सरीसृप में, विशिष्टताओं से त्वचा लिपिड यौन संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं, इनवेसिव प्रजातियों के प्रबंधन में संभावित उपयोग के साथ । यहाँ, हम शेड त्वचा या पूरे जानवरों से त्वचा लिपिड निकालने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, कुल लिपिड द्रव्यमान का निर्धारण और विश्लेषण, और स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से भिन्नीकरण का उपयोग कर लिपिड को अलग.
सरीसृप उनकी त्वचा में लिपिड का उपयोग कर विशिष्ट करने के लिए संकेत, मुख्य रूप से मेट ट्रैकिंग और मूल्यांकन सक्षम करने के लिए । इन लिपिड के अलगाव विकासवादी पैटर्न और रासायनिक संचार के तंत्र पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान में उपयोगिता है, स्थलीय जीवन के विकास में लिपिड की पनरोक भूमिका को समझने के अलावा । एक लागू दृष्टिकोण में, ऐसी त्वचा आधारित cues इनवेसिव प्रजातियों के साथ निपटने के वंयजीव प्रबंधकों के लिए संभावित उपयोग किया है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में साँप त्वचा लिपिड को बढ़ाता है के लिए मुख्य कदम निष्कर्षण, कुल लिपिड दृढ़ संकल्प, और कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से भिन्नीकरण, उत्तरार्द्ध प्रक्रिया यौगिकों जो तब कर सकते हैं की शुद्ध eluates में जिसके परिणामस्वरूप के लिए शामिल या तो यौगिक पहचान (जैसे, गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री [जीसी-MS]) और/या और अधिक परिष्कृत परख में सीधे इस्तेमाल किया आवंटित करने के लिए विश्लेषण किया जा । त्वचा लिपिड रहने वाले त्वचा से निकाला जा सकता है, त्वचा, या मृत पूरे जानवरों शेड, ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, hexane, बेंजीन, टोल्यूनि) का उपयोग कर । निष्कर्षण लिपिड solubilizes और, तो, विलायक एक औसत दर्जे का लिपिड ही निकालने उपज के लिए सुखाया जा सकता है । आंशिक पारंपरिक कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से विशिष्ट eluates में कुल लिपिड निकालने की जुदाई शामिल है । कुल लिपिड निकालने पहले एक सब्सट्रेट आधारित स्तंभ के लिए बाध्य है (जैसे, एल्यूमिना) और, फिर, व्यक्तिगत eluates (“भिन्न”) विलायक के विशिष्ट खंडों पर क्रमिक रूप से पारित कर रहे हैं स्तंभ के माध्यम से लिपिड मिश्रण से यौगिकों के elute सेट करने के लिए आम ध्रुवीयता के आधार पर । ध्रुवीय विलायक में ध्रुवीय विलायक (जैसे, diethyl ईथर) के सापेक्ष राशि को बढ़ाने के द्वारा एक मानकीकृत अनुक्रम में अंश प्रगति । इस पांडुलिपि में, हम सरीसृप के त्वचा लिपिड निकालने के लिए कई तरीकों का वर्णन और, फिर, ध्रुवीयता के आधार पर यौगिकों के विभिन्न सेट अलग करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर. पूरे लिपिड निष्कर्षों या विशिष्ट भागों, तो, परख में इस्तेमाल किया जा सकता है किसी भी जैविक यौगिकों उसमें से जुटाया गतिविधि निर्धारित करते हैं ।
सरीसृप एपिडर्मिस में लिपिड का उत्पादन, या तो सीधे त्वचा कोशिकाओं से या असतत ग्रंथियों कि सामाजिक संचार में उपयोग किया जाता है से, जैसे मेट मूल्यांकन और ट्रैकिंग, territoriality, और अंतर और विशिष्ट पहचान1,2 ,3,4. इन त्वचा लिपिड के अलगाव विकासवादी पैटर्न और रासायनिक संचार के तंत्र पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान में उपयोगिता है, स्थलीय जीवन के विकास में लिपिड की पनरोक भूमिका को समझने के अलावा2,3 ,4. इसके अलावा, कई सरीसृप, विशेष रूप से squamates (छिपकली, सांप), संवेदनशील पारिस्थितिकी प्रणालियों में चिंता की इनवेसिव प्रजातियों हैं, और फेरोमोन के विकास आधारित lures को फँसाने में सुधार और हटाने चल रही है5,6। साँप त्वचा की पारगम्यता रासायनिक संकेतों का एक संभावित मजबूत स्रोत के अपेक्षाकृत शुद्ध निकालने प्राप्त करने के लिए वर्तमान लिपिड के निष्कर्षण की सुविधा । वर्णित प्रोटोकॉल में साँप त्वचा लिपिड को बढ़ाता है के लिए सिद्धांत कदम निष्कर्षण, कुल लिपिड दृढ़ संकल्प, और कॉलम क्रोमैटोग्राफी1,6,7 के माध्यम से अंश शामिल हैं । तरीकों नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे सक्रिय उपज अलग है कि दोस्त पसंद और चयन के बारे में ज्यादा समझाने की, विशेष रूप से सांप2में ।
त्वचा लिपिड या तो रहने वाले त्वचा से निकाला जा सकता है, शेड त्वचा, या मृत पूरे सरीसृप, का उपयोग कर ध्रुवीय या ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स1,7,8,9। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संग्रहालय ऐसे इथेनॉल के रूप में सॉल्वैंट्स में संग्रहित नमूनों त्वचा लिपिड की निकासी के लिए इष्टतम नहीं हैं, और केवल ताजा या हौसले से जमे हुए लावे निष्कर्षण के लिए संभव स्रोतों के रूप में माना जाना चाहिए । त्वचा लिपिड निष्क्रिय है, जो उंहें त्वचा की सतह और7निकालने के लिए आसान पर स्थिर बनाता है । साँप पारिस्थितिकी में उनके संकेत भूमिकाओं में, त्वचा लिपिड cues अक्सर कठोर वातावरण में जमा कर रहे हैं, लेकिन उनके मजबूत रासायनिक गुणों की वजह से, ऐसे cues समय की लंबी अवधि में अपनी जानकारी के मूल्य को बनाए रखने कर सकते हैं10,11 , 12. निष्कर्षण प्रक्रिया लिपिड solubilizes, एक घंटे से अधिक लंबे समय सोख, विलायक के वाष्पीकरण के द्वारा पीछा किया एक गैर-ध्रुवीय विलायक (जैसे, hexane, बेंजीन, टोल्यूनि) का उपयोग कर, लिपिड निकालने के एक औसत दर्जे का मास छोड़ने के लिए7 , 8. त्वचा लिपिड में अत्यधिक मिश्रणीय है, और हाइड्रोकार्बन की एक विस्तृत श्रृंखला के सूत्रों के एक इसी तरह विविध सरणी से निकाला जा सकता है ।
भिन्नीकरण निष्कर्षण से अधिक श्रमसाध्य है, लेकिन स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से विशिष्ट भागों में कुल लिपिड निकालने के लिए अलग करने के लिए कार्य करता है, शुद्धीकरण और यौगिकों के संभावित पहचान में सहायता करने के लिए उसमें1, 6 , 7 , 8. कुल लिपिड निकालने एक सब्सट्रेट आधारित स्तंभ के लिए बाध्य है, और फिर, व्यक्तिगत eluates (“भिन्न”) विलायक के विशिष्ट खंडों पर क्रमिक रूप से पारित कर रहे हैं स्तंभ के माध्यम से लिपिड मिश्रण से यौगिकों का elute सेट है कि एक आम ध्रुवीयता6,7,8. लिपिड क्रोमैटोग्राफी में, ध्रुवीय विलायक (आमतौर पर एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया: 0%, 2%, 4%ईथर, आदि के सापेक्ष राशि में वृद्धि के द्वारा कुछ मानकीकृत अनुक्रम में भिन्नता में ध्रुवीकरण की प्रगति . )6,7,8. हालांकि पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) जैसे तरीकों को एक मिश्रण में लिपिड अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सरल कर रहे हैं, कॉलम क्रोमैटोग्राफी क्योंकि यह एक बंद प्रणाली का उपयोग करता है पसंद है, को नियंत्रित करने के लिए आसान है, और अधिक केंद्रित मिश्रण अलग कर सकते हैं, और के साथ संगत है division for कार्यकुशलता. इस पांडुलिपि में, हम सरीसृप के त्वचा लिपिड निकालने के लिए कई तरीकों का वर्णन और, फिर, ध्रुवीयता के आधार पर यौगिकों के विभिन्न सेट अलग करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर. कई अनुसंधान रासायनिक cues के अलगाव को शामिल परियोजनाओं में, अंतिम लक्ष्य के लिए उन cues को उजागर रिसीवर में परिवर्तन प्रभाव है । पूरे लिपिड निष्कर्षों या विशिष्ट भिन्न कर सकते हैं, तो, परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए किसी भी जैविक यौगिकों में यह1,2,6,7से संनिहित गतिविधि का निर्धारण । बुनियादी जैविक अनुसंधान में, उदाहरण के लिए, विशिष्ट भागों का उपयोग कर परख शोधकर्ताओं को पता चलता है कि pheromones के एक शुद्ध स्रोत अलग किया गया है सकते हैं, और फिर, लक्ष्य यौगिकों की पहचान के लिए तरीकों को आगे बढ़ाया जा सकता है । एक वंयजीव प्रबंधन के नजरिए से, पहचान लक्ष्य नहीं हो सकता है, और इसके बजाय, सक्रिय अंश क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है करने के लिए जाल या देशी निवास स्थान13,14में ट्रैकिंग दोस्त को बाधित करने के लिए विशिष्टताओं को आकर्षित ।
सरीसृप में त्वचा लिपिड के निष्कर्षण रहने या मृत त्वचा के लिए लागू किया जा सकता है, त्वचा शेड के अलावा, जो इस तकनीक के प्रायोगिक आवेदन में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है । इसके अलावा, त्वचा लिपिड के निष्कर्षण क्षेत्र में किया जा सकता है, जीव2,13की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विधि के एक गतिशील आवेदन को सक्षम करने के लिए । त्वचा लिपिड निष्कर्षण सरल है; इसलिए, यह आसान है के रूप में प्रयोग या डिजाइन प्रति जरूरत के लिए निकालने के लिए, और चिकित्सकों महत्वपूर्ण विशेषज्ञता के तरीकों को क्रियांवित नहीं की जरूरत है । ऊपर स्केलिंग के लिए ही सीमित कारक धुएं हूड अंतरिक्ष की उपलब्धता, स्वच्छ, सील कांच के बाहर का एक बहुतायत के, और विलायक भंडारण अंतरिक्ष के लिए कर रहे हैं ।
त्वचा लिपिड निकालें भिन्नीकरण एक शोधकर्ता की जरूरत के अनुरूप किया जा सकता है और, इसलिए, लिपिड निष्कर्षण करने के लिए समान लचीलापन है । उदाहरण के लिए, तटस्थ लिपिड eluted और फिर खारिज कर दिया जा सकता है, लक्ष्य भागों में परिणाम है कि ब्याज की यौगिकों शुद्ध या परख सरल हो सकता है । भिन्नीकरण के भीतर और लिपिड नमूनों के पार कई तराजू पर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रक्रिया को अधिक कुशल बनाने के लिए एकाधिक स्तंभों को एक साथ चलाया जा सकता है । या, केवल एक कुल लिपिड निकालने के एक हिस्से के लिए एक छोटे से स्तंभ पर fractionated जा सकता है, इस प्रकार, स्पेयर रिएजेंट और समय. आंशिक रूप से कुल लिपिड निकालने के द्रव्यमान और शोधकर्ता के लिए उपलब्ध उपकरणों की परिशुद्धता द्वारा सीमित है । उदाहरण के लिए, यदि शोधकर्ता एक १०.० मिलीग्राम परिशुद्धता के साथ एक संतुलन है, अंश द्रव्यमान का निर्धारण और, इसलिए, जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी की सटीकता काफी है, नहीं तो पूरी तरह से, बाधा । एक ही कांच के नीचे के लिए सच है । यदि शोधकर्ता अंश के लिए एक बड़ी मात्रा स्तंभ है, लेकिन एक छोटे से कुल लिपिड अलग करने के लिए जन है, इस रेफरेंस या जुदाई यौगिकों की प्रगति होगी, लेकिन सॉल्वैंट्स, रिएजेंट, समय की एक महत्वपूर्ण अपव्यय की आवश्यकता होगी, और संभावित, लक्ष्य यौगिकों स्वयं ।
यह सलाह दी जाती है कि रेफरेंस स्कीम का निर्धारण करने से पहले गुणवत्ता नियंत्रण जांच कर लें, जैसा कि तालिका 2में देखा गया है, और तय करें कि किन अंशों को छोड़ा जा सकता है । वांछित लिपिड के रेफरेंस की पुष्टि करने के लिए, एक कॉलम चलाया जा सकता है, जहां प्रत्येक अंश, 1-15, व्यक्तिगत रूप से एकत्र किया जाता है और फिर GC-MS का उपयोग कर विश्लेषण । चित्रा ३में प्रतिनिधि गैस chromatograph निशान दिखाते हैं कि गेटिस साँपों से मिथाइल ketones एक विशिष्ट अंश में स्तम्भन से ही elute. इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करके, एक संशोधित रेफरेंस स्कीम ब्याज की यौगिकों की अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए एक दी गई प्रजातियों के लिए विकसित किया जा सकता है । सामग्री में परिवर्तन, इस तरह के आपूर्तिकर्ता या बहुत एल्यूमिना या diethyl ईथर की आयु के रूप में, बिल्कुल रेफरेंस में अंतर है कि एक गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण प्रदर्शन के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए में परिणाम होगा ।
वर्णित तकनीकों संकेतों कि प्राप्त किया जा सकता है की रासायनिक प्रकृति द्वारा मुख्य रूप से सीमित कर रहे हैं । मुख्य रूप से, इन पद्धतियों केवल शोधकर्ताओं को अलग करने और सरीसृप की त्वचा से लंबी श्रृंखला लिपिड अलग करने के लिए अनुमति देते हैं । सरीसृप के कई प्रजातियों के रासायनिक संकेतों के रूप में हवाई और/या proteinaceous cues का उपयोग करें, और वर्णित तरीके अलग के साथ असंगत कहा cues हैं । इसके अलावा, ध्रुवीय सॉल्वैंट्स सरीसृप या क्यू जमाव के सूत्रों (जैसे, पिंजरे का पानी, मल बात, जलीय सब्सट्रेट) है कि वास्तव में प्रचुर मात्रा में रासायनिक संकेतों को शामिल कर सकते है की सतहों से जलीय cues निकालने नहीं होगा । संकेतों के इन प्रकार के कैप्चरिंग के लिए उपयुक्त तरीके शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं (जैसे, ठोस चरण microextraction [SPME] अस्थिर cues और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए [HPLC] जलीय cues के लिए), हालांकि, तरीकों की तरह ऊपर वर्णित है, वहां एक तकनीकी सीखने की अवस्था है ।
सबसे महत्वपूर्ण बात, शोधकर्ता को अंतिम रासायनिक मिश्रण की उपयोगिता का इस्तेमाल किया तरीकों का मार्गदर्शन करना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि एक शोधकर्ता को पता है अगर एक पुरुष फोकल पशु एक लक्षित परख में पुरुष बनाम महिला विशिष्ट द्वारा उत्पादित cues के बीच अंतर कर सकते है चाहता है, निष्कर्षण ही विधि2,3की जरूरत है । यदि यौन dimorphic यौगिकों की पहचान लक्ष्य है, तथापि, निकालने के लिए शुद्ध होना चाहिए, विशिष्ट अणुओं या रासायनिक विश्लेषण के माध्यम से अणुओं के समूहों के लिए पहचान निर्दिष्ट करने में अधिक से अधिक विश्वास को सक्षम करने के लिए1, 6,9,11. हालांकि, यहां तक कि एक लिपिड स्रोत के साथ क्रोमैटोग्राफी आचरण करने के लिए, निकालने शुरू करने का एक महत्वपूर्ण बड़े पैमाने पर आवश्यक है ताकि औसत दर्जे का अंश जनता प्राप्त किया जा सकता है; अंयथा, नमूनों की पूलिंग पीछा किया जा सकता है, लेकिन14इष्टतम नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल के भविष्य के घटनाक्रम का उपयोग और अधिक सांप प्रजातियों के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के उपाय शामिल हैं । त्वचा लिपिड निकालने के अतिरिक्त इनवेसिव तरीकों को भी विकसित किया जा रहा है ।
The authors have nothing to disclose.
इन तरीकों के विकास, विशेष रूप से त्वचा लिपिड निष्कर्षण के बहाने, सहकारी समझौतों के दौरान हुई (14-7412-1061-ca, 15-7412-1155-ca, और 16-7412-1269-सीए) जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय (JMU) और अमेरिका के कृषि विभाग के बीच पशु और पादप स्वास्थ्य निरीक्षण सेवा (APHIS). M.R.P. शेड त्वचा तरीकों के विकास के लिए निंनलिखित छात्रों के योगदान को स्वीकार करता है: एस पटेल (वाशिंगटन और ली विश्वविद्यालय [WLU]), जे Zachry (WLU), आर Flores (JMU), जे नॉल (JMU), और एस एस्टन (JMU) ।
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |