Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

ב זוחלים, ליפידים העור של בני מינו הינן קריטיות לצורך איתות מינית, עם פוטנציאל השימוש בניהול מין פולש. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור חילוץ העור ליפידים מן המחסן עור או כל בעלי החיים, קביעת ניתוח המסה סה כ שומנים בדם ואת המפריד בין ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה fractionation באמצעות העמודה.

Abstract

זוחלים של אות בני מינו באמצעות שומנים בעור שלהם, בעיקר כדי לאפשר חבר מעקב והערכה. בידודו של שומנים אלה יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים. בגישה יישומית, רמזים כזה המבוסס על העור יש שימוש פוטנציאלי למנהלים חיות בר התמודדות עם מינים פולשניים. השלבים העיקריים לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול המובאת כאן כוללים חילוץ, נחישות השומנים הכולל fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, התהליך האחרון וכתוצאה מכך מטוהרים eluates של תרכובות אשר יכול אז גם להיות מנותח להקצאת מתחם ההזדהויות (למשל, גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית [GC-MS]) ו/או משתמשים בו ישירות בתוך bioassays מעודנת יותר. שומנים בעור יכול להיות מופק העור המגורים, לשפוך את העור, או מת כל בעלי חיים, שימוש בממסים אורגניים פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן). חילוץ solubilizes ליפידים ו, אז, הממס יכול להיות התאדו להניב תמצית ליפידים בלבד מדיד. Fractionation כרוך ההפרדה של תמצית השומנים הכולל לתוך eluates ספציפי באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. תמצית ליפידים הכולל קודם מאוגד לעמודה מבוססת על המצע (למשל, אלומינה), לאחר מכן, בודדים eluates ("שברים") של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים מבוסס על קוטביות נפוצות. ההתקדמות שברים קוטביות על רצף סטנדרטית על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) ממס פולרי. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע כל פעילות ביולוגית שהפיק את תרכובות ובזה.

Introduction

זוחלים לייצר ליפידים האפידרמיס, ישירות מתוך תאי העור או מכל בלוטות בדידים הנמצאים בשימוש בתקשורת חברתית, כגון הערכת חבר, מעקב, הטריטוריאליות, ואינטרה - זיהוי interspecific1,2 3, ,4. בידודו של שומנים אלה העור יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים2,3 ,4. יתר על כן, זוחלים רבים, במיוחד squamates (לטאות, נחשים), הן מין פולש של דאגה, מערכות אקולוגיות רגיש, התפתחות מבוסס-פרומון פתיונות לשיפור והסרה של השמנה הוא שוטף5,6. אטימות של עורות של זוחלים מקלה על החילוץ של ליפידים הנוכחי כדי להשיג עקירות יחסית טהורה של מקור שעשויות להיות חזקים של אותות כימיים. השלבים עיקרון לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול שתואר כוללים חילוץ, השומנים הכולל קביעת fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה1,6,7. השיטות שימשו באופן שגרתי כמו הם תשואה מבודד ביואקטיביות להסביר הרבה על חבר הבחירה ואת הבחירה, במיוחד נחשים2.

שומנים בעור יכול להיות מופק או חי העור, העור המחסן, או זוחלים כל מת, באמצעות פולרי או ממיסים אורגניים קוטבית1,7,8,9. יצוין כי דגימות מוזיאון המאוחסן ממיסים כגון אתנול אינם מיטביים על החילוץ של שומנים בעור, פגרי רק טרי או קפוא טרי צריך להיחשב כמקורות אפשריים עבור החילוץ. שומנים בעור שהם מבינים, מה שהופך אותם יציבה על פני השטח של העור, כדי לחלץ7. תפקידיהם איתות זוחלים אקולוגיה, העור השומנים רמזים מופקדים לרוב בסביבות קשות, אך בשל תכונותיהם כימיים חזקים, רמזים כאלה יכולים לשמור על ערכם מידע על פני תקופות ארוכות של זמן10,11 , 12. תהליך החילוץ solubilizes ליפידים, שימוש של ממס פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן) מעל להשרות שעות-לונג, ואחריו האידוי של הממס, לעזוב מסה למדידה של תמצית ליפידים7 , 8. עור שומנים miscible מאוד בממיסים פולרי, מגוון רחב של פחמימנים יכול להיות מופק מערך דומה מגוון של מקורות.

Fractionation היא יותר מאשר חילוץ מפרך אבל מגישה כדי להפריד את תמצית ליפידים הכולל לתוך שברים ספציפי באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, כדי לסייע בזיהוי האפשר וטיהור של תרכובות ובזה1, 6 , 7 , 8. תמצית ליפידים הכולל מאוגד לעמודה מבוססת על המצע, ואז, בודדים eluates ("שברים") של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים בעלות משותפת קוטביות6,7,8. הכרומטוגרפיה השומנים, ההתקדמות שברים קוטביות בחלק סטנדרטית רצף על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) בממס פולרי (בדרך כלל מבוטא כאחוז: 0%, 2% 4% אתר, ועוד. )6,7,8. על פי שיטות כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) יכול לשמש כדי להפריד בין ליפידים תערובת, הם פשוטים יותר, כרומטוגרפיה עמודה הוא מועדף בגלל שהוא משתמש מערכת סגורה, קל לשלוט, יכול עוד נפרד התרכז תערובות ולאחר תואם ריבוב ליעילות. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. במיזמי מחקר רבים המערבים את ניתוקה של סימנים כימיים, המטרה הסופית היא ליצור שינוי ב הקולטים נחשפים רמזים אלה. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע שכל פעילות ביולוגית שהפיק תרכובות ובזה1,2,6,7. במחקר ביולוגי בסיסי, לדוגמה, bioassays באמצעות שברים ספציפי יכול לחשוף לחוקרים כי מקור מטוהרים של פרומונים היה מבודד, אז יכול להיות נרדף שיטות הזיהוי של תרכובות היעד. מנקודת מבט ניהול חיות הבר, זיהוי לא יכול להיות המטרה, במקום זאת, השבר הפעילים יכול לשמש בשטח כדי למשוך בני מינו למלכודות או לעכב את חבר מעקב ב13,גידול הכוללים14.

Protocol

כל הפרוצדורות הכרוכות של חולייתנים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת.

1. חילוץ

  1. לשפוך העור החילוץ
    1. אוספות כ 30 ס מ2 של המחסן זוחל יחיד, הסרת את הראש ואת קטעי cloacal יכול לזהם את הדגימות. יש ללבוש כפפות chloroprene ולנקות את המחסן של פסולת.
    2. להקרע האיזון עם שקית או לשקול את הסירה ולשקול את המחסן (± 0.01 גרם).
      הערה: דיוק מסת נקבעת לפי מידת הדיוק של האיזון. המחסן העור מסה היא הגורם סטנדרטיזציה עבור העור שחולצו השומנים מסה (ראו להלן), covaries באופן משמעותי עם השומנים שחולצו מסה.
    3. להפריד את המחסן לחתיכות קטנות יותר (5 ס מ2) ולהוסיף אותם במיכל sealable זכוכית עם מכסה תואם הקסאן (למשל, צנצנת זכוכית עם מכסה מתכת או בקבוקון מעבדה עם מכסה PTFE). Decant מספיק הקסאן לתוך המיכל מלא ומטביעים את חתיכות עור המחסן. חותם את המכולה.
      התראה: הקסאן הוא דליק, מגרה מערכת הנשימה, והיא קשורה עם מספר קצר - ארוכת הבריאותיות. נהלים הקשורים הקסאן מבוצעות fume הוד (מעבדה) או בחוץ (שדה) תוך כדי ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) (למשל, splash משקפי מגן, כפפות chloroprene, שרוולים ארוכים, פאיתאי).
    4. תווית של container(s) עם עיפרון או עט עמיד הממס. להשאיר את container(s) בשכונה fume ב h לילה או עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.
    5. להסיר את החלקים המחסן באמצעות מלקחיים מתכת נקייה או מלקחיים. לנער את החלקים כדי לשמור על כל הקסאן שנותרו בתוך המיכל. לאפשר את חתיכות עור יבש על נייר; לאחר מכן, נפטר מהם אם מתבצע עקירות מרובות, נקה מלקחיים/המלקחיים בין כל דגימה. כדי לנקות את מלקחיים/המלקחיים, לשטוף אותם ב ~ 50 מיליליטר הקסאן בתוך.
    6. אם התמצית לא אמור לשמש מיד, decant או pipette את התמצית לתוך בקבוקון זכוכית של אמצעי האחסון המתאים, לאטום אותו עם כובע מרופדת PTFE, באותיות, ואחסן אותו ב-20 ° C.
      התראה: כי התמצית מכיל הקסאן, לאחסן את הבקבוקונים במקפיא קילוואט.
  2. חילוץ בעלי חיים מתים לגמרי
    1. תעדו את מימדיו החוטם-אוורור (SVL; בסנטימטרים) מסת (בגרמים) של החיה. אם סה כ שומנים בדם או פרומון לייצור ליחידת שטח העור הוא שיקבע, השתמש מדידה של חייט כדי להשיג את מקסימום הצרת היקפים (בסנטימטרים).
    2. על החילוץ, לבחור מיכל בעל קוטר זה 1/3 אורך של החיה. מקם את הגווייה בצורה מאובטחת בתחתית המיכל בעלת ראש קלואקה למעלה. Decant מספקת הקסאן לתוך המיכל על מנת למקסם את פני השטח המשוקע של הגוף.
      הערה: אם בראש או קלואקה להיות מוסתר עבור כל כמות של זמן החילוץ, שים לב.
    3. לאבטח את המכסה, תווית המיכל, לספוג אותו ברדס fume ב h לילה או עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.
    4. בעת הסרת את הגווייה, להשתמש מלקחיים מתכת נקייה או מלקחיים. שומרים את הקסאן שיורית על הגופה בתוך המיכל על ידי ולאפשר לו לטפטף מהגוף, לא מן הראש או זנב. חותם את המכולה.
    5. אם התמצית לא אמור לשמש מיד, decant את התמצית או pipette אותו לתוך בקבוקון זכוכית של אמצעי האחסון המתאים, לאטום אותו עם כובע מרופדת PTFE, באותיות, ואחסן אותו ב-20 ° C.

2. שומנים מסה נחישות

הערה: השומנים שחולצו מסה יכול להיקבע באחת משתי דרכים: עם בקבוקון זכוכית או עם בקבוקון סיבוב למטה, באמצעות המאדה.

  1. לקבוע את השומנים שחולצו המונית באמצעות השיטה בקבוקון זכוכית.
    1. השתמש בקבוקון preweighed בגודל הרצוי (7 mL, 22 mL, 50 מ ל, וכו '). לכלול את הכובע והתווית המסה הכוללת, או תמיד לשקול את המבחנה ללא והמעיל תווית (סימנים על התווית גם להוסיף מסה). הצב את התווית על הצוואר + בקבוקי שתייה צידניות להימנע ממגע המים.
      הערה: אידוי, צלוחיות זכוכית יעיל אם החוקר יש גישה למערכת סעפת גז איפה בקבוקונים מרובים יכולים להיות התאדו בו זמנית תחת זרם2 N.
    2. להעביר את התמצית המבחנה, באמצעות פיפטה מזכוכית עם דרך הנורה גומי או עבור נפח גדול תמציות, לקונטרולר פיפטה אלקטרונית עם פיפטה מזכוכית חד פעמית 10 מ"ל. לשטוף את המיכל עם ~ 3 מ"ל של הקסאן והעברת למבחנה גם כן.
    3. להתנדף הדגימה תחת זרם2 N עדין. להטות את המבחנה בזווית כדי לאפשר המרבי בשטח הממס. מעובה יהוו מבחוץ של הבקבוקון כפי הקסאן מתאדה.
      הערה: טבעות של השומנים יהוו בבקבוקון כפי הקסאן מתאדה, אז מעת לעת מערבולת החילוץ.
    4. להתאדות המדגם ליובש; אז, reweigh. להקליט את התשואה הכוללת שומנים בדם.
      הערה: לצורך ניתוח על פני קבוצות שונות, לתקנן את השומנים המונית, או לשפוך מסה (מסה השומנים [בגרמים] מחולק במאסה המחסן [בגרמים] x 100 התשואות המסה אחוז השומנים של המחסן) או SVL של החיה (השומנים המוני [במיליגרמים] מחולק SVL [ב ס מ]; התשואות המסה השומנים עבור אורך יחידה). חיות גדולות לייצר יותר שומנים, ויש מינים רבים dimorphic בחום מינית, אשר מטיל הטיה משמעותית בנתונים.
  2. לקבוע את השומנים שחולצו המונית באמצעות המאדה סובב.
    1. אידוי מהיר יותר עבור דגימה בודדת, להעביר את התמצית בקבוקון סיבוב המדרגה preweighed, מתאדים אותו באמצעות המאדה.
      1. אם החלקיקים מורגש תמצית, לסנן את הדגימה על-ידי הצבת קונוס נייר סינון בצוואר + בקבוקי שתייה צידניות; לאחר מכן, להעביר את התמצית הבקבוקון ולאפשר למסנן הכבידה. תשליך נייר הסינון, אחרי התמצית המלא מועבר.
        הערה: להעביר את אמצעי האחסון מדגם (עד נפח הבקבוק ~ 80%) לפני אידוי רוטרי. כל מבעבעים של התמצית לתוך מעבה של המאדה גורם זיהום ודורש את מעבה המנוקה. ניתן להציב מלכודת בליטה בין את הבקבוקון ואת צווארה של מעבה אם בועות או "הקפצת" מתרחשות רוב דגימות.
    2. להפעיל את הכוח לאמבטיה המאייד ואת מים צנטריפוגליות (50 ° C; נמוך יותר מאשר נקודת הרתיחה ממס). הפעל את זרימת מים קרים אל מעבה.
      הערה: הקבל של המאדה מחובר chiller במחזור או spigot בלי מים חמים אוורור לניקוז. קצב הזרימה יכול להיות איטי אם המים הוא קריר יותר תאורת הסביבה, כדי לדחוס את האדים הממס עוזב את הבקבוקון והזנת את הקבל.
    3. הפעל את מקור ואקום (מים ואקום או משאבה). ודא שהלחץ ואקום מספיקה להחזיק את הבקבוק עד צוואר מעבה. פתח האוורור בסוף מעבה לפני שתחבר את הבקבוקון. להחליק את הבקבוקון אל צווארה של מעבה, קרוב האוורור כדי לאטום, ולהבטיח שאת הבקבוק. לא יכול לנתק הקבל הבקבוקון ישוחרר.
    4. . תוריד את הבקבוק עד ~ 50% שקוע באמבטיה. להתחיל את הסיבוב של הבקבוק במהירות בינונית. אם ואקום, מהירות, מעבה הזרימה ואת אמבט טמפרטורה אופטימלית, האדים הממס עוזב את הבקבוקון לדחוס על הסליל, לטפטף לתוך הבקבוק השחזור.
      1. אם המדגם שחין (לדוגמה, בועות גדולות, ההמתה מהירה), להקטין באופן מיידי את אבק ו/או מהירות המאדה. אם הרתיחה נמשכת, לבטל את סיבוב הבקבוק, לבטל את שואב האבק, להעלות את הבקבוקון מן האמבטיה, ולשחרר הואקום. חזור על שלבים 2.2.3 ו 2.2.4.
        הערה: אם אין הממס הוא איסוף בתוך הבקבוק התאוששות, אך התמצית הולכת ונמוגה ללא ספק, הואקום סביר nonoptimal, חייב להיות והשתלב.
    5. להתאדות הדגימה תחת שואב האבק עד ~ 2 מ"ל שרידי ממס ב הבקבוק (תמציות נפח גדול), או, אם בקבוקון preweighed נמצא בשימוש, מתאדים עד חרוז של נוזל עם < בקוטר 1 ס מ מוצגת בתחתית הבקבוק. כבה את הסיבוב ואת ואקום; לאחר מכן, הרימו את הבקבוקון מהאמבטיה.
    6. בצוואר הבקבוק כמו שואב האבק החותם הוא שוחרר; לאחר מכן, לסובב את הצוואר כדי להחליקו הקבל. אם נעשה שימוש בקבוקון נפח גדול, מערבולת תמצית מרוכז בתוך הבקבוק כדי להמיס שומנים גלוי; לאחר מכן, להעביר פתרון באמצעות פיפטה בקבוקון קטן יותר בנפח, preweighed. להוסיף 3 מ"ל של הקסאן לשטוף את הבקבוקון גדולים, מערבולת זה, pipette אותה כדי. הבקבוק קטן יותר של להתאדות שוב (שלבים 2.2.3 - 2.2.5).
    7. החרוז של נוזל תמצית יחזק כפי הקסאן מתאדה. ברגע יבש, לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר. ליפידים יהוו לבן שקוף, כדי שעווה צהובה ב הבקבוק (~ 5 דקות). שוקלים את הבקבוק כדי להשיג את המסה הסופית.
      הערה: בהתאם לאופי ליפידים חילוץ, יהיה להם מוצק (למשל, שעווה) או מאפייני חצי קשות (למשל, נפט גולמי), במיוחד כאשר שומנים fractionated הם התאדו (ראה להלן).
  3. Solubilize ליפידים בהיקף מוקלטות הקסאן להניב ≥1 מ"ג של השומנים לכל 1 מ"ל של הקסאן. ~ 5 מ"ל שאמצעי האחסון לעבוד עבור ומתחזקים כרומטוגרפיה. אם העברת את הבקבוק כדי בקבוקון, שומרים על 2 מ"ל מהנפח הכולל לשטוף את הבקבוקון לאחר העברת רוב התמצית למבחנה.
  4. תווית הבקבוקונים, לאטום אותם עם אותיות מצופה PTFE, ואחסן אותם ב-20 ° C.

3. עמודות כרומטוגרפיה

הערה: כדי להפריד תרכובות לא ידוע המבוסס על קוטביות לתוך שברים ספציפיים, השומנים שחולצו בנפח גדול יכול להיות עמודות שנוספו מוכן כרומטוגרפיה נוזלית, fractionated באמצעות • תנאי סטנדרטי.

  1. הכנה של העמודה
    1. בהתאם המסה השומנים ב התמצית, להשתמש או גדול - או עמודה כרומטוגרפיה זכוכית בנפח מצומצם עם צימוד טפלון. העמודה מצויד או דבוקה מאגר בנפח קבוע (500 mL עבור עמודה גדול; 250 מ עבור עמודה קטן). מעתה ואילך, פרוטוקול זה רק מפנה לעמודה בנפח גדול כרומטוגרפיה דבוקה מאגר. ניקוי יסודי של כל כלי זכוכית חדשה, חלקים כדי לשמש הכרומטוגרפיה כמתואר בסעיף 4; לאחר מכן, לשטוף אותם עם הקסאן או אחר ממס פולרי.
    2. מקפלים פיסת פיברגלס צמר (~ 14 ס מ אורך [L] x 4 ס"מ רוחב [W]) מספר פעמים עד נוצר ריבוע של ~ 4 ס"מ על 4 ס"מ. השתמש מוט עץ פינים יותר העמודה למיקום של פיברגלס בחלק התחתון של העמודה.
    3. אבטח את העמודה ברדס אל דוכן טבעת רגילה עם שני תופסנים (למשל, סיבוב או מודולרי), האחד מעל צימוד ואחד מתחת לצוואר של המאגר. רמת העמודה. מקם את העמודה בגובה כדי לאפשר ומרחק עבודה מספקת עבור כשהספל 500 מ"ל להתאים בקלות תחת העמודה. פתח את צימוד.
    4. יציקת ונייבש חול לתוך העמודה, עד ~ 3 ס מ של חול מונח מעל פיברגלס. מניחים נייר שחור או כהה תחת העמודה והקש אותו בעדינות. אם חול נופל מן העמודה עם כל ברז, המכשול פיברגלס אינה מספיקה. חזור על שלבים 3.1.2 - 3.1.4.
      הערה: השתמש של מהדק פרש מודבק בסוף מוט פינים להביא את פיברגלס מלמטה.
    5. מקם את הספל 500 מ"ל תחת העמודה. לאט לאט decant ~ 25 מ ל הקסאן גביע 100 מ ל או משורה לתוך המאגר עמודה להרטיב את החול. סגור את צימוד כאשר יש ~0.5 ס מ הקסאן מעל החול.
    6. שוקלים לצאת אלומינה נייטרלי. עבור כל עמודה קטנות, השתמש ~ 50 גרם; ~ 175 g עבור כל עמודה גדול. שופכים את אלומינה לתוך בקבוקון Erlenmeyer 1 ליטר. מגבלת 400 גרם של אלומינה לכל בקבוק 1 ליטר.
    7. כדי להפעיל את אלומינה (פעילות השלישי), פיפטה מים יונים של אמצעי אחסון שווה ל- 6% אלומינה מסה (כלומר, עבור 100 גרם של אלומינה, להוסיף 6 מ של מים). להוסיף את המים כמו טיפות לאורך אלומינה.
    8. מכסים את הבקבוק עם רדיד אלומיניום או פקק. נמרצות מערבולת (אל תלחץ) להתפזר באופן אחיד את המטען. ממשיכים עד אין גושים גלוי להישאר.
      הערה: הבקבוקון חם, כמו המים מגיב אלומינה, אשר היה צפוי.
    9. הוסף הקסאן עד אלומינה מכוסה לגמרי, עם ~0.5 ס מ הקסאן מעל אלומינה. מערבולת את הבקבוק כדי ליצור של slurry.
    10. מניחים משפך פרקו במאגר המים העמודה ואת גביע זכוכית 500 מ"ל מתחת לעמודה. פתח את צימוד. מערבולת של אלומינה, בהתמדה ותשפכי לתוך העמודה. ודא אלומינה יורדת באופן שווה את העמודה, אין בועות גדולות או סדקים יוצרים בעמודה אלומינה. טפח בעדינות את הצד של העמודה להתיישב באופן שווה את אלומינה.
      הערה: יש להוסיף הקסאן נוספים עבור נשפך נוספים, כדי לשמר את slurry. הקסאן איסוף במיכל תחת העמודה חוזר אם כשהספל זכוכית נקי בתחילתו.
    11. העמודה נוצר כאשר החלק העליון של אלומינה קשה ויציב ~ 4 ס מ מתחת לצוואר של העמודה בבסיס של המאגר. השתמש פיפטה כדי לשטוף את החלק הפנימי של המאגר עם הקסאן לקבלת אלומינה שיורית. באמצעות משפך, להוסיף בעדינות שכבה נוספת של חול על גבי התרכובת אלומינה, ~ 1 ס מ מתחת למאגר.
      הערה: הקסאן יזרום מן העמודה צימוד נותרת פתוחה. אל תתנו את העמודה להתייבש. אם העמודה תתייבש התהליך חייבת להתחיל שוב, מתחיל שלב 3.1.2. הפרוטוקול ניתן לעצור כאן אם העמודות מוכנים יום לפני fractionation. בחוזקה למקם פקק בחלק העליון של המאגר או לכסות את זה היטב עם נייר כסף. למלא את האגם ~ 100 מיליליטר הקסאן. להדק את צימוד.
  2. Fractionation של תמצית ליפידים
    הערה: ללא קשר לגודל העמודה, שברים של תמצית ליפידים ניתן לאסוף באופן אינדיבידואלי ולהשתמש איחדו מבוסס על הקוטביות שלהן שבר או שנמחקו לחלוטין אם הם אינם מכילים תרכובות היעד מזוהה/ידוע לכל. סבבי • תנאי שכפל (n = 3 כרכים) עברו את העמודה כדי להבטיח את • תנאי מספיק של ליפידים. לפי טבלה 1 עבור עמודות גדולות • תנאי (עם תמצית מסה > 30 מ"ג) או עמודות קטן • תנאי (עם תמצית המוני < 30 מ"ג). פרוטוקול • תנאי המותאמים לבידוד רק מתיל קטונים הוא בטבלה מס ' 2.
    1. הסר את הקסאן שנותרו בחלק העליון של העמודה, באמצעות פיפטה נפח גדול, או לאפשר את הקסאן לטפטף החוצה לתוך גביע נקי. השאר ~ 3 מ"ל של הקסאן מעל החול בחלק העליון של העמודה.
      הערה: הקסאן שנאספו הוא טהור, אם זה רק יצר קשר עם כלי זכוכית נקי ולא ניתן למחזר ב השבר הראשון.
    2. להעביר את תמצית ליפידים העמודה, באמצעות פיפטה מזכוכית ארוכה. לאט לאט pipette את תמצית כדי שלא להפריע למטופלים שכבת חול. לשטוף את בקבוקון תמצית או הבקבוק עם ~ 5 מיליליטר הקסאן והעברתה לעמודה.
      הערה: אם התמצית היה מאוחסן ב-20 ° C, ליפידים להיות זירז. לחמם את הצנצנת עד אין יותר התמיסה יהיה גלוי.
    3. לפתוח את צימוד ולאפשר את הדגימה לטעון לתוך העמודה. אם התמצית יש גידול גדול (> 30 מ"ג), להקה צהבהב עשויים להיות גלויים באלומינה, מתחת החול בחלק העליון. לאסוף את הזרימה בתוך פסולת ככל הקסאן הזה כבר לא נקי. סגור את צימוד כאשר ~ 3 מ"ל נשאר על גבי החול.
      התראה: השומנים בהתמצית, עכשיו קשור את אלומינה והעמודה, לא יכול להתייבש, או הדגימה יאבדו.
    4. הצב preweighed ומתויגים סיבוב המדרגה בקבוקון (100 מ ל, 250 מ ל או 500 מ"ל) מתחת לעמודה לפני לשפוך את השבר הראשון. שברים להימחק ניתן לאסוף בתוך מיכל זכוכית.
    5. להכין את השבר הראשון (100% הקסאן: 0% דיאתיל אתר [עד כה, "אתר"]) ב משורה. אם מכינים שברים מראש, לכסות עם נייר כסף או פקק עם הפקק.
      הערה: שברים התקדמות קוטביות; לכן, הצילינדר לא צריך לשטוף בין שברים.
    6. הוסף השבר הראשון למאגר המים על ידי שפיכת באמצעות משפך זכוכית פרקו מופנות לצד של המאגר כדי למנוע הפרעה שכבת חול. פתח את צימוד להתחיל את • תנאי. סגור את צימוד כאשר ~ 3 מ"ל של הקסאן נשאר מעל החול בחלק העליון של העמודה.
      הערה: לעולם לא תפסיק של • תנאי בתוך שבר בודדים על-ידי סגירת של צימוד לפני הנאספים את רוב eluate- בין שברים, אין להשאיר את צימוד סגור יותר מ ~ 1 h בגלל עיכובים יכול לשנות את האיכות ואת הדיר של • תנאי.
    7. חזור על שלבים 3.2.4 - 3.2.6 לשברים 2 ו- 3. לאסוף את השברים במבחנות בגודל מתאים לאפשר קראוון על אידוי סיבוביים, במיוחד אם הם להיות איחדו את השברים.
    8. להכין שבריר הרביעי (2% אתר) והוספתו למאגר המים. למקם את הבקבוק הבא תחת העמודה, לפתוח את צימוד, ולאסוף את השבר הרביעי. להכין שבריר החמישי; לאחר מכן, המשיכו לפי הצורך.
      הערה: זה אפשרי מתמוססות הראשון fraction(s) באמצעות רוטרי אידוי תוך איסוף השברים רצופים.
    9. להכנת שברים לשימוש ב- GC-MS ניתוחים, להשיג מסה שבר באמצעות איזון דיוק 0.01 או 0.1 מ ג. Solubilize שברים השומנים להניב 1 מ ג של השומנים לכל 1 מ"ל של הקסאן.

4. ניקוי

  1. להשאיר את צימוד פתוח, היפוך העמודה כשהספל פסולת. אלומיניום אוקסיד והחול יפעל מתוך הטור; לחלופין, לנער כדי לזרז את התהליך. השתמש מוט פינים להביא את הצמר פיברגלס אם זה תקוע (להימנע מגרד זכוכית) או מכבים אותה עם זרם2 N.
  2. Dissemble ולנקות כל כלי זכוכית, באמצעות מעבדה-כיתה דטרגנט במים חמים באמבטיה פלסטיק עם מברשת כלי זכוכית (עם השיער או זיפים פלסטיק). רחץ 3 x. לשטוף היטב עם הרבה מים חמים עד הכוס היא כבר לא סליק למגע.
  3. לשטוף את כלי זכוכית וכלים 3 x עם מים יונים. למקם אותם על מתלה כדי מילה נהדרת... כדי להאיץ הייבוש, להוסיף נפח קטן של אצטון (3 מ ל) את כלי הזכוכית, מערבולת, ולאפשר לו מילה נהדרת או לבדוק את זה תחת זרם2 N.

Representative Results

מיצוי הבאים, את השומנים סה כ המסה הוא הסוג הראשון של נתונים שניתן לרכשה באמצעות פרוטוקול המובאת כאן. עם זאת, ערכי המונים השומנים הכולל צריך מעולם לא ניתח בלי קצת ניסיון כדי לתקנן את הערכים שהושג. מספר גישות יכול לשמש, אך אנו ממליצים גם אחידות המסה השומנים שחולצו SVL של החיה (בסנטימטרים) או המסה של העור המחסן שהופק. בתוצאות לשעבר ערך השומנים-מסה-לכל-אורך, והשני יהיה שיעור של מקור המוני. הסיבה התקינה זה כי חיות גדולות באופן טבעי לייצר יותר שומנים בעור כי יש אזור רחב יותר של פני שטח העור הכולל. איור 1A מדגימה את הקשר הזה, איפה לשפוך שחולצו בעור השומנים מסת המשקל באופן ליניארי עם המסה של העור שחולצו. ברגע סטנדרטית המחסן הכולל העור למסה, הקשר הליניארי הזה הוא לגמרי הוסר (איור 1B).

בעקבות fractionation, אותה גישה התקינה יכולה לשמש עם ההמונים שברים בודדים (איור 2). זה מוגדר נתונים לדוגמה, כל שבר לא תורמת באופן שווה השומנים שחולצו סה כ המסה: ליפידים נייטרלי (שברים 1-3) הם הקבוצה הדומיננטית של תרכובות על ידי המוני פרופורציה בהשוואה לכל קבוצה של ליפידים קוטביים יותר (שברים 4-6 7-9, 10-12).

Figure 1
איור 1: קשרי הגומלין בין חילוץ השומנים מסה ו קלט חומר. (א), זוחלים, היחסים בין הצריף הכולל עור מסה ו את השומנים שחולצו בעור מסה בקורלציה (P < 0.001). (B) כאשר השומנים שחולצו בעור מסה יתוקנן הכולל לשפוך מסה (השומנים המוני מחולק לצריף המונית), הקשר הזה כבר לא קיים (P = 0.46). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סטנדרטית ההמונים שבר בעקבות • תנאי. באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, תמציות השומנים העור יכול להיות eluted לתוך שברים, המבוססת על תרכובת קוטביות. השבר בנפח גדול, ואז, מתבטא ביחס של התמצית סה כ שומנים בדם (שבר המוני [במיליגרמים] מחולק במאסה תמצית ליפידים הכולל [במיליגרמים) כדי לקבוע את ההבדלים בין שברים או ניסיוני קבוצות8. העמודות מסמנות את האמצעים. השגיאה העליון הוא SEM; השגיאה התחתון הוא 95% CI. נקודות נתונים נפרדים ניתנים עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג כרומטוגרפי גז מתיל קטון שברים. (א) עם • נאות תנאי, מתיל קטונים הם תרכובות הנפוץ ביותר של שבר 7 בטבלה 2, ניתן לראות זוגות מחורזים של פסגות (זמן השמירה = 24-34 דקות). שבר (B) 6 בטבלה 2, עם זאת, רק התשואות תרכובות nontarget. זו אותה תוצאה יכולה להתרחש כאשר הממס קוטביים בשימוש בשלב ניידים שפג תוקפו או אם העמודה מופסק במשך פרקי זמן ארוכים (> 1 h) בין שברים. שים לב להבדל בשפע מולקולרי בין שתי העיקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שבר הקסאן (mL) דיאתיל אתר (מ)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29.4] 2 [0.6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1.2]
10,11,12 92 [27.6] 8 [2.4]
13,14,15 84 [25.2] 16 [4.8]

טבלה 1: אמצעי אחסון • תנאי סטנדרטי עבור העור השומנים fractionation. אמצעי אחסון הממס ואחוזים ניתנות-נפח גדול (למשל, 250 מ ל) וגם [בנפח מצומצם] (למשל, 100 מ ל) כרומטוגרפיה עמודות באמצעות אלומינה (פעילות השלישי). הקסאן הוא הממס המוביל; דיאתיל אתר הוא השלב ניידים.

שבר הקסאן (mL) דיאתיל אתר (מ) הערות
1, 2, 3 30 0 elute; לא אוספים
4, 5 28.8 1.2 elute; לא אוספים
6, 7, 8 28.8 1.2 לאסוף בנפרד; רוב של מתיל קטון מסה יהיה שבר 7; בדיקות בקרת איכות GC-MS צריכה לפעול ב-6 וב-8 כדי להבטיח נכונה • תנאי של קטונים

בטבלה 2: • תנאי ששונתה שיטת נחש בירית מתיל קטונים. אמצעי אחסון אלה מיועדים לשימוש עם עמודה בקבוקים בנפח מצומצם, עם המותג של אלומינה זמין כרגע. השבר eluted חיובי עבור מתיל קטונים יש bioactivity חזקה של מבחני שדה עם פראי, החיזור הזכר בירית נחשים1,7. כדי לאשר את הנוכחות של מתיל קטונים שברים היעד, דוגמאות ניתן לדלל כדי 1 מ"ג/מ"ל וניתח באמצעות GC-גב' איור 3 מספק chromatograms נציג לקבלת תוצאות חיוביות וגם שליליות בעקבות • תנאי.

Discussion

ניתן להחיל החילוץ של העור שומנים ב זוחלים העור חי או מת, בנוסף המחסן העור, אשר מציע צדדיות ביישום ניסיוני של טכניקה זו. יתרה מזאת, עקירות של שומנים בעור יכול להיעשות בשטח, כדי לאפשר יישום דינמי של השיטה למגוון רחב של ביולוגים2,13. מיצוי של שומנים בעור היא פשוטה; לכן, זה קל לשנות את קנה המידה עקירות כנדרש לכל ניסוי או עיצוב, המתרגלים לא צריך מומחיות משמעותי לביצוע השיטות. מקדמי המגביל היחיד אולם שינוי קנה המידה הם הזמינות של fume הוד שטח, שפע של כלי זכוכית נקי, sealable, ושטח אחסון הממס.

העור השומנים תמצית fractionation יכולים להיות מותאמים לצרכים של חוקר ו, לכן, יש גמישות דומה שאיבת שומנים בדם. לדוגמה, ליפידים ניטראלי יכול להיות eluted, ואז נמחק, כתוצאה מכך בחלקים למטרה לטהר תרכובות של עניין או לפשט bioassays. Fractionation יכול להתבצע על קשקשים מרובות בתוך ועל -פני השומנים דגימות. לדוגמה, עמודות מרובות ניתן להפעיל בו זמנית כדי לייעל את התהליך. או, רק על חלק תמצית ליפידים הכולל יכול להיות fractionated על עמודה קטן לחוס, לפיכך, ריאגנטים וזמן. Fractionation מוגבל בעיקר על-ידי המסה של תמצית ליפידים הכולל את מידת הדיוק של הציוד לרשות החוקר. לדוגמה, אם החוקר יש איזון עם דיוק 10.0 מ ג, הקביעה של השבר מסה ו, לכן, הדיוק של הכנת דגימה לניתוח GC-MS באופן משמעותי, אם לא לגמרי, מופרעת. אותו דבר נכון גם לגבי כלי הזכוכית. אם החוקר יש עמודה בנפח גדול עבור fractionation אבל יש מסה השומנים הכולל קטן כדי להפריד, • תנאי או הפרדה של תרכובות יתפתחו אך ידרוש בזבוז משמעותית של ממיסים, ריאגנטים, זמן, באופן פוטנציאלי, המטרה תרכובות עצמם.

מומלץ לבצע בדיקה בקרת איכות לפני שתקבעו את ערכת • תנאי, כפי שניתן לראות בטבלה מס ' 2, ולהחליט מה שברים ייתכן ימחקו. כדי לאשר את • תנאי של ליפידים הרצוי, עמודה יכול להיות בניהול איפה כל שבר, 1-15, הוא אסף בנפרד ולאחר מכן נותחו באמצעות GC-MS. איור 3, נציג שמוצאים עקבות להראות מתיל קטונים מ בירית נחשים elute רק מהעמודה בשבריר ספציפיים. על ידי ביצוע שלב בקרת איכות, ערכה ששונה • תנאי יכול להיות מפותח זן מסוים להבטיח מקסימום תשואה של תרכובות של עניין. שינויים החומרים, כגון ספק או הרבה אלומינה או גיל דיאתיל אתר, תגרום בהחלט הבדלים • תנאי זה צריכה להיות נשלטת על-ידי ביצוע מבחן בקרת איכות.

מהטכניקות שתוארו מוגבלים בעיקר על ידי הטבע כימי של המקלות שניתן להשיג. בעיקר, שיטות אלה מאפשרות רק החוקרים לבודד ולהפריד שומנים ארוכי שרשרת מן העור של זוחלים. מינים רבים של זוחלים השתמש ברמזים באוויר ו/או proteinaceous כמו אותות כימיים, השיטות המתואר אינם תואמים עם בידוד רמזים אמר. ממיסים עוד, פולרי לא לחלץ רמזים מימית המשטחים של זוחלים או מקורות של התצהיר הסימן (למשלמים בכלוב, פלומות, המצע מימיים) שעשויים להכיל אכן שופע אותות כימיים. שיטות המתאימות עבור לכידת סוגים אלה של רמזים עומדים לרשות החוקרים (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME] רמזים נדיף ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים [HPLC] למקלות מימית), למרות, כמו השיטות כמתואר לעיל, יש עקומת למידה טכנית.

והכי חשוב, השירות של תערובת כימי הסופי כדי החוקר צריך מדריך בין השיטות. לדוגמה, אם חוקר רוצה לדעת אם חיית מוקדי זכר יכול להבחין בין המקלות המיוצר על ידי זכר מול נקבה בני מינו ב bioassay יישוב, החילוץ היא שהשיטה היחידה צריכה2,3. אם הזיהוי של תרכובות dimorphic מינית היא המטרה, אולם, התמצית חייב להיטהר, כדי לאפשר ביטחון רב יותר בנתינת ההזדהויות מולקולות ספציפיות או לקבוצות של מולקולות דרך ניתוח כימי1, 6,9,11. עם זאת, אפילו לערוך בדיקות עם מקור השומנים, מסה משמעותית של החל תמצית נדרש כדי שבר מדיד מיסות ניתן להשיג; אחרת, איגום של דגימות יכול להיות נרדף אך אינה אופטימלית14.

התפתחויות עתידיות של פרוטוקול זה כוללים אמצעים כדי לנצל ולהתאים את ההליך עבור מינים יותר הזוחלים. שיטות נוספות שבהן לא פולשנית של חילוץ שומנים בעור גם מפותחים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

פיתוח שיטות אלה, במיוחד המחסן העור השומנים החילוץ, אירעה במהלך הסכמי שיתוף פעולה (14-7412-טאוב למדעי המחשב-CA, 15-7412-1155-CA ו 16-7412-1269-קה) בין ג'יימס מדיסון האוניברסיטה (JMU) חיה החקלאות האמריקאי של צמח הבריאות פיקוח שירות (APHIS). M.R.P. על תרומתם של התלמידים הבאים להתפתחות של השיטות העור המחסן: ס' פאטל (וושינגטון ו- Lee האוניברסיטה [WLU]), ג'יי. יכול (WLU), ר' פלורס (JMU), ג'יי נול (JMU) ו ס אשטון (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245, (4915), 290-292 (1989).
  2. Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196, (10), 729-749 (2010).
  3. Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
  4. Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36, (3), 185-206 (2015).
  5. Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59, (2), 141-149 (2013).
  6. Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44, (2), 189-197 (2018).
  7. Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
  8. Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35, (10), 1234-1241 (2009).
  9. Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215, (5), 723-730 (2012).
  10. Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
  11. Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10, (6), e0131492 (2015).
  12. Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32, (2), 566-580 (2018).
  13. Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5, (3), 405-409 (1998).
  14. Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
  15. Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42, (11), 1164-1174 (2016).
בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter