Nos répteis, pele lipídios de coespecíficos são cruciais para sinalização sexual, com potencial de uso na gestão de espécies invasoras. Aqui, descrevemos os protocolos para extração de lipídios da pele da pele de galpão ou animais inteiros, determinar e analisar a massa total de lipídios e separando os lipídios usando fracionamento através de cromatografia em coluna.
Répteis do sinal para coespecíficos usando lipídios em sua pele, principalmente para permitir que companheiro de acompanhamento e avaliação. O isolamento desses lipídios tem utilidade em pesquisa focada em padrões evolutivos e mecanismos de comunicação química, além de compreender o papel impermeabilizante de lipídios na evolução da vida terrestre. Em uma abordagem aplicada, tais sugestões baseadas em pele tem potencial uso para gerentes de vida selvagem, a lidar com espécies invasoras. As principais etapas para quantificação dos lipídios de pele de réptil no protocolo aqui apresentados incluem extração, determinação de lipídios totais e fracionamento através de cromatografia em coluna, o último processo resultando em eluídos purificados de compostos que podem então também ser analisados para atribuir identificações compostas (por exemplo, cromatografia gasosa / espectrometria de massa [GC-MS]) e/ou usadas diretamente em bioensaios mais refinados. Lipídios da pele pode ser extraído de pele viva, derramou animais de pele, ou morto inteiro, utilizando solventes orgânicos apolares (por exemplo, hexano, benzeno, tolueno). Extração solubiliza os lipídios e, em seguida, o solvente pode ser evaporado para produzir um extrato lipídico somente mensurável. Fracionamento envolve a separação do extrato lipídico total em eluídos específico através do tradicional cromatografia em coluna. O extrato lipídico total primeiro está vinculado a uma coluna baseada em substrato (por exemplo, alumina) e, em seguida, eluídos individuais (“frações”) de solvente em volumes específicos são passados sequencialmente através da coluna para eluir conjuntos de compostos da mistura lipídica com base na polaridade comum. O progresso de frações na polaridade em uma sequência padronizada, aumentando a quantidade relativa de solvente polar (por exemplo, éter dietílico) em solventes apolares. Neste manuscrito, descrevemos vários métodos para extração de lipídios da pele dos répteis e, em seguida, fornecer um protocolo padrão para isolar diferentes conjuntos de compostos com base na polaridade, usando cromatografia de coluna tradicional. Todo lipídico extrai ou frações específicas podem, então, ser usadas em bioensaios para determinar qualquer atividade biológica provocada pelos compostos nele.
Répteis produzem lipídios na epiderme, diretamente de células da pele ou de glândulas discretas que são usadas na comunicação social, como companheiro de avaliação e acompanhamento, territorialidade e intrae interespecíficas reconhecimento1,2 ,3,4. O isolamento destes lípidos da pele tem utilidade em pesquisa focada em padrões evolutivos e mecanismos de comunicação química, além de compreender o papel impermeabilizante de lipídios na evolução da vida terrestre2,3 ,4. Além disso, muitos répteis, especialmente Squamata (lagartos, cobras), são espécies invasoras de preocupação em ecossistemas sensíveis, e o desenvolvimento de iscas baseados em feromonas para melhorar a captura e remoção contínua de5,6. A impermeabilidade da pele de réptil facilita a extração dos lipídeos presentes para obter extrações relativamente puras de uma fonte potencialmente robusta de sinais químicos. As etapas de princípio para a quantificação dos lipídios de pele de réptil no protocolo descrito incluem extração, determinação de lipídios totais e fracionamento via coluna cromatografia1,6,7. Os métodos foram usados rotineiramente como rendem bioativos isolados que explica muito sobre a escolha do companheiro e seleção, especialmente em cobras2.
Lipídios da pele podem ser extraídos de vida pele, pele do galpão, ou répteis morto inteiro, usando apolares ou solventes orgânicos polares1,7,8,9. Deve notar-se que espécimes de Museu armazenados em solventes como etanol não são ideais para a extração dos lipídios da pele, e só frescas ou congeladas fresco carcaças devem ser consideradas como possíveis fontes para a extração. Lipídios da pele são inertes, o que os torna estável na superfície da pele e fácil de extrair7. Em seus papéis de sinalização em ecologia de répteis, pistas de lipídios da pele muitas vezes são depositadas em ambientes agressivos, mas por causa de suas propriedades químicas robustas, tais sugestões podem reter seu valor da informação durante longos períodos de tempo10,11 , 12. o processo de extração solubiliza os lipídios, usando um solvente apolar (por exemplo, hexano, benzeno, tolueno) sobre uma plaqueta de horas de duração, seguida por evaporação do solvente, para deixar uma massa mensurável de lipídios extrato7 , 8. lípidos da pele são altamente miscíveis em solventes apolares, e uma vasta gama de hidrocarbonetos pode ser extraída de um similarmente diversificado leque de fontes.
Fracionamento é mais trabalhoso do que a extração, mas serve para separar o extrato de lipídios totais em frações específicas através de cromatografia em coluna, para ajudar na purificação e possível identificação dos compostos nele1, 6 , 7 , 8. o extrato lipídico total está vinculado a uma coluna baseada em substrato, e em seguida, eluídos individuais (“frações”) de solvente em volumes específicos são passados sequencialmente através da coluna para eluir conjuntos de compostos da mistura lipídica que têm um comum polaridade de7,6,8. Em cromatografia de lipídios, o progresso de frações na polaridade em algum padronizada sequência, aumentando a quantidade relativa de solvente polar (por exemplo, éter dietílico) em solvente apolar (normalmente expressa em percentagem: 0%, 2%, 4% de éter, etc. )6,7,8. Embora métodos como cromatografia de camada fina (TLC) pode ser usada para separar os lipídios em uma mistura e são mais simples, cromatografia de coluna é preferido porque ele usa um sistema fechado, é fácil de controlar, pode separado mais concentraram de misturas e é compatível com multiplexação de eficiência. Neste manuscrito, descrevemos vários métodos para extração de lipídios da pele dos répteis e, em seguida, fornecer um protocolo padrão para isolar diferentes conjuntos de compostos com base na polaridade, usando cromatografia de coluna tradicional. Em muitos projetos de pesquisa envolvendo o isolamento de sugestões químicas, o objetivo final é a mudança de efeito nos receptores expostos a essas sugestões. Todo lipídico extrai ou frações específicas podem, então, ser usadas em bioensaios para determinar que qualquer atividade biológica provocada pelos compostos nele1,2,6,7. Em pesquisa biológica básica, por exemplo, bioensaios usando frações específicas podem revelar aos pesquisadores que uma fonte purificada de feromônios tem sido isolada, e em seguida, métodos para a identificação dos compostos alvo podem ser perseguidos. De uma perspectiva de gestão de vida selvagem, a identificação pode não ser o objetivo, e em vez disso, a fração ativa pode ser usada no campo para atrair coespecíficos para armadilhas ou inibir o companheiro de rastreamento no habitat emularem13,14.
A extração dos lipídios da pele nos répteis pode ser aplicada a pele viva ou morta, além da pele de galpão, que oferece versatilidade na aplicação desta técnica experimental. Além disso, as extrações de lipídios da pele podem ser feitas no campo, para permitir uma aplicação dinâmica do método para uma ampla gama de biólogos2,13. Extração de lipídios da pele é simples; Portanto, é fácil de scale-up extrações conforme necessário por experimento ou projeto, e os praticantes não precisam ter experiência significativa para executar os métodos. Os único fatores limitantes para ampliação do são a disponibilidade de espaço de capa das emanações, uma abundância de vidro limpo, selável e espaço de armazenamento de solventes.
Fracionamento de extrato lipídico da pele pode ser adaptado às necessidades do pesquisador e, portanto, tem flexibilidade semelhante para extração de lipídios. Por exemplo, lipídios neutros podem ser eluídos e depois descartados, para resultar em fracções de destino que podem purificar compostos de interesse ou simplificar os bioensaios. Fracionamento pode ser executado em várias escalas dentro e entre as amostras de lipídios. Por exemplo, várias colunas podem ser executadas simultaneamente para tornar o processo mais eficiente. Ou, apenas uma parte de um extrato lipídico total pode ser fracionada em uma coluna pequena para, assim, poupar tempo e reagentes. Fracionamento é limitado principalmente pela massa do extrato lipídico total e a precisão dos equipamentos disponíveis para o pesquisador. Por exemplo, se o pesquisador tem um equilíbrio com uma precisão de 10,0 mg, a determinação da fração de massa e, portanto, a precisão da preparação da amostra para a análise de GC-MS é significativamente, se não completamente, impedida. O mesmo é verdadeiro para o vidro. Se o pesquisador tem uma coluna de grande volume para fracionamento, mas tem uma massa de lipídios totais pequena para separar, a eluição ou separação dos compostos progredirá, mas exigirá um desperdício significativo de solventes, reagentes, tempo e, potencialmente, o alvo compostos de si mesmos.
É aconselhável executar uma verificação de controle de qualidade antes de determinar o regime de eluição, como pode ser visto na tabela 2e decidir que frações podem ser descartadas. Para confirmar a eluição dos lipídeos desejados, uma coluna pode ser executar onde cada fração, 1-15, é coletada individualmente e depois analisada utilizando GC-MS. Na Figura 3, rastreamentos de representante cromatógrafo mostram que cetonas metil de cobras eluir apenas da coluna em uma fração específica. Realizando este passo de controle de qualidade, um regime de eluição modificados pode ser desenvolvido para uma determinada espécie garantir o rendimento máximo dos compostos de interesse. Alterações nos materiais, tais como o fornecedor ou lote da alumina ou a idade do éter dietílico, absolutamente resultará em diferenças de eluição que deve ser controlada para, através da realização de um teste de controle de qualidade.
As técnicas descritas são limitadas principalmente pela natureza química do sinais que podem ser obtidos. Principalmente, esses métodos apenas permitem aos investigadores isolar e separar os lipídios de cadeia longa da pele dos répteis. Muitas espécies de répteis usam indicações no ar e/ou proteicas como sinais químicos, e os métodos descritos são incompatíveis com isolar pistas disse. Solventes apolares, mais não irão extrair pistas aquosas das superfícies de répteis ou fontes de deposição de sinalização (por exemplo, água de gaiola, matéria fecal, substrato aquático) que na verdade pode conter sinais químicos abundantes. Métodos adequados para capturar esses tipos de pistas estão disponíveis para pesquisadores (por exemplo, fase sólida microextraction [SPME] para pistas voláteis e cromatografia líquida de alta performance [HPLC] de pistas aquosas), embora, como os métodos descritos acima, há uma curva de aprendizagem técnica.
Mais importante ainda, a utilidade da mistura química final ao pesquisador deve nortear os métodos utilizados. Por exemplo, se um pesquisador quer saber se um animal macho focal pode distinguir entre as pistas produzidas por masculino vs feminino coespecíficos em um alvo bioensaio, extração é que o único método necessário2,3. Se a identificação de compostos sexualmente dimórficos é o objetivo, no entanto, o extrato deve ser purificado, para permitir maior confiança em atribuir identificações para moléculas específicas ou grupos de moléculas através de análise química1, 6,9,11. No entanto, para o mesmo realizar a cromatografia com uma fonte de lipídios, uma massa significativa de começando o extrato é necessária para que massas de fração mensurável podem ser obtidas; caso contrário, o pool de amostras pode ser perseguido, mas não é ideal14.
Futuros desenvolvimentos do presente protocolo incluem medidas para utilizar e adaptar-se ao processo de espécies de répteis mais. Métodos não-invasivos adicionais de extração de lipídios da pele também estão sendo desenvolvidos.
The authors have nothing to disclose.
O desenvolvimento desses métodos, especialmente o extração galpão pele lipídica, ocorreu durante os acordos de cooperação (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA e 16-7412-1269-CA) entre Animal do Ministério da agricultura e James Madison University (JMU) e plantar Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. reconhece as contribuições dos seguintes alunos para o desenvolvimento dos métodos de pele de galpão: S. Pinheiro (Washington e Lee University [WLU]), J. levodopa (WLU), R. Ferreira de Souza (JMU), J. Noll (JMU) e S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |