beskriver hva prosedyren involvert, hvordan å infisere utsatt målet celler, og infectivity kvantifisering av luciferase analysen.
Siden oppføringen trinnene i pseudovirions er underlagt coronavirus S på overflaten deres, angi de cellene på en lignende måte til innfødte kolleger. Som sådan, er de gode surrogater av funksjonelle infectivity analyser. Pseudotyped partikler er vanligvis avledet fra foreldrenes modell virus som retroviruses (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 og lentivirus humant immunsviktvirus-HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesicular stomatitt virus-VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). når den brukes i pseudotyping, foreldrenes virus genomer er endret for å fjerne viktig gener, gjør dem defekt for å utføre en fullstendig replikering syklus. Denne funksjonen tillater dem å brukes i mellomliggende biosikkerhet nivå fasiliteter (BSL-2) og er en viktig fordel over bruker svært patogene innfødt virus som krever høyere biosikkerhet fasiliteter (BSL-3, BSL-4 som ikke er så lett tilgjengelig) når gjennomfører virus oppføring studier. Her, S proteiner risiko gruppe 3 patogener SARS-CoV og MERS-CoV brukes som eksempler på viral konvolutt proteiner blir innlemmet i MLV pseudotyped partikler, genererer SARS-CoV S og MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp og MERS-Spp, henholdsvis). Disse pseudovirions har blitt brukt i studier med fokus på oppføring hendelsene i disse virus48,49,50,51. En annen fordel er at teknikken beskrevet her ikke er begrenset til pseudotyping coronavirus S proteiner: det er svært fleksibelt og kan brukes å innlemme representanter for alle tre klasser av viral fusion proteiner. Eksempler inkluderer influensa hemagglutinin (HA, klasse I)52, Ebola-viruset glykoprotein (GP klasse I), E1 protein alphavirus Semliki skog virus (SFV, klasse II) og VSV glykoprotein (G, klasse III)53. I tillegg flere slags viral glykoprotein kan være co bygget inn en pseudotyped partikkel, som i tilfelle av influensa HA- og NA – pseudotyped partikler51.
Basert på arbeidet som utføres av Bartosch et al.20, denne protokollen beskriver generering av MLV pseudotyped partikler med en tre-plasmider co hva bruker de allment tilgjengelig og høyt transfection kompetente HEK-293T celle linje 54. de første plasmider koder MLV kjernen gener kneble og pol men mangler MLV konvolutt konv genet. Den andre plasmider er en overføring vektor som koder et firefly luciferase reporter gen, et MLV Ψ-RNA emballasje signal, sammen med 5′- og 3-flankert MLV lenge terminal gjenta (VTH) regioner. Den tredje plasmider koder fusion protein av interesse, i dette tilfellet enten SARS-CoV S eller MERS-CoV S protein. På co transfection av tre plasmider bruker en transfection reagens, bli viral RNA og proteiner uttrykt i transfekterte celler slik at generasjon av pseudotyped partikler. Siden MLV brukes som pseudovirion ryggraden, dette skjer i plasma membranen: RNAs inneholder luciferase gene reporter og emballasje signal få innkapslet i begynnende partikler som også innlemme plasma membran-uttrykt coronavirus spike proteiner. Partikler som bud ut fra cellene inneholder coronavirus S protein på overflaten deres og høstes for bruk i infectivity analyser. Fordi pseudotyped partikler havn coronavirus S protein og ikke MLV konvolutt proteiner, når den brukes for å infisere celler, oppfører de seg som sin opprinnelige coronavirus kolleger for oppføringen trinn. Viral RNA inneholder luciferase reporter og flankert LTRs er så ut i cellen og retroviral utvalg aktiviteter gir sin omvendt transkripsjon inn DNA og integrering i verten celle genomet. Kvantifisering infectivity viral pseudotyped partikler i infiserte celler blir da utført med en enkel luciferase aktivitet analysen. Fordi DNA sekvensen som blir integrert i vert celle genomet bare inneholder luciferase genet og ingen av MLV eller coronavirus protein-koding gener, er de iboende tryggere å bruke enn replikering kompetente innfødt virus.
Er tryggere surrogater og svært tilpasningsdyktige tillate innlemmelse av ulike typer konvolutten glykoproteiner, pseudotyped partikler beskrevet her er også svært allsidig og kan brukes til å studere mange aspekter av viruset oppføringen. Dette inkluderer men er ikke begrenset til: testing verten celle mottakelighet for virusinfeksjon, analysere mobilnettet oppføring veier en innhyllet virus bruker, studerer effekten av farmakologiske hemmere og narkotika screenings, gjennomføre nøytralisering antistoff analyser, karakteriserer verten celleoppføring av innhyllet virus som ikke kan kultivert og generere viral vektorer for gen levering, stabil mobilnettet uttrykket av gener severdigheter, eller slå av genet.
Denne protokollen beskriver en metode for å effektivt produsere pseudotyped partikler bærer S protein av risiko gruppe 3 coronaviruses, SARS-CoV og MERS-CoV, i BSL-2 omgivelser. Disse partiklene, som inneholder en luciferase reporter genet, tillate oss å lett kvantifisere coronavirus S-mediert oppføring hendelser av en relativt enkel luciferase analysen48,49,50,51. I infectivity analyser bruke ettergivende celler, bekrefte vi at luciferase aktivitet målt er avhengig av konsentrasjonen av partikler. I tillegg gir ACE2 og DPP4 reseptor transfection mer effektiv oppføring i dårlig ettergivende celler linjer, for eksempel HEK-293T celler. Metoden er svært tilpasses andre viral konvolutten glykoproteiner og har vært brukt mye48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofte å utfylle andre analyser som biokjemiske analyser eller innfødt virusinfeksjoner.
Protokollen som beskrives her er basert på retrovirus MLV som inkorporerer en luciferase reporter. Det er imidlertid viktig å understreke at det er et svært bredt spekter av andre pseudotyping systemer som har blitt utviklet for emballasje coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 og andre viral konvolutten glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. noen av disse andre systemer er basert på brukte MLV retroviral kjernen7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller basert på brukte lentiviral HIV-1 pseudotyping systemet ved hjelp av ulike strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesicular stomatitt viruset (VSV) som kjernen, som kan inkludere en rekke konvolutten glykoproteiner og igjen med forskjellige ansatt strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. I tillegg andre journalister som fluorescerende proteiner som GFP11,13 og RFP36eller enzymer enn luciferase som β-galactosidase16,17 og utskilles alkalisk fosfatase (SEAP)42 har vært vellykket ansatt for målinger. Videre i analysen presentert i denne protokollen, ble en forbigående transfection brukt til å uttrykke MLV og CoV S gener og proteiner. Det finnes imidlertid andre strategier for uttrykk, for eksempel generering av stabil linjer for produksjon av pseudotyped virus7,14. Som hvert av disse systemene har sine fordeler og ulemper, er det viktig å vurdere følgende viktige parametere når du bestemmer hvilke pseudotyping system beste en etterforsker passer: pseudovirion kjernen (MLV, HIV-1, VSV eller andre), hvor selektiv en bestemt pseudotyping core er å inkorporere en bestemt viral konvolutten glykoprotein, reporter for analysen avlesning (GFP, luciferase, SEAP eller andre) og hva strategien (antall plasmider involvert i co transfection, forbigående Hva eller generering av stabil linjer).
Det finnes en rekke avgjørende skritt i metoden som er viktig å understreke. Cellen tetthet, spesielt av HEK-293T-17 produsent celle linjen er en kritisk faktor i å sikre vellykket transfection. En celle tetthet mellom 40-60% confluency ble funnet for å være optimalt. Høyere tettheten vanligvis føre lav transfection effektivitet og lave partikkel produksjon. Også er det viktig å huske at HEK-293T-17 celler er mindre tilhenger enn andre linjer. Forsiktighet bør utvises ved håndtering dem for å unngå koble dem unødvendig. Ett alternativ er å behandle celle kultur plast overflater med poly-D-lysine å forbedre etterlevelse. Videre resulterer høyere celle passasje ofte i dårlig transfection priser. Etter tilføyer transfection reagensen til HEK-293T-17 celler, er det også viktig å huske at cellen permeabilitet øker. Det er derfor på dette punktet er det best å unngå å bruke middels som inneholder antibiotika som de kan øke cytotoksisitet. Før samle pseudotyped partikler, sjekk fargen på transfekterte HEK-293T-17 celle supernatants. Vanligvis etter 48 timer med transfection tar kultur medium cellefargen en oransje-rosa skjær. Gul-farget medium vanligvis betyr dårlig pseudotyped partikler gir og er ofte et resultat av problemer med cellen seeding tetthet eller høy passasje tall.
I denne protokollen utføres pseudotyped partikkel produksjon i 6-vel plate format. For å øke volumet av produsert partikler, flere brønner i en 6-vel plate kan være transfected med samme plasmider mix og supernatants kan være gruppert sammen. Bassenget kan deretter avklart, filtrert og aliquoted. Alternativt, for å skalere produksjon opp, andre typer fartøy (f.eks 25 eller 75 cm2 flasker) kan brukes. I dette tilfellet skal transfection forhold skaleres tilsvarende. I denne protokollen utføres infectivity analysen med et 24-vel plate format og en luminometer som bare tillater mål en tube samtidig. For høy gjennomstrømning screenings er andre formater også mulig, for eksempel 96-brønns plate format og en plate leser luminometer. Volumer og reagensene luciferase analysen må tilpasses tilsvarende. Lagring av pseudotyped partikler i cryovials ved-80 ° C stabilt deres i flere måneder uten merkbar nedgang i infectivity. Det anbefales ikke å utsette dem for å fryse-opptining som dette vil redusere deres infectivity over tid. Dermed er det best å lagre dem i små dele som 0,5-1 mL og tiner dem før en infeksjon.
Metoden som presenteres her har flere begrensninger. En viktig en er det faktum at pseudotyped partikler recapitulate bare viral oppføring hendelser. Analysere andre trinn i livssyklusen til smittsomme, er andre analyser nødvendig. Videre som MLV partikler bud på plasma membranen, det er viktig å Husk at konvolutten glykoprotein studert trenger å også trafikk til plasma membranen for inkorporering pseudovirions under produksjon. Som sådan, er det viktig å vite hvor cellen en bestemt viral konvolutten glykoprotein uttrykkes i transfection forhold, som ved å visualisere subcellular lokalisering med immunofluorescence analysen og/eller ved å søke etter oppbevaring signaler i protein. Også, mens protokollen beskriver fremgangsmåten for å produsere og teste infectivity, det ikke detalj hvordan måle inkorporering av viral konvolutten glykoproteiner pseudotyped partikler. En metode er å utføre western blot analyser på konsentrert løsninger av partikler, som beskrevet tidligere50,51 for MERS-CoV S innlemmelse. I disse analyser, er S konvolutt glykoprotein på MERS-CoV analysert sammen med kapsid (p30) protein av MLV, som tillater oss å normalisere inkorporering av S protein partikler. Andre eksempler på slike analyser analysere viral konvolutten glykoprotein inkorporering pseudovirions er utført for SARS-CoV S innlemmelse i en HIV-1 lentiviral pseudovirion system32 , Ebola glykoprotein (GP) i en annen MLV pseudotyped partikkel system17, og influensa hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) i VSV pseudovirions38. En ny utvikling i karakteriserer pseudotyped partikkel produksjon er bruken av nyskapende bildeenheter som Nanosight: gjør det oss å visualisere, kvantifisere og størrelse virus partikler50direkte. Enheten gir detaljert informasjon om generelle partikkel produksjon; Det er imidlertid viktig å huske på at det ikke gir informasjon på konvolutten glykoprotein innlemmelse. En fremtidig retning for bruk av disse allsidige pseudovirion partiklene er å analysere individuelle viral fusion hendelser ved hjelp av én partikkel sporing, microfluidics og total intern refleksjon fluorescens mikroskopi60,61 ,62. Disse ble brukt influensavirus og feline coronavirus partikler som influensa HA – og NA-pseudotyped VSV-baserte pseudovirions63. Distribusjon av slike teknikker brukes coronavirus S-pseudotyped MLV-baserte partikler under utvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke alle medlemmer av Whittaker og Daniel laboratorier for nyttige kommentarer. Forskningsmidler ble levert av NIH tilskudd R21 AI111085 og R01 AI135270. T.T. anerkjenner støtte fra Presidential Life Science fellesskap i Cornell University og National Science Foundation Graduate forskning Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. L.N. anerkjenner støtte fra en Samuel C. Fleming familie Graduate Fellowship og National Science Foundation Graduate forskning Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Dette arbeidet er også støttet av National Science Foundation 1504846 (å SD og G.R.W.).
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | Clone 17 cells are highly competent for transfection. |
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells | ATCC | CRL-1586 | |
Human hepatic Huh-7 cells | Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | JCRB0403 | |
Inverted light microscope with 10 × objective | Nikon | TS100 | |
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate | Corning Mediatech | 10-017-CV | |
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 1614071 | |
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES) | Corning Mediatech | 25-060-Cl | |
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution | Corning Mediatech | 30-002-Cl | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning Mediatech | 21-030-CV | |
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution | Corning Mediatech | 25-053-Cl | |
Cell counting slides with grids | Kova | 87144 | |
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 11668-027 | |
0.45 µm pore-size sterile filter | Pall | 4184 | |
10 mL syringes | BD | 309604 | |
5 × luciferase assay lysis buffer | Promega | E1531 | |
Luciferin, substrate for luciferase assay | Promega | E1501 | |
Sterile water | VWR | E476-1L | |
GloMax 20/20 luminometer | Promega | 2030-100 |