I krybdyr er hud lipider fra artsfæller afgørende for seksuel signalering, med potentielle anvendelse i forvaltning af invasive arter. Her beskriver vi protokoller til at udtrække hud lipider fra stald hud eller hele dyr, bestemme og analysere den samlede lipid masse og adskille lipider ved hjælp af fraktionering via kolonne kromatografi.
Krybdyr signal til artsfæller ved hjælp af lipider i deres hud, primært til at muliggøre mate tracking og vurdering. Isolationen af disse lipider har nytte i forskning fokuseret på evolutionære mønstre og mekanismer for kemisk kommunikation, ud over oplysninger om vandtætning betydningen af lipider i udviklingen af jordiske liv. I en anvendt metode har sådanne hud-baserede stikord potentielle anvendelse for dyreliv ledere beskæftiger sig med invasive arter. De vigtigste skridt for kvantificering krybdyr hud lipider i den protokol, der præsenteres her omfatter udvinding, samlede lipid bestemmelse og fraktionering via kolonne kromatografi, sidstnævnte processen resulterer i renset eluater af forbindelser, som kan derefter enten blive analyseret for at tildele sammensatte identifikationer (fxgaskromatografi-massespektrometri [GC-MS]) og/eller bruges direkte i mere raffineret bioassays. Huden lipider kan udvindes fra levende hud, kaste huden, eller døde hele dyr, ved hjælp af upolære organiske opløsningsmidler (f.eks., hexan, benzen, toluen). Udvinding solubilizes af lipider, og derefter, opløsningsmidlet kan være fordampet for at give en målbar kun lipid-ekstrakt. Fraktionering indebærer adskillelse af den samlede lipid ekstrakt i specifikke eluater via traditionelle kolonne kromatografi. Den samlede lipid ekstrakt først er bundet til et substrat-baseret kolonne (fx, aluminiumoxid) og så individuelle eluater (“fraktioner”) af opløsningsmiddel ved bestemte mængder overført sekventielt gennem kolonnen at eluere sæt af forbindelser fra lipid blanding baseret på fælles polaritet. Brøker fremskridt i polaritet på en standardiseret sekvens ved at øge den relative mængde af polært opløsningsmiddel (fx, diethylether) i upolære opløsningsmidler. I dette manuskript, vi beskriver flere metoder til at udtrække hud lipider krybdyr og derefter give en standardprotokol til isolering af forskellige sæt af forbindelser baseret på polaritet, ved hjælp af traditionelle kolonne kromatografi. Hele lipid ekstrakter eller særlige fraktioner kan, derefter bruges i bioassays til at afgøre enhver biologisk aktivitet fremkaldes ved forbindelser deri.
Krybdyr producere lipider i epidermis, enten direkte fra hudens celler eller diskrete kirtler, der er brugt i social kommunikation, såsom mate vurdering og sporing, territorialprincippet, og intra- og artskrydsede anerkendelse1,2 ,3,4. Isolationen af disse hud lipider har nytte i forskning fokuseret på evolutionære mønstre og mekanismer for kemisk kommunikation, ud over oplysninger om vandtætning betydningen af lipider i udviklingen af jordiske liv2,3 ,4. Yderligere, mange krybdyr, især squamates (firben, slanger), invasive arter af bekymring i følsomme økosystemer, og udviklingen af feromon-baserede lokker at forbedre diffusering og fjernelse er igangværende5,6. Krybdyr hud uigennemtrængelighed letter udvinding af lipider stede at opnå relativt rene udtræk af en potentielt stærk kilde til kemiske signaler. Princippet om skridt for kvantificering krybdyr hud lipider i den beskrevne protokol omfatter udvinding, samlede lipid bestemmelse og fraktionering via kolonne kromatografi1,6,7. Metoder har været anvendt rutinemæssigt som de udbytte bioaktive isolater, der forklarer meget om mate valg og udvælgelse, især i slanger2.
Huden lipider kan udvindes fra enten levende hud, stald hud, eller døde hele krybdyr, ved hjælp af upolære eller polære organiske opløsningsmidler1,7,8,9. Det skal bemærkes, at museet prøver opbevares i opløsningsmidler som ethanol er ikke optimale til udvinding af huden lipider, og kun friske eller frisk frosne slagtekroppe bør betragtes som mulige kilder til udvinding. Huden lipider er inert, hvilket gør dem stabile på overfladen af huden og nemt at udtrække7. I deres signaling roller i krybdyr økologi, hud lipid stikord er ofte deponeret i barske miljøer, men på grund af deres robuste kemiske egenskaber, disse stikord kan bevare deres oplysninger værdi over lang tid10,11 , 12. udpakningen solubilizes lipider, ved hjælp af en upolære opløsningsmidler (f.eks., hexan, benzen, toluen) over en timer lange blød, efterfulgt af fordampning af opløsningsmidlet, til at forlade en målbar massen af lipid ekstrakt7 , 8. hud lipider er meget blandbart i upolære opløsningsmidler, og en lang række kulbrinter kan udvindes fra en tilsvarende bred vifte af kilder.
Fraktionering er mere besværligt end udvinding men tjener til at adskille den samlede lipid ekstrakt i specifikke fraktioner via kolonne kromatografi, at støtte i rensning og eventuel identificering af forbindelser deri1, 6 , 7 , 8. den samlede lipid ekstrakt er bundet til et substrat-baseret kolonne, og derefter, individuelle eluater (“fraktioner”) af opløsningsmiddel ved bestemte mængder er bestået sekventielt gennem kolonnen at eluere sæt af forbindelser fra lipid blanding, der har en fælles polaritet6,7,8. I lipid kromatografi, brøker fremskridt i polaritet på nogle standardiserede sekvens ved at øge den relative mængde af polært opløsningsmiddel (fx, diethylether) i upolære opløsningsmidler (typisk udtrykt i procent: 0%, 2%, 4% Æter, osv. )6,7,8. Selvom metoder som tyndtlagskromatografi (TLC) kan bruges til at adskille lipider i en blanding og er enklere, kolonne kromatografi er foretrukket, fordi det bruger et lukket system, er nem at styre, kan særskilt mere koncentreret blandinger, og er kompatibel med multiplexing for effektivitet. I dette manuskript, vi beskriver flere metoder til at udtrække hud lipider krybdyr og derefter give en standardprotokol til isolering af forskellige sæt af forbindelser baseret på polaritet, ved hjælp af traditionelle kolonne kromatografi. I mange forskningsprojekter der involverer isolering af kemiske signaler, er det ultimative mål at gennemføre ændringer i modtagere udsat for disse stikord. Hele lipid ekstrakter eller særlige fraktioner kan, derefter bruges i bioassays til at afgøre enhver biologisk aktivitet fremkaldes ved forbindelser deri1,2,6,7. I biologisk grundforskning, f.eks kan bioassays ved hjælp af særlige fraktioner afsløre at forskerne at en renset kilde af feromoner er blevet isoleret, og derefter, metoder til identifikation af target forbindelser kan forfølges. Fra en management perspektiv, identifikation kan ikke være målet, og i stedet, den aktive fraktion kan bruges i feltet til at tiltrække artsfæller fælder eller hæmme mate sporing i nonnative habitat13,14.
Udvinding af huden lipider i krybdyr kan anvendes på levende eller døde hud, ud over stald hud, som tilbyder alsidighed i eksperimentel anvendelse af denne teknik. Yderligere, ekstraktioner af huden lipider kan gøres i feltet, at aktivere en dynamisk anvendelse af metoden på en bred vifte af biologer2,13. Udvinding af huden lipider er simpel; Derfor, det er nemt at skalere op ekstraktioner efter behov pr. eksperiment eller design, og praktiserende læger skal ikke have betydelig ekspertise til at udføre metoderne. De eneste begrænsende faktorer for optrapning er tilgængeligheden af aftræk hood plads, en overflod af ren, forsegles glasvarer og opløsningsmidler lagerplads.
Huden lipid ekstrakt fraktionering kan skræddersys til en forsker behov, og derfor har lignende fleksibilitet til lipid udvinding. For eksempel kan neutral lipider elueret og derefter kasseres, hvis du vil resultere i target fraktioner, der kan rense forbindelser af interesse eller forenkle bioassays. Fraktionering kan udføres på flere niveauer inden for og på tværs af lipid prøver. Eksempelvis kan flere kolonner køres samtidigt for at gøre processen mere effektiv. Eller kun en del af en samlet lipid ekstrakt kan være fraktioneret på en lille kolonne til, således reservedele reagenser og tid. Fraktionering er primært begrænset af massen af den samlede lipid ekstrakt og præcisionen af det udstyr til rådighed til forskeren. For eksempel, hvis forskeren har en balance med en 10,0 mg præcision, bestemmelse af brøkdel masse og, derfor, vanskeliggøres nøjagtigheden af prøveforberedelse til GC-MS analyse betydeligt, hvis ikke helt. Det samme er tilfældet for glasvarer. Hvis forskeren har en stor volumen kolonne til fraktionering, men har en lille samlede lipid masse til at adskille eluering eller adskillelse af forbindelser videre men vil kræve et betydeligt spild af opløsningsmidler, reagenser, tid og potentielt, målet forbindelser selv.
Det anbefales at udføre en kvalitetskontrol kontrol før bestemmelse af eluering ordning, som det ses i tabel 2, og beslutter hvilke fraktioner kan kasseres. For at bekræfte eluering af de ønskede lipider, en kolonne kan være løb hvor hver fraktion, 1-15, indsamles individuelt og derefter analyseret ved hjælp af GC-MS. I figur 3viser repræsentative gaskromatograf spor at methyl ketoner fra strømpebånd slanger kun elueres af kolonnen i en bestemt brøkdel. Ved at udføre trinnet kvalitetskontrol, kan en modificeret eluering ordning udvikles til en given art at sikre det maksimale udbytte af forbindelser af interesse. Ændringer i materialer, som leverandøren eller masse af aluminiumoxid eller alder af diethylether, vil absolut medføre forskelle i eluering, der skal kontrolleres ved at udføre en kvalitetskontrol test.
De teknikker, der beskrives er begrænset først og fremmest af den kemiske natur af de signaler, der kan opnås. Primært, tillade disse metoder kun forskere at isolere og separate langkædede lipider fra huden af krybdyr. Mange arter af krybdyr bruge luftbåret og/eller proteinholdige stikord som kemiske signaler, og de beskrevne metoder er uforenelig med isolere sagde stikord. Yderligere, upolære opløsningsmidler vil ikke uddrag vandig stikord fra overflader af krybdyr eller kilder af cue deposition (fx, bur vand, fecal spørgsmål, akvatiske substrat) der kan faktisk indeholde rigelige kemiske signaler. Egnede metoder til at indfange disse typer af stikord er tilgængelige for forskere (f.eks.fast-fase microextraction [SPME] for flygtige stikord og højtydende væskekromatografi [HPLC] for vandige stikord), selv om, som metoderne beskrevet ovenfor, er der en teknisk indlæringskurve.
Vigtigst, bør nytten af den endelige kemisk blanding til forskeren guide de anvendte metoder. For eksempel, hvis en forsker ønsker at vide, hvis en mandlig fokale dyr kan skelne mellem stikord produceret af mandlige vs kvindelige artsfæller i en målrettet bioassay, er ekstraktion metoden kun behov for2,3. Hvis identifikationen af seksuelt dimorfe forbindelser er målet, men bør ekstrakt skal renses for at aktivere større tillid til tildeling af id’er til specifikke molekyler eller grupper af molekyler via kemisk analyse1, 6,9,11. Dog at selv føre kromatografi med en lipid kilde, er en betydelig masse starter ekstrakt påkrævet så at målbare brøkdel masserne kan opnås; ellers, pooling af prøver kan forfølges, men er ikke optimal14.
Fremtidige udvikling af denne protokol omfatter foranstaltninger til at udnytte og tilpasse fremgangsmåden for mere krybdyrs arter. Yderligere noninvasive metoder til udvinding af huden lipider er også under udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Udviklingen af disse metoder, især skur hud lipid udvinding, der opstod under samarbejdsaftaler (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA og 16-7412-1269-CA) mellem James Madison University (JMU) og US Department of Agricultures dyr og Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. anerkender bidrag af de følgende studerende til udviklingen af skur hud metoder: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) og S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |