Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare particelle pseudotipizzate in un ambiente di BSL-2 che incorporano la proteina spike della sindrome respiratoria Medio Oriente di virus ad alta patogenicità e coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave. Queste particelle pseudotipizzate contengono un gene del reporter di luciferase che permette la quantificazione dell'entrata del virus in cellule bersaglio.
Abstract
Il protocollo mira a generare la proteina di fusione di coronavirus (CoV) spike (S) linea cellulare pseudotipizzate particelle con una leucemia murina virus (MLV) core e luciferasi reporter, utilizzando una procedura semplice transfezione alla HEK-293T ampiamente disponibili. Una volta formata e rilasciati dalle cellule di produttore, questi pseudovirions incorporano un gene del reporter di luciferase. Poiché contengono solo il coronavirus eterologo spike proteine sulla loro superficie, le particelle si comportano come le loro controparti di coronavirus nativo per gradini di accesso. Come tali, essi sono i surrogati eccellenti dei virions nativo per studiare l'entrata virale nelle cellule ospiti. Al momento di entrare con successo e infezione in cellule bersaglio, il reporter di luciferase ottiene integrato nel genoma della cellula ospite e si esprime. Utilizzando un'analisi di luciferase semplice, cellule trasdotte possono essere facilmente quantificate. Un importante vantaggio della procedura è che essa può essere eseguita in biosicurezza livello 2 (BSL-2) strutture anziché BSL-3 servizi necessari per il lavoro con patogenicità coronavirus come Medio Oriente sindrome respiratoria coronavirus (MERS-CoV) e coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV). Un altro vantaggio deriva dalla sua versatilità come può essere applicato a proteine dell'involucro appartenendo a tutte le tre classi di proteine di fusione virale, ad esempio la classe emoagglutinina (HA) di riossidazione ed Ebola virus glicoproteina (GP), il virus della foresta di Semliki II classe E1 proteina, o la glicoproteina di virus G stomatite vescicolare di classe III. Una limitazione della metodologia è che esso può solo ricapitolare gradini di accesso di virus mediate dalla proteina busta indagata. Per lo studio delle altre fasi del ciclo di vita virale, sono necessari altri metodi. Esempi di queste particelle pseudotipo possono essere utilizzate in molte applicazioni indagine di suscettibilità delle cellule dell'ospite e trofismo e testare gli effetti di inibitori dell'entrata di virus per sezionare le vie di entrata virale utilizzate.
Introduction
Immissione di cella ospitante costituisce i passi iniziali del ciclo di vita infettivo virale. Per virus capsulati, questo coinvolge il legame di un recettore della cellula ospite singolo o parecchi ricevitori, seguiti da fusione delle membrane virali e cellulari. Queste funzioni essenziali sono svolte da busta virale glicoproteine1,2. La glicoproteina busta coronavirus si chiama la proteina spike (S) ed è un membro della classe ho virale fusione proteine2,3,4,5,6. Studiando le glicoproteine busta virale è fondamentale per comprendere molte importanti caratteristiche di un determinato virus, come: l'inizio del ciclo di vita, suo ospite e trofismo cellulare, trasmissione interspecie, patogenesi virale, nonché host cell voce vie. Le particelle virali pseudotipizzate, denominate anche pseudovirions, sono potenti strumenti che ci permettono di studiare facilmente la funzione delle proteine di fusione virale. Pseudotipizzato particelle o pseudovirions sono virioni chimerici costituiti da un nucleo di surrogati virale con una proteina eterologa busta virale alla loro superficie. Scopo principale del protocollo è quello di mostrare come ottenere coronavirus spike pseudotipizzate particelle che si basano su un nucleo di virus (MLV) leucemia murina e contengono un gene del reporter di luciferase. Come esempi, il metodo di produrre particelle pseudotipizzate con le proteine di spike della sindrome respiratoria acuta severa ad alta patogenicità (SARS) e Medio Oriente (MERS) la sindrome respiratoria coronavirus sono presentati. Il protocollo descrive la procedura di trasfezione coinvolta, come destinazione suscettibili di infettare le cellule e la quantificazione di infettività di analisi di luciferase.
Poiché la procedura di entrata della pseudovirions è regolata da coronavirus S alla loro superficie, entrano le cellule in un modo simile a controparti native. Come tali, essi sono eccellenti surrogati di saggi funzionali infettività. Pseudotipizzato particelle sono solitamente derivate da virus modello parentale come retrovirus (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 e il virus di immunodeficenza umana lentivirus — HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) o rhabdovirus (virus della stomatite vescicolare — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). quando utilizzato in pseudotipizzazione, genomi dei virus parentale vengono modificati per rimuovere geni essenziali, rendendoli difettoso per compiere un ciclo di replica completa. Questa caratteristica permette loro di essere utilizzato in servizi di livello intermedio biosafety (BSL-2) ed è un importante vantaggio rispetto all'utilizzo di virus altamente patogeni nativo che richiedono più alte attrezzature biosafety (BSL-3, BSL-4, che non sono così facilmente disponibili) quando condurre studi di entrata del virus. Qui, le proteine di S di rischio gruppo 3 agenti patogeni SARS-CoV e MERS-CoV sono usati come esempi di proteine dell'involucro virale essere incorporate in MLV pseudotipizzate particelle, generando S SARS-CoV e MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp e MERS-Spp, rispettivamente). Questi pseudovirions sono stati utilizzati con successo in studi concentrandosi su eventi di immissione di questi virus48,49,50,51. Un altro vantaggio è che la tecnica qui descritta non è limitata alle proteine del coronavirus S pseudotipizzazione: è molto flessibile e può essere utilizzato per incorporare i rappresentanti di tutte le tre classi di proteine di fusione virale. Gli esempi includono hemagglutinin di riossidazione (Ah, classe I)52, glicoproteina del virus di Ebola (GP classe I), proteina E1 del alphavirus Semliki Forest virus (SFV, classe II) e della glicoproteina VSV (G, classe III)53. Inoltre, più di un tipo di glicoproteina virale può essere co-incorporato in una particella pseudotipizzata, come nel caso dell'influenza ettari - e NA - particelle pseudotipizzato51.
Basato sul lavoro eseguito da Bartosch et al.20, questo protocollo descrive la generazione di MLV pseudotipizzate particelle con una strategia di tre-plasmide co-transfezione utilizzando ampiamente disponibili e altamente competenti a transfezione HEK-293T linea cellulare 54. il primo plasmide codifica il MLV nucleo geni gag e pol ma manca il gene env busta MLV. Il secondo plasmide è un vettore di trasferimento che codifica un gene del reporter di luciferase di firefly, un segnale di imballaggio Ψ-RNA di MLV, insieme a 5'- e 3'-che fiancheggiano le regioni di ripetizione terminale lunga (litro) di MLV. Il terzo plasmide codifica la proteina di fusione di interesse, in questo caso sia la proteina S SARS-CoV o MERS-CoV S. Al momento di co-trasfezione dei tre plasmidi utilizzando un reagente di transfezione, virali RNA e proteine ottenere espresse all'interno di cellule trasfettate consentendo la generazione di particelle pseudotipizzate. Poiché MLV è usato come spina dorsale pseudovirion, in questo caso alla membrana del plasma: il RNAs contenente il reporter gene di luciferase e segnale di imballaggio ottiene incapsulato in particelle nascente che incorporano anche espressi in membrana plasmatica coronavirus spike proteine. Le particelle che bud fuori dalle cellule contengono la proteina di coronavirus S alla loro superficie e sono raccolti per uso nelle analisi di infettività. Perché le particelle pseudotipizzate porto la proteina di coronavirus S e non la proteina busta MLV, quando utilizzati per infettare le cellule, si comportano come le loro controparti di coronavirus nativo per gradini di accesso. il RNA virale contenente il reporter di luciferase e litri di accompagnamento viene quindi rilasciato all'interno della cellula e le attività della polimerasi retrovirali attivare la trascrizione inversa in DNA ed integrazione nel genoma della cellula ospite. Quantificazione di infettività delle particelle virali pseudotipizzate in cellule infettate viene quindi eseguita con un'analisi di attività di luciferase semplice. Poiché la sequenza di DNA che ottiene integrata nel genoma della cellula ospite contiene solo il gene della luciferasi e nessuno dei geni di proteina-codifica, MLV o coronavirus, sono intrinsecamente più sicuri da usare rispetto a replica-competente virus nativo.
Oltre ad essere più sicuri surrogati e altamente adattabile per consentire l'incorporazione di vari tipi di glicoproteine busta, le particelle pseudotipizzate descritte qui sono anche estremamente versatile e possono essere usate per studiare molti aspetti della voce di virus. Questo include ma non limitato a: test di suscettibilità delle cellule dell'ospite all'infezione del virus, analizzando le vie di entrata cellulare utilizza un virus, studiando gli effetti di inibitori farmacologici e proiezioni di droga, lo svolgimento di anticorpo di neutralizzazione saggi, che caratterizza la voce di cella di host di virus capsulati che non può essere coltivato e generazione di vettori virali per la consegna del gene, stabile l'espressione cellulare di geni di interesse, o di silenziamento genico.
Protocol
1. semina per la produzione di particelle pseudotipizzato cellulare
Nota: Eseguire questo passaggio nella cappa di biosicurezza.
- Tecniche di coltura cellulare standard, per ottenere una boccetta di2 confluenti 75 cm 80 – 90% delle cellule HEK 293T/17 attraversate in Dulbecco completa Medium dell'Aquila per volta (DMEM-C) contenente 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS), 10 mM 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES), 100 UI/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Preparare DMEM-T supporto per transfezioni (la sua composizione è la stessa come DMEM-C ma senza antibiotici).
- Lavare le cellule con 10 mL di pre-riscaldata (37 ° C) Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) due volte.
Nota: Gestire le cellule HEK293T/17 con cura come si staccano facilmente. - Aspirare il supernatante e staccare le cellule con 1 mL di soluzione di tripsina 0.25% pre-riscaldato a 37 ° C. Collocare la beuta di cellule a 37 ° C, 5% CO2 incubatore per 3−5 min o fino a quando le cellule iniziano a staccare.
Nota: Evitare incubando le cellule con tripsina per più di 5 min come questo in genere conduce all'aggregazione delle cellule. - Disattivare tripsina aggiungendo 4 mL di cellule medie e totali di DMEM-C utilizzando una cella conteggio diapositiva e microscopio ottico.
Nota: Per evitare di dover contare troppe cellule, un passo ulteriore diluizione può essere richiesto in anticipo. Ricordate di fattore di questa diluizione quando si calcola la densità di cella effettivo delle cellule tripsinizzate. - Diluire le cellule a 5 x 105 cellule/mL con DMEM-C.
- Piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti con 2 mL di soluzione di cellule per pozzetto di semi e delicatamente spostare avanti e indietro la piastra e lato a altro per distribuire uniformemente le cellule, evitando movimenti circolari.
Nota: Si tratta di un passo fondamentale. Cellule uniformemente distribuite farà in modo che le cellule non ciuffo al centro di wells. A sua volta, in tal modo l'efficienza di trasfezione buona e particella pseudotipizzata produzione. - Incubare la piastra durante la notte (16 – 18 h) in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare.
2. tre-plasmide co-trasfezione
Nota: Eseguire questo passaggio nella cappa di biosicurezza.
- Osservare le cellule sotto un microscopio ottico invertito per verificare la morfologia delle cellule e la densità.
Nota: Idealmente, la densità delle cellule dovrebbe essere nel range di confluenza del 40 – 60%. È fondamentale che le cellule non sono né troppo confluenti (80−90% confluenti) né troppo scarsamente distribuiti (20−30% confluenti) in ciascun pozzetto. Una densità di cellule di 40−60% confluency garantirà produzione di particelle pseudotipizzato buona. -
Plasmidi mix
- Calcolare il mix di plasmide per ogni glicoproteina busta seguendo le quantità per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti indicati in tabella 1. Moltiplicare la quantità se trasfezione diversi pozzi e includono un pozzo supplementare per evitare l'esaurimento del mix.
Nota: Insieme alla SARS-CoV S e MERS-CoV S codifica plasmidi, includono controllo di vettore vuoto per la generazione di particelle di controllo negativo che mancano glicoproteine virali busta (particelle Δenv) insieme ad una glicoproteina di controllo positivo come vescicolare stomatite virus (VSV) G della glicoproteina che è notoriamente robustamente infettare una gamma molto ampia di cellule (VSV-Gpp). Plasmidi sono disponibili su richiesta. - Mescolare volumi calcolati di plasmidi e terreno di coltura cellulare riduttore del siero (Vedi Tabella materiali) in un tubo del microcentrifuge.
- Calcolare il mix di plasmide per ogni glicoproteina busta seguendo le quantità per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti indicati in tabella 1. Moltiplicare la quantità se trasfezione diversi pozzi e includono un pozzo supplementare per evitare l'esaurimento del mix.
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Reagente di transfezione basata sui lipidi mescolare (Vedi Tabella materiali)
- Calcolare i volumi per il mix di reagente di transfezione dai quantitativi indicati nella tabella 2 per un pozzetto (1:3 rapporto di transfezione, moltiplicare quantità se necessario). Sono pozzi supplementare per evitare l'esaurimento del mix di reagente di transfezione.
- Mescolare volumi calcolati di reagente di transfezione basata sui lipidi (3 µ l per pozzetto) e terreno di coltura cellulare di riduttore del siero (47 µ l per pozzetto) in un tubo del microcentrifuge, rendendo sicuri di aggiungere il reagente di transfezione in medium della coltura cellulare riduttore del siero e non il contrario nei dintorni.
- Incubare per entrambe le miscele (per un pozzetto: 50 µ l di plasmidi mescolare e 50 µ l di reagente di transfezione basata sui lipidi mescolare) separatamente per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere il contenuto della miscela reagente di transfezione per il mix di plasmidi con un rapporto 1:1 (per 1 ben: 50 µ l di ogni mix)
- Eseguire approfondita su-giù pipettaggio della miscela risultante.
- Incubare il mix per almeno 20 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il medium esaurito delle cellule.
- Aggiungere delicatamente 1 mL di mezzo di coltura cellulare riduttore del siero pre-riscaldata (37 ° C) per pozzetto.
- Aggiungere goccia a goccia 100 µ l di miscela di transfezione in ciascun pozzetto.
Nota: Prestare attenzione quando si aggiunge il mix di transfezione pozzetti di HEK 293T come essi si staccano facilmente. - Incubare le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare per 4-6 h.
- Aggiungere 1 mL per pozzetto di mezzo di DMEM-T pre-riscaldata (37 ° C), che non contiene antibiotici
Nota: Si tratta di un passo fondamentale. Reagenti di transfezione aumentano la permeabilità delle cellule e aumentano la sensibilità agli antibiotici. Per garantire l'efficienza di trasfezione buona e particella pseudotipizzato produzione, è importante evitare l'uso di mezzo di coltura cellulare contenente antibiotici - Incubare le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare per 48 h.
3. pseudotipizzato particelle collezione
Nota: Eseguire questo passaggio nella cappa di biosicurezza.
- Osservare le cellule sotto il microscopio invertito chiaro per verificare la morfologia delle cellule e la condizione generale. Controllare anche il colore del mezzo che dovrebbe essere la luce rosa/leggermente arancione.
Nota: Si tratta di un passo importante. Se c'è troppa morte cellulare connesso con la transfezione o il colore medio trasformato arancio/giallo (pH acido), questo sarà in genere associato con rendimenti inferiori in particelle infettive pseudotipizzate - Trasferire i surnatanti delle cellule transfettate provette centrifuga a fondo conico da 50 mL.
- Centrifugare le provette a 290 x g per 7 min rimuovere i detriti cellulari.
- Filtrare i surnatanti chiarificati attraverso un filtro sterile da 0,45 µm dei pori di dimensioni medie.
- Rendere le aliquote di piccolo volume (ad es.., 500 µ l o 1 mL) di soluzione di virus pseudotipizzato in cryovials.
- Conservare a-80 ° C.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Pseudotipizzato particelle sono stabili a-80 ° C per molti mesi, ma una volta scongelato, evitare ri-congelamento loro come perdono infettività
4. pseudotipizzato particella infezione delle cellule suscettibili
Nota: Eseguire questo passaggio nella cappa di biosicurezza.
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Cella semina delle cellule suscettibili in piastra a 24 pozzetti
- Ottenere da cella standard cultura tecniche 80−90% confluenti 75cm2 boccetta di cellule suscettibili: cellule Vero-E6 per SARS-CoV pseudotipizzate particelle (SARS-Spp) e cellule di Huh-7 per MERS-CoV S pseudotipizzate particelle (MERS-Spp).
Nota: Per confermare che se le particelle pseudotipizzate che sono state prodotte sono contagiose, è importante scegliere con cura una linea appropriata cellulari sensibili per saggi di infettività di pseudovirion. Utilizzando cellule scarsamente permissive porterà a bassa infettività. - Lavare le cellule due volte con 10 mL di pre-riscaldata (37 ° C) DPBS.
- Aspirare il supernatante e staccare le cellule con 1 mL di soluzione di tripsina 0.25% pre-riscaldato a 37 ° C. Collocare la beuta di cellule a 37 ° C, 5% CO2 incubatore per 3−5 min o fino a quando le cellule iniziano a staccare.
Nota: Evitare incubando le cellule con tripsina per più di 5 minuti come questo in genere conduce all'aggregazione delle cellule. Eh-7 cellule sono particolarmente sensibili a questo effetto. - Disattivare tripsina aggiungendo DMEM-C medie e conteggio celle utilizzando una cella conteggio diapositiva e microscopio ottico.
- Diluire le cellule a 5 x 105 cellule/mL con DMEM-C.
- Pozzi di seme di un 24-pozzo piastra con 0,5 mL di soluzione di cellule per pozzetto e delicatamente spostare avanti e indietro la piastra e lato a altro per distribuire uniformemente le cellule, evitando movimenti circolari
Nota: Si tratta di un passo fondamentale. Cellule uniformemente distribuite farà in modo che le cellule non ciuffo al centro di wells. A sua volta, ciò garantirà buona infettività saggi. Per ogni particella pseudotipizzata (SARS-Spp, MERS-Spp) e condizione, preparare tre pozzi per tre repliche sperimentali. Includono i pozzi per i non infetti (N.I.), particelle Δenv vettore vuoto e particelle di controllo positivo come VSV-Gpp - Incubare la piastra durante la notte (16−18 h) in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare
- Ottenere da cella standard cultura tecniche 80−90% confluenti 75cm2 boccetta di cellule suscettibili: cellule Vero-E6 per SARS-CoV pseudotipizzate particelle (SARS-Spp) e cellule di Huh-7 per MERS-CoV S pseudotipizzate particelle (MERS-Spp).
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Infezione di pseudotipizzato particella
- Osservare le cellule sotto il microscopio chiaro e confermare visivamente che c'è un tappeto confluente di cellule.
- Portare cryovials del virus pseudotipizzato scongelare su ghiaccio.
- Cellule di lavare tre volte con 0,5 mL pre-riscaldati (37 ° C) DPBS
Nota: Si tratta di un passo fondamentale. Cellule che non sono adeguatamente sciacquate prima dell'infezione in genere portare a letture di scarsa infettività - Aspirare i surnatanti delle cellule.
- Inoculare cellule con 200 µ l di soluzione di particelle pseudotipizzato scongelati.
- Incubare le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare per 1 − 2 h.
- Aggiungere 300 µ l di pre-riscaldata (37 ° C) medie DMEM-C.
- Incubare le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare per 72 h.
5. infettività quantificazione di Luciferase Assay della lettura
Nota: La procedura iniziale nella cappa di biosicurezza.
- Substrato di luciferina disgelo (conservati a-80 ° C) e 5 x luciferase assay buffer di lisi (conservati a-20 ° C) fino a quando raggiungano la temperatura ambiente.
- Diluire il tampone di lisi del saggio di luciferasi a 1x con acqua sterile.
- Aspirare i surnatanti delle cellule infettate con particelle pseudotipizzate.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi di saggio di luciferasi x 1 in ciascun pozzetto.
- Collocare la piastra su un rocker e incubare per 15 min con dondolo a temperatura ambiente (da questo punto in poi che la piastra può essere gestita di fuori di una cappa di biosicurezza).
- Preparare per microcentrifuga per ciascun pozzetto con l'aggiunta di 20 µ l di substrato luciferina in ogni provetta.
- Accendere il luminometro.
- Eseguire la misurazione dell'attività di luciferase uno bene in un momento di trasferire 10 µ l di lisato in una provetta contenente 20 µ l di substrato luciferina.
- Scorri il tubo delicatamente per mescolare il contenuto, ma evitare spostando il liquido sulle pareti del tubo.
- Collocare la provetta nel dispositivo e chiudere il coperchio.
- Misurare il valore di luminescenza del tubo utilizzando il luminometro.
- Registrazione di misura dell'unità luce relativa.
- Ripetere i passaggi 5.8 – 5,12 vengono analizzati tutti i pozzetti.
Nota: Con l'attrezzatura appropriata come una piastra di lettura luminometro, questo processo può essere eseguito automaticamente. Il dosaggio dovrà essere scalato al formato piastra (es. formato della piastra a 96 pozzetti di, ).
6. analisi dei dati
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Calcolo e la stampa di medie e deviazioni standard delle unità relativa luciferasi
- Utilizzare un grafico tracciato software per calcolare la misura del saggio di luciferasi medie e deviazioni standard del biologico e sperimentale replica.
- Tracciare i dati come grafico a barre con deviazioni standard.
Nota: Durante l'esecuzione di analisi statistiche sui dati, assicurarsi di includere almeno tre repliche biologiche in insiemi di dati.
Representative Results
Risultati rappresentativi di saggi di infettività di SARS-CoV S e MERS-CoV S pseudotipizzate particelle sono mostrate nella Figura 1. Come previsto, per entrambi la figura 1A e 1B, il G VSV pseudotipizzato positivo controllo particelle (VSV-Gpp) ha dato molto alta infettività medio in 106 a 107 unità di luciferasi relativa (RLU) vanno rispettivamente. Per SARS-CoV S infezione pseudotipizzato particelle (Figura 1A) delle cellule suscettibili di Vero-E6, un forte infettività medio è stata misurata a circa 9,8 x 104 RLU. Questo valore è quasi 3 ordini di grandezza superiori ai valori misurati per il controllo non infetto (1.1 x 102 RLU), o le particelle Δenv (1,5 x 102 RLU), che non porto qualsiasi glicoproteine dell'envelope virale alla loro superficie. Allo stesso modo, per MERS-CoV S infezione pseudotipizzato particelle (Figura 1B) delle cellule Huh-7, un'alta infettività medio è stata misurata a circa 1.0 x 106 RLU. Si tratta di quasi 4 ordini di grandezza superiori ai valori misurati per il controllo non infetto (0,8 x 102 RLU), o le particelle Δenv (2.0 x 102 RLU). Un'analisi di ulteriori infettività è stata eseguita in cui la SARS-Spp e MERS-Spp erano in serie diluito e usato per infettare cellule Vero-E6 (Figura 2A). Questo test conferma che l'attività luciferasica misurato è dipendente dalla concentrazione delle particelle utilizzato per infettare le cellule. Per confermare il ruolo dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) e l'inibitore della dipeptidil peptidasi 4 (DPP4), i recettori della SARS-CoV e MERS-CoV, rispettivamente, nella mediazione allegato e l'ingresso delle particelle pseudotipizzate, abbiamo usato cellule HEK 293T mal-permissive e ad esprimere ACE2 o DPP4 trasfettate (Figura 2B). Le cellule trasfettate furono utilizzate per un'analisi di infettività. Questa analisi dimostra che al momento la sovraespressione di ACE2 e DPP4, c'è un aumento di ~ 4-registro e registro di ~ 2 per SARS-Spp e MERS-Spp infettività, rispettivamente, confermando che l'utilizzo del ricevitore di pseudovirions è simile a quella dei virus nativo.
Gli esempi riportati qui dimostrano l'importanza di tra cui negativo (non infetti, Δenv particelle) così come le condizioni di controllo positivo (VSV-Gpp) quando si producono particelle pseudotipizzate. Infatti, le particelle di controllo positivo VSV-Gpp consentono di valutare se un determinato lotto di particelle pseudotipizzate è stato completato nel cedere pseudovirions funzionale e infettiva. Risultati attesi di infezione tipica da particelle di VSV-Gpp in cellule di mammifero più linee sono nella gamma 106− 107 RLU. Problemi con cellule di HEK 293T/17 produttore (numero di passaggio alto, problemi con la densità delle cellule) o efficienza di trasfezione poveri possa avere un impatto complessivo delle particelle pseudotipizzato produzione e infettività. Inoltre, le condizioni di controllo negativo anche sono importanti in quanto ci permettono di valutare le linee di base delle misurazioni di RLU in una linea cellulare particolare (condizione non infetto) e aspecifici internalizzazione di particelle (Δenv infezione) che non è mediato da una proteina envelope virale. Idealmente, per un determinato tipo di particella pseudotipizzato con una proteina envelope virale di interesse, si consiglia di ottenere i valori che sono alcuni ordini di grandezza superiori ai valori di controllo negativo, come mostrato in Figura 1A, B. Tuttavia, se per un tipo di dato delle cellule un'infezione da virus pseudotipizzato dà molto poco infettività (cioè, chiudono a controlli negativi così come in Figura 2B in condizioni di non-transfettate N.T.) non significa necessariamente che il pseudotipizzato produzione delle particelle era difettoso. Potrebbe benissimo essere che la linea cellulare particolare utilizzata non è o scarsamente permissive all'infezione. Si raccomanda di verificare se un tipo dato delle cellule è previsto per essere suscettibile dell'infezione dal virus dell'indagato. Trasfettando cellule scarsamente permissive con plasmid(s) che esprimono che il recettore virale può consentire più efficiente entrata virale e l'infezione si verifica, come illustrato nella Figura 2B, dove al momento di transfezione dei recettori ACE2 e DPP4 nella destinazione HEK 293T cellule, c'è un ~ 4- e ~ 2-registro aumentare infettività, rispettivamente.
| Plasmide/reagente | Quantità |
| pCMV-MLVgagpol MLV gag e pol codifica plasmide | 300 ng |
| pTG-Luc transfer vettoriale con reporter luciferase | 400 ng |
| vettore pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S o vuoto | 300 ng |
| Mezzo di coltura cellulare riduttore del siero | A 50 µ l |
Tabella 1: quantitativi di plasmidi e riduttori del siero delle cellule di coltura necessaria a transfect un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti delle cellule HEK 293T/17 per la produzione di particelle pseudotipizzato. Dalla concentrazione delle preparazioni del plasmide, calcolare il volume richiesto per raggiungere la quantità necessaria di DNA plasmidico. Se più di un pozzo è trasfettato con i plasmidi stessi, moltiplicare volumi di numero di pozzi a transfect necessari e includere un pozzo supplementare nei calcoli per evitare l'esaurimento del mix nei passaggi successivi. La quantità totale di DNA essere transfected è di 1 µ g/pozzetto. Plasmidi sono disponibili su richiesta agli autori.
| Reagente | Quantità |
| Reagente di transfezione | 3 Μ l |
| Mezzo di coltura cellulare riduttore del siero | 47 Μ l |
Tabella 2: quantità di reagente di transfezione e riduttori del siero delle cellule di coltura necessaria a transfect un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti delle cellule HEK 293T/17 per la produzione di particelle pseudotipizzato. Moltiplicare i volumi dal numero richiesto di pozzi a transfect e includere pozzi supplementare nei calcoli per evitare l'esaurimento del mix nei passaggi successivi. Il reagente di transfezione: rapporto di DNA del plasmide usato è di 3:1.
Figura 1 : Saggi di infettività delle particelle Coronavirus S-pseudotipizzato nelle cellule ospite suscettibile utilizzando un gene del reporter leucemia murina virus (MLV) spina dorsale e luciferasi. (A) analisi di infettività delle particelle pseudotipizzato S SARS-CoV in cellule Vero-E6. (B) analisi di infettività pseudotipizzato particella MERS-CoV S in cellule Huh-7. Per entrambi (A) e (B), dati tracciati corrispondano alle unità medio relativo luciferasi da tre esperimenti indipendenti, con barre di errore corrispondenti alla deviazione standard (s.d.). I dati rappresentati in scala10 log sull'asse y. N.I.: controllo non infetti; Δenv: infezione con particelle pseudotipizzate mancanza di glicoproteine virali busta e VSV-Gpp: infezione con particelle pseudotipizzate cuscinetto controllo positivo VSV G glicoproteina busta. Altre abbreviazione utilizzata, SARS-Spp: infezione da SARS-CoV S pseudotipizzate particelle, MERS-Spp: infezione con MERS-CoV S pseudotipizzate particelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Dipendenza di concentrazione di CoV S-pseudovirion infettività e ruolo dei recettori ACE2 e DPP4 nella voce SARS-Spp e MERS-Spp. (A)-dipendenza di concentrazione di infettività SARS-Spp e MERS-Spp, misurata dall'analisi di attività di luciferase. Pseudovirions in serie sono stati diluiti e utilizzati per infettare le cellule Vero-E6. Infettività (B) analisi di SARS-Spp e MERS-Spp nelle celle di destinazione poco permissive HEK 293T trasfettata per espresso ACE2 e recettori DPP4, rispettivamente. I dati rappresentati in scala10 log sull'asse y come in Figura 1 da esperimenti di duplicati, con barre di errore corrispondenti alla deviazione standard (s.d.). N.T.: le cellule di controllo non trasfettate HEK 293T; Ace2: angiotensina enzima 2 (SARS-CoV receptor) e DPP4: inibitore della dipeptidil peptidasi 4 (MERS-CoV receptor). Altre abbreviazioni utilizzate sono gli stessi come in Figura 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per produrre in modo efficiente pseudotipizzate particelle della proteina S di rischio gruppo 3 coronavirus, SARS-CoV e MERS-CoV, in un ambiente di BSL-2 del cuscinetto. Queste particelle, che incorporano un gene del reporter di luciferase, permettono di quantificare facilmente coronavirus eventi voce S-mediata da un relativamente semplice luciferase assay48,49,50,51. In dosaggi di infettività utilizzando cellule permissive, confermiamo che l'attività luciferasica misurato è dipendente dalla concentrazione di particelle. Inoltre, ACE2 e DPP4 transfezione recettore consente più efficiente immissione in linee di cellule scarsamente permissive, quali le cellule HEK 293T. Il metodo è altamente adattabile ad altre glicoproteine dell'envelope virale ed è stato usato estesamente48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, spesso per integrare altri dosaggi come le analisi biochimiche o infezioni da virus nativo.
Il protocollo che descriviamo qui si basa il retrovirus MLV che incorpora un reporter di luciferase. Tuttavia, è importante sottolineare che c'è una vasta gamma di altri sistemi di pseudotipizzazione che sono stati sviluppati con successo per imballaggio coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 e altri envelope virale glicoproteine10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. alcuni di questi altri sistemi si basano sul comunemente usato MLV retrovirali core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, o basata su ampiamente usato lentivirale HIV-1 pseudotipizzazione sistema utilizzando diverse strategie23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, o con il virus della stomatite vescicolare rhabdovirus (VSV) come nucleo, che permette di incorporare un'ampia varietà delle glicoproteine della busta e ancora con varie strategie impiegate37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Inoltre, altri giornalisti quali proteine fluorescenti come GFP11,13 e RFP36o gli enzimi diversi da luciferasi come β-galattosidasi16,17 e secreto fosfatasi alcalina (SEAP)42 sono stati impiegati con successo per le misurazioni. Inoltre, nell'analisi presentata in questo protocollo, una trasfezione transiente è stata utilizzata per esprimere le proteine e geni MLV e CoV S. Tuttavia, ci sono altre strategie per l'espressione, come ad esempio la generazione di linee cellulari stabili per la produzione di virus pseudotipizzato7,14. Come ciascuno di questi sistemi presentano vantaggi e svantaggi, è importante considerare i seguenti parametri importanti al momento di decidere quale sistema di pseudotipizzazione meglio si adatta alle esigenze di un investigatore: pseudovirion core (MLV, HIV-1, VSV o altri), come selettiva un nucleo di pseudotipizzazione particolare è in incorporando una glicoproteina envelope virale specifico, reporter per lettura di dosaggio (GFP, luciferasi, SEAP o altro) e la strategia di transfezione (numero di plasmidi coinvolti nella co-transfezione, transitoria transfezione o generazione di linee cellulari stabili).
Ci sono un numero di passaggi critici nel metodo che sono importanti da sottolineare. Densità delle cellule, in particolare della linea cellulare HEK 293T/17 produttore di è un fattore critico nel garantire il successo di transfezione. Una densità di cella nell'intervallo di confluency di 40 – 60% è stata trovata per essere ottimale. Superiore densità determinano in genere l'efficienza di trasfezione basso e la produzione di particelle basso. Inoltre, è importante tenere a mente che le cellule HEK 293T/17 sono meno aderenti di altre linee cellulari. Cura dovrebbe essere esercitata quando gestirle per evitare staccandole inutilmente. È possibile trattare superfici in plastica di cultura delle cellule con poli-D-lisina per migliorare l'aderenza. Inoltre, più alto passaggio delle cellule provoca spesso tassi di transfezione poveri. Dopo l'aggiunta del reagente di transfezione delle cellule HEK 293T/17, è anche importante ricordare che aumenta la permeabilità delle cellule. Ecco perché a questo punto è meglio evitare di usare antibiotici contenenti medi come possono aumentare la citotossicità. Prima di raccogliere le particelle pseudotipizzate, controllare il colore dei surnatanti di cellule trasfettati HEK 293T/17. In genere, dopo 48 h di transfezione, il colore del terreno di coltura cellulare prende una sfumatura di rosa-arancio. Colore giallo medio solitamente si traduce in rendimenti di particelle pseudotipizzato poveri e spesso è il risultato di problemi con semina densità o passaggio alto numero cellulare.
In questo protocollo, particella pseudotipizzato produzione viene eseguita in un formato di piastra a 6 pozzetti. Per aumentare il volume delle particelle prodotte, diversi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti possono essere transfected con lo stesso mix di plasmidi e i surnatanti possono essere raggruppati. La piscina può quindi essere chiarito, filtrata e aliquotati. In alternativa, a scala di produzione su, altri tipi di navi (ad es., 25, o boccette di 75 cm2 ) possono essere utilizzato. In questo caso, condizioni di transfezione dovrebbero essere scalate di conseguenza. In questo protocollo, il dosaggio di infettività viene eseguito utilizzando un formato di piastra a 24 pozzetti e un luminometro che solo permette misure uno tubo alla volta. Per le proiezioni a resa elevata, sono possibili, come formato di piastra a 96 pozzetti e un luminometro lettore di piastra anche altri formati. Volumi e reagenti per l'analisi di luciferase devono essere adattati di conseguenza. Deposito di particelle pseudotipizzate in cryovials a-80 ° C mantiene la loro stabilità per diversi mesi senza diminuzione notevole di infettività. Non è consigliabile sottoporre a cicli di gelo-disgelo come questo diminuirà la loro infettività nel corso del tempo. Pertanto, si consiglia di memorizzarli in piccole aliquote ad esempio 0,5 – 1 mL e li scongelare prima di un'infezione.
Il metodo presentato qui ha diversi limiti. Importante è il fatto che particelle pseudotipizzate ricapitolano gli eventi entrata solo virale. Per analizzare gli altri passaggi del ciclo di vita infettive, altri saggi sono necessari. Inoltre, come MLV particelle gemma alla membrana del plasma, è importante tenere a mente che la glicoproteina busta ha bisogno in fase di studio per anche il traffico verso la membrana plasmatica per incorporazione in pseudovirions durante la produzione. Come tale, è importante sapere dove nella cella una glicoproteina virale di busta particolare è espresso in condizioni di transfezione, come ad esempio visualizzando la localizzazione subcellulare con un'analisi di immunofluorescenza, e/o controllando per segnali di conservazione all'interno la proteina. Inoltre, mentre il protocollo descrive la procedura per produrre e verificare infettività, non dettaglia come misurare incorporazione di glicoproteine virali busta in particelle pseudotipizzate. Un metodo consiste nell'eseguire analisi western blot su soluzioni concentrate di particelle, come descritto in precedenza50,51 per l'incorporazione di MERS-CoV S. In queste analisi, la glicoproteina di busta di S di MERS-CoV è sondata insieme con la proteina del capside (p30) di MLV, che ci permettono di normalizzare l'incorporazione di particelle della proteina S. Altri esempi di tali dosaggi analisi di incorporazione della glicoproteina envelope virale pseudovirions sono stati effettuati per l'incorporazione di SARS-CoV S in un HIV-1 pseudovirion lentivirali sistema32 , Ebola glicoproteina (GP) in un altro MLV pseudotipizzato particella sistema17e l'influenza emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) in VSV pseudovirions38. Uno sviluppo recente nella caratterizzazione delle particelle pseudotipizzato produzione è l'utilizzo di innovativi dispositivi di imaging quali Nanosight: permette di visualizzare direttamente, quantificare e taglia le particelle virali50. Il dispositivo fornisce informazioni dettagliate sulla produzione complessiva delle particelle; Tuttavia, è importante tenere a mente che non fornisce informazioni sull'incorporazione di busta glicoproteina. Un orientamento futuro per l'applicazione di queste particelle versatile pseudovirion è quello di analizzare gli eventi di fusione virale individuali utilizzando singola particella di rilevamento, microfluidica e riflessione interna totale fluorescenza microscopia60,61 ,62. Tali approcci sono stati applicati correttamente al virus dell'influenza e particelle coronavirus felino come pure l'influenza HA - e NA-pseudotipizzato VSV-based pseudovirions63. La distribuzione di tali tecniche applicate ai coronavirus S-pseudotipizzato particelle basate su MLV è attualmente in fase di sviluppo.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare tutti i membri dei laboratori Whittaker e Daniel per utili commenti. Finanziamento della ricerca è stato fornito dal NIH concede R21 AI111085 e AI135270 R01. T.T. riconosce sostegno dalla compagnia Life Science presidenziale a Cornell University e National Science Foundation Graduate Research Fellowship programma sotto Grant No. DGE-1650441. L.N. riconosce sostegno da un Samuel C. Fleming famiglia Istituto europeo di oncologia e la National Science Foundation Graduate Research Fellowship programma sotto Grant No. DGE-1650441. Questo lavoro è supportato anche dal National Science Foundation 1504846 (per S.D. e G.R.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | Clone 17 cells are highly competent for transfection. |
| African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells | ATCC | CRL-1586 | |
| Human hepatic Huh-7 cells | Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | JCRB0403 | |
| Inverted light microscope with 10 × objective | Nikon | TS100 | |
| Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate | Corning Mediatech | 10-017-CV | |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 1614071 | |
| 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES) | Corning Mediatech | 25-060-Cl | |
| 100 × penicillin-streptomycin (PS) solution | Corning Mediatech | 30-002-Cl | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning Mediatech | 21-030-CV | |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution | Corning Mediatech | 25-053-Cl | |
| Cell counting slides with grids | Kova | 87144 | |
| Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 11668-027 | |
| 0.45 µm pore-size sterile filter | Pall | 4184 | |
| 10 mL syringes | BD | 309604 | |
| 5 × luciferase assay lysis buffer | Promega | E1531 | |
| Luciferin, substrate for luciferase assay | Promega | E1501 | |
| Sterile water | VWR | E476-1L | |
| GloMax 20/20 luminometer | Promega | 2030-100 |
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