Sürüngenler, cilt lipidler conspecifics üzerinden cinsel, istilacı türlerin yönetimi potansiyel kullanımı ile sinyal için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz döken deri ya da tüm hayvanların, deri lipidler ayıklamak için protokolleri açıklamak belirleme ve toplam lipid kütle analiz ve ayırma ile sütun Kromatografi kullanarak lipidler ayıran.
Sürüngenler lipidler öncelikle dostum izleme ve değerlendirme sağlamak için onların deri kullanarak conspecifics için sinyal. Bu lipitlerin yalıtım evrimsel desen ve mekanizmaları lipidler karasal yaşamın evrimi içinde su yalıtım rolünün anlaşılması yanı sıra kimyasal iletişim odaklı araştırma yarar vardır. Bir uygulanan yaklaşım, böyle deri tabanlı ipuçları invaziv türler ile ilgili yaban hayatı yöneticileri için olası kullanımları vardır. Ayıklama, toplam lipid tayini ve ayırma ile sütun Kromatografi, hangi-ebilmek o zaman bileşikler arıtılmış eluates içinde ortaya çıkan ikinci işlem sürüngen cilt lipidler burada sunulan protokolündeki miktarının ana adımları içerir ya bileşik tanımlamaları (Örneğin, gaz kromatografi-kütle spektrometresi [GC-MS]) atamak için analiz ve/veya doğrudan daha rafine biyoanalizler kullanılan. Cilt lipidler yaşam deri elde edilebilir, deri veya ölü tüm hayvanlar, nonpolar organik çözücüler (Örneğin, hekzan, benzen, Toluen) kullanarak döken. Ayıklama lipidler solubilizes ve sonra solvent ölçülebilir bir salt lipid özü vermeye buharlaşmış. Ayırma toplam lipid özü belirli eluates yolu ile geleneksel sütun Kromatografi içine ayrılması içerir. Toplam lipid özü ilk substrat tabanlı sütun için (Örneğin, Alümina) bağlıdır ve sonra bireysel eluates (“kesirler”) belirli miktarlar solvent sırayla üzerinden sütun kümeleri bileşiklerin lipit karışımından elute geçti temel alınarak ortak polarite. Polarite nonpolar solvent kutup solvent (Örneğin, dietil eter) göreli miktarını artırarak standartlaştırılmış bir sıra, kesirler sürüyor. Bu makale içinde biz sürüngenler cilt yağlar ayıklamak için birkaç yöntem açıklar ve, sonra standart bir protokol farklı polarite üzerinde esaslı bileşikleri grupları yalıtmak için geleneksel sütun Kromatografi kullanarak sağlar. Bütün lipid özleri veya belirli kesirler daha sonra biyoanalizler içinde orada tarafından bileşikler elde edildi herhangi bir biyolojik etkinliğini belirlemek için kullanılabilir.
Lipidler epidermis, doğrudan deri hücreleri veya dostum değerlendirme ve izleme, şimdi ve içi – ve interspecific tanıma1,2 gibi sosyal iletişimde kullanılan ayrık bezleri içinde sürüngenler üretmek ,3,4. Bu cilt lipitlerin yalıtım evrimsel desen ve mekanizmaları lipidler evrim karasal yaşam2,3 ve su yalıtım rolünün anlaşılması yanı sıra kimyasal iletişim odaklı araştırma yarar vardır ,4. Ayrıca, birçok sürüngenler, özellikle squamates (kertenkele, yılan), hassas ekosistemler endişe invaziv türü vardır ve Kalkınma feromon tabanlı lures yakalama ve Temizleme geliştirmek için devam eden5,6. Sürüngen cilt sızdırmazlık lipidler nispeten saf çekimi kimyasal sinyallerin potansiyel olarak güçlü bir kaynak elde etmek için mevcut ekstraksiyon kolaylaştırır. Sürüngen cilt lipidler açıklanan protokolündeki miktarının için ilke adımlar ayıklama, toplam lipid tayini ve sütun Kromatografi1,6, üzerinden ayırma7içerir. Onlar çok dostum seçim ve seçim, özellikle de yılan2hakkında açıklamak biyoaktif yalıtır verim gibi yöntemler rutin olarak kullanılmaktadır.
Cilt lipitler ya yaşam cilt, döken cilt, ya da ölü tüm sürüngenler, nonpolar kullanarak veya polar organik çözücüler1,7,8,9elde edilebilir. Bu maddeleri etanol gibi depolanan Müzesi numuneler cilt yağlar ekstraksiyon için uygun değillerdir ve sadece taze veya taze dondurulmuş karkas çıkarılması için olası kaynaklar olarak kabul edilmelidir unutulmamalıdır. Cilt lipidler etkisiz, onları kararlı deri yüzey ve7ayıklamak kolay yapar. Sinyal rolleri sürüngen ekoloji cilt lipid cues kez sert ortamlarda yatırılan ancak güçlü kimyasal özellikleri nedeniyle, bu tür yardımlar saat10,11 uzun süre bilgi değerlerine koruyabilirsiniz , 12. lipid özü7 ölçülebilir bir kitle bırakmak solvent, buharlaşma tarafından takip bir saat süren poşeti üzerinde bir nonpolar çözücü (Örneğin, hekzan, benzen, Toluen) kullanarak lipidler, ayıklama işlemi solubilizes , 8. Cilt lipidler nonpolar çözücüler son derece karışan ve geniş bir hidrokarbon kaynakları aynı şekilde çeşitli bir dizi elde edilebilir.
Ayırma daha ayıklama zahmetli ama toplam lipid özü bileşikleri arıtma ve olası kimlik orada1, yardım etmek için belirli kesirler ile sütun Kromatografi, içine ayırmak için hizmet vermektedir 6 , 7 , 8. toplam lipid özü substrat tabanlı bir sütun bağlıdır ve sonra bireysel eluates (“kesirler”) belirli miktarlar solvent sırayla kümeleri ortak bir sahip bileşiklerin lipit karışımından elute sütunu boyunca iletilir polarite6,7,8. Lipid Kromatografi polarite bazı kesirler sürüyor standart sıra nonpolar çözücü içinde kutup solvent (Örneğin, dietil eter) göreli miktarını artırarak (genellikle bir yüzdesi olarak ifade edilir: % 0, %2, % 4 eter, vs. )6,7,8. Gibi ince katmanlı Kromatografi (TLC) lipidler bir karışımı ve daha basit ayırmak için kullanılan yöntemleri, sütun Kromatografi olduğunu kapalı bir sistem, kullandığı için tercih kontrol edebilirsiniz kolaydır, ama ayrı daha karışımları konsantre ve ile uyumludur verimlilik için çoğullama. Bu makale içinde biz sürüngenler cilt yağlar ayıklamak için birkaç yöntem açıklar ve, sonra standart bir protokol farklı polarite üzerinde esaslı bileşikleri grupları yalıtmak için geleneksel sütun Kromatografi kullanarak sağlar. Kimyasal sopasıyla yalıtım içeren birçok araştırma projelerinde bu yardımlar için maruz alıcıları etkisi değişim amacıdır. Bütün lipid özleri veya belirli kesirler daha sonra biyoanalizler içinde herhangi bir biyolojik aktivitesi tarafından bileşikler orada elde edildi1,2,6,7belirlemek için kullanılabilir. Temel biyolojik araştırma, örneğin, belirli kesirler kullanarak biyoanalizler araştırmacılar için Feromonlar arıtılmış kaynağı izole edildikten ve daha sonra hedef bileşikler tanımlaması için yöntemleri takip edilebilir ortaya çıkarabilir. Bir yaban hayatı yönetimi açısından kimlik amaç olmayabilir ve bunun yerine, etkin kesir alanında conspecifics tuzaklara çekmek veya özgün olmayan yaşam alanı13,14‘ te izleme dostum inhibe için kullanılabilir.
Sürüngenler cilt yağlar ekstraksiyon yanı sıra deneysel uygulama bu tekniğin çok yönlülük sunuyor döken cilt, ölü ya da diri cilde uygulanır. Ayrıca, cilt lipidler çekimi yönteminin dinamik bir uygulama niteliğindeki biyologlar2,13geniş bir yelpazesi için etkinleştirmek için bu alanın içinde yapılabilir. Cilt yağlar ekstraksiyon basittir; Bu nedenle, deneme veya tasarım başına gerektiği gibi çekimi kadar ölçeklemek kolay ve uygulayıcıları yöntemleri yürütmek için önemli uzmanlık olmak zorunda değildir. Yükseltme için sadece sınırlayan faktörler duman başlık alanı kullanılabilirliğini, temiz, yapışmalı Züccaciye Mağazaları ve solvent depolama alanı bir bereket vardır.
Cilt lipid özü ayırma bir araştırmacı ihtiyaçlarına göre ve bu nedenle, lipid ayıklama için benzer esnekliğe sahiptir. Örneğin, nötr lipitler eluted ve sonra hedef kesirler bileşikler ilgi arındırmak veya biyoanalizler basitleştirmek neden olarak atılır. Ayırma ve lipid örnekleri arasında içinde birden çok ölçeklerde gerçekleştirilebilir. Örneğin, birden çok sütun aynı anda süreci daha verimli hale getirmek için çalıştırabilirsiniz. Veya bir toplam lipid özü yalnızca bir bölümünü böylece, yedek reaktifler ve zaman için küçük bir sütun üzerinde şeker. Ayırma öncelikle toplam lipid özü kütlesi ve araştırmacı için kullanılabilir ekipman duyarlığını ile sınırlıdır. Örneğin, araştırmacı kitle ve bu nedenle bir denge kesir belirlenmesi 10.0 mg hassasiyetle varsa, GC-MS analiz için numune hazırlama doğruluğunu önemli ölçüde, değilse tamamen engelledi. Aynı cam ürünleri için geçerlidir. Araştırmacı ayırma için bir büyük hacimli sütun vardır ancak ayırmak için bir küçük toplam lipid kitle varsa, elüsyon veya ayrılık bileşiklerin başlarsınız ama önemli israfını çözücüler, reaktifler, zaman ve büyük olasılıkla, hedef gerektirir kendilerini bileşikleri.
Bu Tablo 2‘ de görüldüğü gibi elüsyon düzeni belirlemeden önce bir kalite kontrol denetimi yapmak ve ne kesirler atılır olabilir karar için tavsiye edilir. İstenen lipidler, bir sütun elüsyon onaylamak için çalışma nerede her kesir, 1-15, ayrı ayrı toplanır ve sonra analiz GC-MS kullanarak olabilir. Şekil 3‘ te, temsilcisi gaz Kromatograf metil Ketonlar garter yılanları üzerinden yalnızca belirli bir kısmını sütunda bulunan elute göstermektedir. Bu kalite kontrol adımı uygulayarak, değiştirilmiş elüsyon düzeni ilgi bileşiklerin maksimum verim sağlamak belirli bir tür için geliştirilebilir. Değişiklikleri tedarikçi veya Alümina sürü veya dietil eter, yaş gibi maddeler kesinlikle için bir kalite kontrol test gerçekleştirerek denetlenmelidir elüsyon farklılıkların neden olur.
Açıklanan teknikler elde edilebilir ipuçları kimyasal doğası gereği esas sınırlıdır. Öncelikle, bu yöntemler sadece araştırmacılar yalıtmak ve uzun zincirli lipidler sürüngen derisinden ayırmak olanak sağlar. Sürüngenler türlerin kimyasal sinyaller olarak hava ve/veya proteinaceous ipuçlarını kullanın ve açıklanan yöntemleri dedi cues yalıtkan ile uyumsuzdur. Ayrıca, nonpolar çözücüler sulu cues sürüngenler yüzeyler veya kaynakları yükünün bol kimyasal sinyalleri gerçekten içeren işaret (Örneğin, kafes su, dışkı, su yüzey)-ecek hulâsa değil. Rağmen bu tür yardımlar yakalamak için uygun yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME] geçici ipuçları ve yüksek performanslı sıvı kromatografi [HPLC] sulu yardımlar için), araştırmacılar için kullanılabilir yöntemler gibi Yukarıda açıklanan, teknik bir öğrenme eğrisi olduğunu.
En önemlisi, araştırmacı son kimyasal karışıma yardımcı programı kullanılan yöntemleri yönlendirmelidir. Bir araştırmacı bir erkek odak hayvan erkek vs kadın conspecifics içinde hedeflenen bioassay tarafından üretilen yardımlar arasında ayırt edebilirsiniz Eğer bilmek istiyorsa, örneğin, ayıklama tek yöntem2,3gereklidir. Cinsel dimorfik bileşikler tanımlaması hedefi ise, ancak, özü tanımlamaları belirli molekülleri veya moleküller ile kimyasal analiz1grupları atanmasında daha fazla güven etkinleştirmek için saf lazım, 6,9,11. Ölçülebilir kesir kitleler elde edilebilir ancak, hatta kromatografi ile lipid kaynak yapmak için özü başlayan önemli bir kitle gereklidir; Aksi takdirde, örnekleri havuzu takip edilebilir ancak en uygun14değil.
Bu protokol gelecekteki gelişmeler yararlanmak ve yordamı daha sürüngen türler için uyum için önlemler içerir. Cilt lipidler ayıklama ek noninvaziv yöntemler de geliştirilmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Bu yöntem, özellikle döken cilt lipid ayıklama, geliştirme James Madison Üniversitesi (JMU) ve ABD Tarım Bakanlığı’nın hayvan arasında işbirliği anlaşmaları (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA ve 16-7412-1269-CA) sırasında meydana gelen ve sağlık teftiş Servisi (APHIS) bitki. M.R.P. kabul eder döken cilt Yöntem geliştirme aşağıdaki öğrencilere katkıları: S. Patel (Washington ve Lee Üniversitesi [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) ve S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |