Här presenterar vi ett protokoll för att generera pseudotyped partiklar i en BSL-2 inställning innehåller proteinet spike högpatogena virus Mellanöstern respiratorisk sjukdom och svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus. Dessa pseudotyped partiklar innehåller ett luciferas reporter gen så att kvantifiering av virus trätt i värd målceller.
Protokollet syftar till att generera coronavirus (CoV) spike (S) fusionsprotein pseudotyped partiklar med en murin leukemi virus (MLV) core och luciferas reporter, använder en enkel transfection tillvägagångssättet av den allmänt tillgängliga HEK-293T cellinje. När bildas och avges från producenten celler, införliva dessa pseudovirions ett luciferas reporter gen. Eftersom de endast innehåller heterologa coronavirusen spike protein på sin yta, partiklarna beter sig som deras infödda coronavirus motsvarigheter för posten steg. Som sådan, är de de utmärkta ersättningar av infödda virioner för att studera viral trätt i värdceller. Vid lyckad post och infektion i målceller, luciferas reportern blir integrerade i den mottagande cell arvsmassan och uttrycks. Med en enkel luciferas-analys, kan sensorik celler vara enkelt kvantifieras. En viktig fördel med förfarandet är att det kan utföras i biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) faciliteter istället för BSL-3 faciliteter krävs för arbete med högpatogen coronavirus som Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) och svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus (SARS-CoV). En annan fördel kommer från dess mångsidighet som det kan tillämpas på kuvert proteiner tillhör alla tre klasser av viral fusionsproteinerna, till exempel klassen I influensa hemagglutinin (HA) och Ebola virus glykoprotein (GP), klass II Semliki forest viruset E1 protein, eller klass III vesikulär stomatit virus G glykoprotein. En begränsning i metoden är att det endast kan sammanfatta virus posten steg medieras av kuvertet protein utreds. För att studera andra virala livscykel steg, krävs andra metoder. Exempel på de många program som dessa pseudotype partiklar kan användas i utredningen av mottagande cellernas mottaglighet och tropism och testa effekterna av viruset inträde hämmare att dissekera viral posten vägar används.
Cell värdpost utgör de första stegen av viral infektionssjukdomar livscykel. För höljeförsedda virus innebär bindning till en enda värd cell receptor eller flera receptorer, följt av smältning av viral och cellulära membran. Dessa väsentliga funktioner utförs av virala kuvertet glykoproteiner1,2. Den coronavirus kuvert glykoprotein kallas proteinet spike (S) och är medlem i klassen jag viral fusion proteiner2,3,4,5,6. Studera virala kuvertet glykoproteiner är avgörande för att förstå många viktiga egenskaper hos ett visst virus, såsom: lifecycle inledande, dess värden och cellulära tropism, mellan arterna överföring, viral patogenes, samt värd cell inträde vägar. Viral pseudotyped partiklar, även kallad pseudovirions, är kraftfulla verktyg som möjligt för oss att enkelt studera funktionen av viral fusionsproteinerna. Pseudotyped partiklar eller pseudovirions är chimära virioner som består av en surrogat viral kärna med ett heterologt virala kuvertet protein på sin yta. Protokollets huvudsakliga syfte är att visa hur man skaffar coronavirus spike pseudotyped partiklar som är baserade på en murin leukemi virus (MLV) kärna och innehåller ett luciferas reporter gen. Som exempel presenteras metoden för att producera pseudotyped partiklar med spike proteinerna av högpatogen svår akut respiratorisk sjukdom (SARS) och Middle East respiratory syndrome (MERS) coronavirus. Protokollet beskrivs förfarandet transfection inblandade, hur att smitta mottagliga target cells, och smittsamhet kvantifiering av luciferas assay.
Eftersom posten stegen i pseudovirions regleras av coronavirusen S på deras yta, ange de celler på ett liknande sätt till inhemska motsvarigheter. Som sådan, är de utmärkta surrogat av funktionella smittsamhet analyser. Pseudotyped partiklar är vanligtvis härrör från föräldrarnas modell virus såsom retrovirus (MLV,7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 och lentivirus humant immunbristvirus — HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesikulär stomatit virus — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). när den används i pseudotyping, föräldrarnas virus genomen modifieras för att ta bort viktiga gener, vilket gör dem defekt för att åstadkomma en fullständig replikeringscykel. Denna funktion tillåter dem att användas i mellanliggande biosäkerhet nivå faciliteter (BSL-2) och är en viktig fördel jämfört med infödda högpatogena virus som kräver högre biosäkerhet faciliteter (BSL-3, BSL-4 som inte är så lätt tillgängliga) när bedriver virus post studier. Här, S proteinerna av risk grupp 3 patogener SARS-CoV och MERS-CoV används som exempel på virala kuvert proteiner införlivas MLV pseudotyped partiklar, generera SARS-CoV S och MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp och MERS-Spp, respektive). Dessa pseudovirions har använts framgångsrikt i studier med fokus på posten händelser av dessa virus48,49,50,51. En annan fördel är att den teknik som beskrivs här inte är begränsad till pseudotyping coronavirus S proteiner: det är mycket flexibel och kan användas för att införliva representanter från alla tre klasser av viral fusionsproteinerna. Exempel inkluderar influensa hemagglutinin (HA, klass I)52, Ebola virus glykoprotein (GP klass I), E1 protein alphavirus Semliki Forest virus (SFV, klass II) och VSV glykoprotein (G, klass III)53. Dessutom mer än en typ av viral glykoprotein kan vara co införlivad med en pseudotyped partikel, som i fallet med influensa HA- och NA – pseudotyped partiklar51.
Baserat på arbete som utförs av Bartosch et al.20, det här protokollet beskriver generationen av MLV pseudotyped partiklar med en tre-plasmid samtidig transfection strategi med hjälp av den allmänt tillgängliga och transfection-kompetenta HEK-293T cellinje 54. första plasmiden kodar den MLV core generna gag och pol men saknar genen MLV kuvert env . Andra plasmiden är en överföring vektor som kodar en firefly luciferas reporter gen, en MLV Ψ-RNA förpackning signal, tillsammans med 5′- och 3′-flankerande MLV länge terminal upprepa (LTR) regioner. Den tredje plasmiden kodar proteinet fusion av intresse, i det här fallet antingen proteinet SARS-CoV S eller S för MERS-CoV. Vid samtidig transfection av tre plasmidsna använder transfection reagens, få viral RNA och proteiner uttrycks inom transfekterade celler möjliggör generering av pseudotyped partiklar. Eftersom MLV används som neutralisationsanalysen ryggrad, detta inträffar vid plasmamembranet: RNASEN som innehåller luciferas gen reporter och förpackning signal få inkapslade i begynnande partiklar som också införlivar plasmamembran-uttryckta coronavirus spike proteiner. De partiklar som bud ut från cellerna innehåller coronavirus S protein på sin yta och skördas för användning i smittsamhet analyser. Eftersom pseudotyped partiklar hamnområde coronavirus S proteinet och inte MLV kuvertet protein, när den används för att infektera celler, de beter sig som deras infödda coronavirus motsvarigheter för posten steg. Viral RNA som innehåller luciferas reportern och flankerande l släpps sedan inom cellen och retrovirala polymeras verksamheten möjliggöra dess omvänd transkription i DNA och integrering i den mottagande cell arvsmassan. Kvantifiering av smittsamhet viral pseudotyped partiklar i infekterade celler utförs sedan med en enkel luciferas aktivitet assay. Eftersom DNA-sekvensen som blir integrerade i den mottagande cell arvsmassan endast innehåller luciferas genen och ingen av de MLV eller coronavirus protein-encoding generna, är de till sin natur säkrare att använda än replikering-behöriga infödda virus.
Förutom att vara säkrare surrogat och mycket anpassningsbara att tillåta införlivandet av olika typer av kuvertet glykoproteiner, de pseudotyped partiklar som beskrivs här är också mycket mångsidig och kan användas för att studera många aspekter av viruset inträde. Detta inkluderar men är inte begränsat till: testa värd cellernas mottaglighet för virusinfektion, analysera de cellulära post vägar ett höljebärande virus använder, studera effekter av farmakologiska hämmare och drog filmvisningar, bedriva neutralisering antikropp analyser, karaktärisera värd cellinmatning höljeförsedda virus som inte kan vara odlade, och generera virala vektorer för gen leverans, stabil cellulära uttrycket av gener av intresse, eller nedtystning.
Det här protokollet beskriver en metod för att effektivt producera pseudotyped partiklar bär S proteinet av risk grupp 3 coronavirus, SARS-CoV och MERS-CoV i BSL-2 miljö. Dessa partiklar, som inkorporerar ett luciferas reporter gen, göra det möjligt för oss att enkelt kvantifiera coronavirus S-medierad inträde händelser av en relativt enkel luciferas assay48,49,50,51. Smittsamhet analyser med tillåtande celler, bekräftar vi att aktiviteten luciferas mätt är beroende av koncentrationen av partiklar. Dessutom möjliggör ACE2 och DPP4 receptor transfection effektivare post i dåligt tillåtande celler rader, till exempel HEK-293T celler. Metoden är mycket anpassningsbar till andra virala kuvertet glykoproteiner och har använts i stor utsträckning48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofta att komplettera andra analyser som biokemiska analyser eller infödda virusinfektioner.
Det protokoll som vi beskriver här är baserad på retrovirus MLV som innehåller luciferas reporter. Det är dock viktigt att betona att det finns ett mycket brett utbud av andra pseudotyping-system som har utvecklats framgångsrikt för förpackning coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 och andra virala kuvertet glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. några av dessa andra system är baserade på vanliga MLV retrovirala core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller baserat på den utbredda lentiviral HIV-1 pseudotyping system med hjälp av olika strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesikulär stomatit virus (VSV) som kärna, som gör det möjligt för att införliva en mängd av kuvertet glykoproteiner, och igen med olika anställd strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Dessutom andra reportrar till exempel fluorescerande proteiner såsom GFP11,13 och RFP36eller enzymer än luciferas som β-galaktosidas16,17 och utsöndras alkaliskt fosfatas (SEAP)42 har lyckat använts för mätningar. Dessutom i den analys som presenteras i detta protokoll, användes en övergående transfection för att uttrycka MLV och CoV S gener och proteiner. Dock finns det andra strategier för uttryck, såsom generering av stabil cell linjer för produktion av pseudotyped virus7,14. Som varje system har sina fördelar och nackdelar, är det viktigt att beakta följande viktiga parametrar när man beslutar vilken pseudotyping system bästa passar en prövarens behov: neutralisationsanalysen kärna (MLV, HIV-1, VSV eller andra), hur selektiv en viss pseudotyping kärna är införliva en specifik viral kuvert glykoprotein, reporter för assay avläsning (GFP, luciferas, SEAP eller annat) och transfection strategin (antal plasmider inblandade i samtidig transfection, övergående transfection eller generering av stabil cellinjer).
Det finns ett antal kritiska steg i metoden som är viktiga att betona. Cell densiteten, särskilt av raden HEK-293T/17 producent cell är en kritisk faktor för att säkerställa framgångsrika transfection. En cell densiteten i intervallet 40 – 60% konfluens befanns vara optimal. Högre densiteter leda vanligtvis låg transfection effektivitet och låga partikel produktion. Dessutom är det viktigt att komma ihåg att HEK-293T/17 celler är mindre vidhäftande än andra cellinjer. Försiktighet bör iakttas vid hantering av dem. Undvik lossa dem onödigt. Ett alternativ är att behandla cell kultur plastytor med poly-D-lysin att förbättra följsamhet. Dessutom resulterar högre cell passage ofta i fattiga transfection priser. Efter att lägga transfection reagensen HEK-293T/17 celler, är det också viktigt att komma ihåg att cellen permeabilitet ökar. Det är därför i nuläget är det bäst att undvika att använda medium innehållande antibiotika eftersom de kan öka Cytotoxiciteten. Innan samlande pseudotyped partiklar, kontrollera färgen på transfekterade HEK-293T/17 cell supernatanterna. Vanligtvis efter 48 h av transfection tar cell odlingsmedium färgen en orange-rosa nyans. Gul-färgade medium vanligtvis översätts till fattiga pseudotyped partiklar avkastning och är ofta ett resultat av problem med cell sådd densitet eller hög passage nummer.
I detta protokoll utförs pseudotyped partikel produktionen i ett 6-well platta format. För att öka volymen av producerade partiklar, flera brunnar i en 6-väl plattan kan vara transfekterade med samma plasmider mix och supernatanterna kan poolas tillsammans. Poolen kan klargöras, filtrerade och aliquoted. Alternativt för att skala produktion upp, andra typer av fartyg (t.ex. 25 eller 75 cm2 kolvar) kan användas. I det här fallet bör transfection villkor skalas upp med detta. I detta protokoll utförs smittsamhet analysen med ett 24-well platta format och en luminometer som bara tillåter mätningar ett rör i taget. För hög genomströmning filmvisningar är andra format också möjligt, såsom plattan med 96 brunnar format och en tallrik läsaren luminometern. Volymer och reagenser för luciferas analysen måste anpassas därefter. Lagring av pseudotyped partiklar i cryovials vid-80 ° C behåller sin stabilitet i flera månader utan märkbar minskning av smittsamhet. Det rekommenderas inte att utsätta dem för att frysning-tining cykler som detta kommer att minska sin smittsamhet över tid. Därför är det bäst att förvara dem i små delprover som 0,5 – 1 mL och Tina dem innan en infektion.
Metoden presenteras här har flera begränsningar. En viktig är det faktum att pseudotyped partiklar recapitulate endast viral post händelser. För att analysera andra steg i livscykeln för infektiös, krävs andra analyser. Dessutom som MLV partiklar knopp på plasmamembranet, det är viktigt att komma ihåg att de kuvert glykoprotein som studeras behov att även trafik till plasmamembranet för iblandning i pseudovirions under produktionen. Som sådan, är det viktigt att veta var i cellen en särskilda virala kuvert glykoprotein uttrycks i transfection villkor, såsom genom att visualisera subcellulär lokalisering med en immunofluorescens analys, eller genom att kontrollera lagring signaler inom proteinet. Också, medan protokollet beskriver stegen för att producera och testa smittsamhet, det inte i detalj hur man mäter införlivande av virala kuvertet glykoproteiner i pseudotyped partiklar. En metod är att utföra western blot analyser på koncentrerade lösningar av partiklar, som tidigare beskrivits50,51 för MERS-CoV S iblandning. I dessa analyser, är den S kuvert glykoprotein i MERS-CoV utforskad tillsammans med proteinet kapsid (p30) av MLV, som gör det möjligt för oss att normalisera införlivande av proteinet S partiklar. Andra exempel på sådana analyser analysera virala kuvert glykoprotein införlivande i pseudovirions har utförts för SARS-CoV S iblandning i en HIV-1 lentiviral neutralisationsanalysen system32 , Ebola glykoprotein (GP) i en annan MLV pseudotyped partikel system17, och influensa hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) i VSV pseudovirions38. En ny utveckling i karaktärisera pseudotyped partikel produktion är användningen av innovativa imaging-enheter såsom Nanosight: det gör det möjligt för oss att direkt visualisera, kvantifiera och storlek viruspartiklar50. Enheten innehåller detaljerad information om totala partikel produktionen; Det är dock viktigt att komma ihåg att den inte ger information om kuvert glykoprotein inkorporering. En framtida riktning för tillämpningen av dessa mångsidiga neutralisationsanalysen partiklar är att analysera enskilda virala fusion händelser med enda partikel spårning, mikrofluidik och Totalreflexion fluorescence mikroskopi60,61 ,62. Sådana tillvägagångssätt tillämpades till influensavirus och felint coronavirus partiklar samt influensa HA – och NA-pseudotyped VSV-baserade pseudovirions63. Distribution av sådan teknik som tillämpas på coronavirus S-pseudotyped MLV-baserade partiklar som för närvarande utvecklas.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla medlemmar i de Whittaker och Daniel labs för hjälpsamma kommentarer. Finansiering av forskning lämnades av NIH grants R21 AI111085 och R01 AI135270. T.T. erkänner stöd från presidentvalet Life Science gemenskap i Cornell University och National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr DGE-1650441. Lauridsen erkänner stöd från en Samuel C. Fleming familj Graduate Fellowship och National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr DGE-1650441. Detta arbete stöds också av National Science Foundation 1504846 (att S.D. och G.R.W.).
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | Clone 17 cells are highly competent for transfection. |
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells | ATCC | CRL-1586 | |
Human hepatic Huh-7 cells | Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | JCRB0403 | |
Inverted light microscope with 10 × objective | Nikon | TS100 | |
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate | Corning Mediatech | 10-017-CV | |
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 1614071 | |
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES) | Corning Mediatech | 25-060-Cl | |
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution | Corning Mediatech | 30-002-Cl | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning Mediatech | 21-030-CV | |
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution | Corning Mediatech | 25-053-Cl | |
Cell counting slides with grids | Kova | 87144 | |
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 11668-027 | |
0.45 µm pore-size sterile filter | Pall | 4184 | |
10 mL syringes | BD | 309604 | |
5 × luciferase assay lysis buffer | Promega | E1531 | |
Luciferin, substrate for luciferase assay | Promega | E1501 | |
Sterile water | VWR | E476-1L | |
GloMax 20/20 luminometer | Promega | 2030-100 |