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Químico isolamento, quantificação e separação dos lipídios da pele dos répteis

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

Nos répteis, pele lipídios de coespecíficos são cruciais para sinalização sexual, com potencial de uso na gestão de espécies invasoras. Aqui, descrevemos os protocolos para extração de lipídios da pele da pele de galpão ou animais inteiros, determinar e analisar a massa total de lipídios e separando os lipídios usando fracionamento através de cromatografia em coluna.

Abstract

Répteis do sinal para coespecíficos usando lipídios em sua pele, principalmente para permitir que companheiro de acompanhamento e avaliação. O isolamento desses lipídios tem utilidade em pesquisa focada em padrões evolutivos e mecanismos de comunicação química, além de compreender o papel impermeabilizante de lipídios na evolução da vida terrestre. Em uma abordagem aplicada, tais sugestões baseadas em pele tem potencial uso para gerentes de vida selvagem, a lidar com espécies invasoras. As principais etapas para quantificação dos lipídios de pele de réptil no protocolo aqui apresentados incluem extração, determinação de lipídios totais e fracionamento através de cromatografia em coluna, o último processo resultando em eluídos purificados de compostos que podem então também ser analisados para atribuir identificações compostas (por exemplo, cromatografia gasosa / espectrometria de massa [GC-MS]) e/ou usadas diretamente em bioensaios mais refinados. Lipídios da pele pode ser extraído de pele viva, derramou animais de pele, ou morto inteiro, utilizando solventes orgânicos apolares (por exemplo, hexano, benzeno, tolueno). Extração solubiliza os lipídios e, em seguida, o solvente pode ser evaporado para produzir um extrato lipídico somente mensurável. Fracionamento envolve a separação do extrato lipídico total em eluídos específico através do tradicional cromatografia em coluna. O extrato lipídico total primeiro está vinculado a uma coluna baseada em substrato (por exemplo, alumina) e, em seguida, eluídos individuais ("frações") de solvente em volumes específicos são passados sequencialmente através da coluna para eluir conjuntos de compostos da mistura lipídica com base na polaridade comum. O progresso de frações na polaridade em uma sequência padronizada, aumentando a quantidade relativa de solvente polar (por exemplo, éter dietílico) em solventes apolares. Neste manuscrito, descrevemos vários métodos para extração de lipídios da pele dos répteis e, em seguida, fornecer um protocolo padrão para isolar diferentes conjuntos de compostos com base na polaridade, usando cromatografia de coluna tradicional. Todo lipídico extrai ou frações específicas podem, então, ser usadas em bioensaios para determinar qualquer atividade biológica provocada pelos compostos nele.

Introduction

Répteis produzem lipídios na epiderme, diretamente de células da pele ou de glândulas discretas que são usadas na comunicação social, como companheiro de avaliação e acompanhamento, territorialidade e intrae interespecíficas reconhecimento1,2 ,3,4. O isolamento destes lípidos da pele tem utilidade em pesquisa focada em padrões evolutivos e mecanismos de comunicação química, além de compreender o papel impermeabilizante de lipídios na evolução da vida terrestre2,3 ,4. Além disso, muitos répteis, especialmente Squamata (lagartos, cobras), são espécies invasoras de preocupação em ecossistemas sensíveis, e o desenvolvimento de iscas baseados em feromonas para melhorar a captura e remoção contínua de5,6. A impermeabilidade da pele de réptil facilita a extração dos lipídeos presentes para obter extrações relativamente puras de uma fonte potencialmente robusta de sinais químicos. As etapas de princípio para a quantificação dos lipídios de pele de réptil no protocolo descrito incluem extração, determinação de lipídios totais e fracionamento via coluna cromatografia1,6,7. Os métodos foram usados rotineiramente como rendem bioativos isolados que explica muito sobre a escolha do companheiro e seleção, especialmente em cobras2.

Lipídios da pele podem ser extraídos de vida pele, pele do galpão, ou répteis morto inteiro, usando apolares ou solventes orgânicos polares1,7,8,9. Deve notar-se que espécimes de Museu armazenados em solventes como etanol não são ideais para a extração dos lipídios da pele, e só frescas ou congeladas fresco carcaças devem ser consideradas como possíveis fontes para a extração. Lipídios da pele são inertes, o que os torna estável na superfície da pele e fácil de extrair7. Em seus papéis de sinalização em ecologia de répteis, pistas de lipídios da pele muitas vezes são depositadas em ambientes agressivos, mas por causa de suas propriedades químicas robustas, tais sugestões podem reter seu valor da informação durante longos períodos de tempo10,11 , 12. o processo de extração solubiliza os lipídios, usando um solvente apolar (por exemplo, hexano, benzeno, tolueno) sobre uma plaqueta de horas de duração, seguida por evaporação do solvente, para deixar uma massa mensurável de lipídios extrato7 , 8. lípidos da pele são altamente miscíveis em solventes apolares, e uma vasta gama de hidrocarbonetos pode ser extraída de um similarmente diversificado leque de fontes.

Fracionamento é mais trabalhoso do que a extração, mas serve para separar o extrato de lipídios totais em frações específicas através de cromatografia em coluna, para ajudar na purificação e possível identificação dos compostos nele1, 6 , 7 , 8. o extrato lipídico total está vinculado a uma coluna baseada em substrato, e em seguida, eluídos individuais ("frações") de solvente em volumes específicos são passados sequencialmente através da coluna para eluir conjuntos de compostos da mistura lipídica que têm um comum polaridade de7,6,8. Em cromatografia de lipídios, o progresso de frações na polaridade em algum padronizada sequência, aumentando a quantidade relativa de solvente polar (por exemplo, éter dietílico) em solvente apolar (normalmente expressa em percentagem: 0%, 2%, 4% de éter, etc. )6,7,8. Embora métodos como cromatografia de camada fina (TLC) pode ser usada para separar os lipídios em uma mistura e são mais simples, cromatografia de coluna é preferido porque ele usa um sistema fechado, é fácil de controlar, pode separado mais concentraram de misturas e é compatível com multiplexação de eficiência. Neste manuscrito, descrevemos vários métodos para extração de lipídios da pele dos répteis e, em seguida, fornecer um protocolo padrão para isolar diferentes conjuntos de compostos com base na polaridade, usando cromatografia de coluna tradicional. Em muitos projetos de pesquisa envolvendo o isolamento de sugestões químicas, o objetivo final é a mudança de efeito nos receptores expostos a essas sugestões. Todo lipídico extrai ou frações específicas podem, então, ser usadas em bioensaios para determinar que qualquer atividade biológica provocada pelos compostos nele1,2,6,7. Em pesquisa biológica básica, por exemplo, bioensaios usando frações específicas podem revelar aos pesquisadores que uma fonte purificada de feromônios tem sido isolada, e em seguida, métodos para a identificação dos compostos alvo podem ser perseguidos. De uma perspectiva de gestão de vida selvagem, a identificação pode não ser o objetivo, e em vez disso, a fração ativa pode ser usada no campo para atrair coespecíficos para armadilhas ou inibir o companheiro de rastreamento no habitat emularem13,14.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvam a utilização de vertebrados foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité de James Madison University.

1. extração

  1. Extração de pele de galpão
    1. Reunir cerca de 30 cm2 de galpão de um único réptil, removendo a cabeça e esfregaços seções que podem contaminar as amostras. Usar luvas de borracha de cloropreno e limpar o galpão de detritos.
    2. Tare a balança com um saco ou pesar o barco e pesar o galpão (± 0,01 g).
      Nota: A precisão em massa é determinada pela precisão da balança. Pele de galpão em massa é o fator de normalização para massa de lipídios extraídos da pele (veja abaixo) e covaries significativamente com lipídios extraídos em massa.
    3. Separar o galpão em pedaços menores (5 cm2) e adicioná-los para um recipiente de vidro vedada com uma tampa de hexano compatível (por exemplo, um pote de vidro com uma tampa de metal ou um frasco de laboratório com uma tampa PTFE). Decante o hexano suficiente dentro do recipiente para submergir totalmente os pedaços de pele de galpão. Sele o contêiner.
      Cuidado: Hexano é inflamável, um irritante respiratório e está associado a vários curto e longo prazo perigos para a saúde. Procedimentos que envolvam hexano são executados em uma coifa (laboratório) ou ao ar livre (campo) enquanto usava o equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, óculos de mergulho, luvas de borracha de cloropreno, mangas compridas, sapatos perto).
    4. Rotule o contêiner (s) com um lápis ou caneta resistente a solvente. Deixe o contêiner (s) na coifa a temperatura durante a noite ou até 24 h.
    5. Retire os pedaços de barracão usando fórceps metal limpa ou pinças. Agite as peças para reter qualquer hexano restante no recipiente. Permitir que os pedaços de pele secar em papel toalha; em seguida, descartá-las. Se estão sendo realizadas extrações múltiplas, limpe a pinça/pinça entre cada amostra. Para limpar a pinça/pinça, lavá-los em ~ 50 mL de hexano num copo.
    6. Se o extrato não é deve ser usado imediatamente, decantar ou pipetar o extrato em um frasco de vidro de volume adequado, selá-lo com uma tampa de PTFE-alinhado, rotulá-la e armazená-lo a-20 ° C.
      Cuidado: Porque o extrato contém hexano, armazene os frascos em um freezer de à prova de explosão.
  2. Animal morto toda extração
    1. Gravar o comprimento rostro-cloacal (CRC; em centímetros) e a massa (em gramas) do animal. Se a produção total de lipídios ou feromônio por unidade de área de superfície de pele é determinado, use medida de fita de um alfaiate para obter a circunferência máxima do corpo (em cm).
    2. Para a extração, escolha um recipiente que tem um diâmetro que é 1/3 do comprimento do animal. Posição da carcaça firmemente na parte inferior do recipiente com a cabeça e a cloaca no topo. Decante o hexano suficiente para o contêiner para maximizar a área de superfície submersa do corpo.
      Nota: Se a cabeça ou cloaca tornam-se submerso por qualquer quantidade de tempo na extração, tome nota.
    3. Fixe a tampa, rótulo do recipiente e mergulhe-o em uma coifa a temperatura durante a noite ou até 24 h.
    4. Ao remover a carcaça, use pinças de metal limpa ou pinças. Mantêm o hexano residual na carcaça no recipiente, permitindo-lhe do corpo, não da cabeça ou cauda do gotejamento. Sele o contêiner.
    5. Se o extrato não é deve ser usado imediatamente, decantar o extracto ou pipetá-lo para um frasco de vidro de volume adequado, selá-lo com uma tampa de PTFE-alinhado, rotulá-la e armazená-lo a-20 ° C.

2. determinação da massa lipid

Nota: Os lipídios extraídos massa pode ser determinada de duas maneiras: com um frasco de vidro ou com um balão de fundo redondo, usando um evaporador rotativo.

  1. Determine os lipídios extraídos em massa através do método do frasco de vidro.
    1. Use um frasco de preweighed de tamanho suficiente (7 mL, 22 mL, 50 mL, etc.). Incluem a tampa e o rótulo na massa total, ou sempre, pesar o frasco sem tampa e rótulo (marcações no rótulo também adicionar massa). Coloque a etiqueta no pescoço do frasco para evitar o contato de água.
      Nota: A evaporação em frascos de vidro é eficiente se o pesquisador tem acesso a um sistema colector de gás onde vários frascos podem ser evaporados simultaneamente sob um fluxo de2 N.
    2. Transferi o extrato para o frasco, usando uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha ou, para grande volume de extratos, um controlador eletrônico pipeta com uma pipeta de vidro descartável de 10 mL. Lave o recipiente com ~ 3 mL de hexano e transferência para o frasco também.
    3. Evapore a amostra sob uma ligeira corrente de2 N. Incline o frasco em um ângulo para permitir que uma área de superfície máxima solvente. Condensado irá formar do lado de fora do frasco, como o hexano evapora.
      Nota: Anéis de lipídios formarão no frasco, como o hexano evapora, então periodicamente o extrato do redemoinho.
    4. Evaporar a amostra à secura; em seguida, pesar de novo. Recorde o rendimento total de lipídios.
      Nota: Para a análise em grupos diferentes, padronizar os lipídios de massa ou para verter a massa (massa de lipídios [em gramas] dividida pela massa de galpão [em gramas] x 100 produz a massa percentual lipídico da vertente) ou para CRC do animal (lipídios massa [em mg dividida pelo CRC [em] centímetros]; produz a massa de lipídios por unidade de comprimento). Animais maiores produzem mais lipídios, e muitas espécies são fortemente sexualmente dimórficos, que impõe um viés significativo nos dados.
  2. Determine os lipídios extraídos em massa através de evaporador rotativo.
    1. Para uma mais rápida evaporação por amostra individual, o extrato de transferência para um balão de fundo redondo preweighed e evaporá-lo usando um evaporador rotativo.
      1. Se as partículas são perceptíveis no extrato, filtrar a amostra, colocando um cone de papel de filtro no pescoço do balão; em seguida, transferir o extrato para o balão e deixe-o filtro de gravidade. Descarte o filtro de papel após o extrato completo é transferido.
        Nota: O volume da amostra de transferência (até ao volume de ~ 80% frasco) antes da evaporação rotativa. Qualquer subida do extrato para o condensador do evaporador rotativo provoca contaminação e requer o condensador para ser limpo. Uma armadilha de colisão pode ser colocado entre o balão e o pescoço do condensador se ocorrer bolhas ou "batendo" na maioria das amostras.
    2. Ligar a energia para o banho de água e Evaporador giratório (50 ° C; inferior ao ponto de ebulição do solvente). Liga o fluxo de água fria para o condensador.
      Nota: O condensador do evaporador rotativo está ligado a um chiller de circulação ou uma torneira de água fria de ventilação para o ralo. A taxa de fluxo pode ser lenta se a água está mais frio do que o ambiente, para condensar o vapor solvente, deixando o balão e o condensador a entrar.
    3. Ligue a fonte de vácuo (ou bomba de vácuo de água). Verifique o pressão do vácuo é suficiente para manter o balão no pescoço do condensador. Abra a tampa na extremidade do condensador antes de ligar o balão. Deslize o balão para o pescoço do condensador, feche a ventilação para selar e assegurar que o balão não pode desconectar o condensador quando o balão é liberado.
    4. Baixe o balão até ~ 50% está submerso no banho. Inicie a rotação do frasco na velocidade média. Se o vácuo, velocidade, condensador de fluxo e temperatura do banho são ideais, o vapor solvente, deixando o balão irá condensar na bobina e escorrer para o balão de recuperação.
      1. Se resume-se a amostra (por exemplo, grandes bolhas, gaseamento rápida), reduzir imediatamente a vácuo e/ou velocidade de evaporador rotativo. Se a ebulição continua, desligar a rotação do frasco, desligue o aspirador de pó, elevar o frasco do banho e liberar o selo de vácuo. Repita as etapas 2.2.3 e 2.2.4.
        Nota: Se nenhum solvente é coletar no frasco de recuperação, mas o extrato obviamente está evaporando, o vácuo é provavelmente não ideal e deve ser reajustado.
    5. Evaporar a amostra sob o vácuo até ~ 2 mL do solvente permanece no balão (extratos de grande volume), ou, se estiver sendo usado um balão preweighed, evaporar até uma gota de líquido com um < 1 cm de diâmetro é visível na parte inferior do frasco. Desligar a rotação e o vácuo; em seguida, levante o balão de sair do banho.
    6. Segure o pescoço do balão como o vácuo selo é lançado; Então, torce o pescoço para deslizar do condensador. Se um balão de grande volume está sendo usado, agite o extrato condensado no frasco para dissolver os lipídios visíveis; em seguida, transferi a solução através de pipeta para um balão de menor volume, preweighed. Adicionar 3 mL de hexano para lavar o balão grande, redemoinho, pipetá-lo no balão de menor e evaporar-se novamente (etapas 2.2.3 - 2.2.5).
    7. A gota de líquido no extrato solidify como o hexano evapora. Depois de seco, permitem atingir a temperatura ambiente. Lipídios formarão translúcida, branca, cera amarela no frasco (~ 5 min). Pese o frasco para obter a massa final.
      Nota: Dependendo da natureza dos lipídeos extraídos, eles terão sólido (por exemplo, cera) ou semi-sólido (por exemplo, petróleo bruto) Propriedades, especialmente quando fracionada de lipídios se evaporam (veja abaixo).
  3. Solubilize os lipídios no volume gravado de hexano para produzir ≥ 1 mg de lipídios por 1 mL de hexano. O volume de trabalho para progredir para cromatografia é ~ 5 mL. Se transferindo de frasco para frasco, manter 2 mL de volume total para lavar o balão depois de transferir a maioria do extrato para o frasco.
  4. Rotular os frascos, selá-los com bonés de PTFE-alinhado e armazená-los a-20 ° C.

3. cromatografia de coluna

Nota: Para separar compostos desconhecidos com base na polaridade em frações específicas, lipídios extraídos massa pode ser adicionado ao preparado de cromatografia líquida colunas e fracionados usando eluição padrão.

  1. Preparação da coluna
    1. Dependendo da massa lipídico no extrato, use um grande - ou uma coluna de cromatografia de vidro de pequeno volume com uma torneira de Teflon. A coluna é equipada com ou fundida a um reservatório de volume fixo (para uma grande coluna de 500 mL; 250 mL para uma pequena coluna). De agora em diante, este protocolo refere-se apenas uma coluna de cromatografia de grande volume fundida a um reservatório. Limpe cuidadosamente qualquer novo material de vidro e peças para ser usada em cromatografia, conforme descrito na seção 4; em seguida, lave-os com hexano ou outro solvente apolar.
    2. Dobre um pedaço de lã de fibra de vidro (~ 14 cm de comprimento [L] x 4 cm de largura [W]) repetidamente até que uma praça de ~ 4 cm x 4 cm é formada. Use uma haste de passador de madeira mais do que a coluna para a posição da fibra de vidro na parte inferior da coluna.
    3. Fixe a coluna em uma capa para um stand de anel padrão com dois grampos (por exemplo, giro ou modular), um acima da torneira e outro por baixo do pescoço do reservatório. Nível da coluna. Posição da coluna a uma altura para permitir a distância de trabalho suficiente para o copo de 500 mL caber facilmente sob a coluna. Abra a torneira.
    4. Despeje lavadas e secas areia na coluna, até um ~ 3 cm de areia repousa acima da fibra de vidro. Coloque papel preto ou escuro sob a coluna e bata-o suavemente. Se a areia cai da coluna, com cada toque, a barreira de fibra de vidro é insuficiente. Repita os passos de 3.1.2 - 3.1.4.
      Nota: Use um clipe de papel desdobrado colado à extremidade de uma haste de ferragens para buscar a fibra de vidro do fundo.
    5. Coloca o copo de 500 mL, sob a coluna. Lentamente, decante ~ 25 mL de hexano de um copo de 100 mL ou cilindro graduado para o reservatório de coluna para molhar a areia. Feche a torneira quando há ~0.5 cm de hexano acima da areia.
    6. Pese da alumina neutra. Para cada coluna pequena, use ~ 50 g; ~ 175 g para cada coluna grande. Despeje a alumina em um frasco de Erlenmeyer de 1L. Limite de 400 g de alumina por frasco de 1 L.
    7. Para activar a alumina (atividade III), pipetar água desionizada de um volume igual a 6% de alumina a massa (ou seja, para 100 g de alumina, adicionar 6 mL de água). Adicione a água como gotas em toda a alumina.
    8. Cobrir o balão com folha de alumínio ou uma rolha. Agite vigorosamente (não agite) para dispersar uniformemente a carga. Continue até permanecem sem grumos visíveis.
      Nota: O balão irá aquecer como a água reage com a alumina, que é de se esperar.
    9. Adicione hexano até a alumina é totalmente coberta, com ~0.5 cm de hexano acima a alumina. Agite o frasco para formar uma pasta.
    10. Coloque um funil exalado no reservatório da coluna e um copo de vidro de 500 mL sob a coluna. Abra a torneira. Agite a alumina e firmemente, despeje-o na coluna. Garantir a alumina é fixando-se uniformemente na coluna e sem grandes bolhas ou rachaduras estão se formando na coluna de alumina. Bata levemente o lado da coluna para ajustar uniformemente a alumina.
      Nota: Hexano adicional deve ser adicionado para derrama adicional, para manter o chorume. O hexano, coletar no copo sob a coluna pode ser reutilizado, se o copo de vidro estava limpo no início.
    11. A coluna é formada quando o topo da alumina é estável e ~ 4 cm abaixo do pescoço, da coluna na base do reservatório. Use uma pipeta para lavar o interior do reservatório com hexano para alumina residual. Usando um funil, suavemente adicione uma segunda camada de areia em cima a alumina, a ~ 1 cm abaixo do reservatório.
      Nota: Hexano fluirá da coluna como a torneira permanece aberta. Não deixe a coluna secar. Se a coluna secar, o processo deve começar de novo, começando no ponto 3.1.2. O protocolo pode ser parado aqui, se as colunas forem preparadas um dia antes do fracionamento. Firmemente, coloque uma rolha na parte superior do reservatório ou cobri-lo firmemente com papel alumínio. Encha o reservatório com ~ 100 mL de hexano. Aperte a válvula de passagem.
  2. Fracionamento do extrato lipídico
    Nota: Independentemente do tamanho da coluna, frações do extrato lipídico podem ser recolhidas individualmente e agrupadas com base em sua polaridade de fração ou descartados completamente se não contêm quaisquer compostos conhecido/identificado. Rodadas de eluição replicar (n = 3 volumes) são passados através da coluna para assegurar a suficiente eluição dos lipídeos. Siga a tabela 1 para a grande coluna de eluição (com um extrato em massa > 30 mg) ou pequeno-coluna de eluição (com um extrato em massa < 30 mg). Um protocolo de eluição adaptados para isolar apenas cetonas de metilo é na tabela 2.
    1. Remova o hexano restante no topo da coluna, utilizando uma pipeta de grande volume, ou permitir que o hexano a escorrer para fora para um copo limpo. Deixe ~ 3 mL de hexano acima da areia no topo da coluna.
      Nota: O hexano coletado é puro se apenas contactado limpo vidro e pode ser reciclado na primeira fração.
    2. Transferi o extrato lipídico da coluna, utilizando uma pipeta de vidro longo. Pipete lentamente o extrato para evitar perturbar a camada de areia. Lavar o frasco de extrato ou com ~ 5 mL de hexano e transferi-lo para a coluna.
      Nota: Se o extrato foi armazenado a-20 ° C, os lipídios serão ser precipitados. Aqueça o frasco até que não mais precipitado é visível.
    3. Abra a torneira e permitir que a amostra carregar para a coluna. Se o extrato tem uma massa grande (> 30 mg), uma banda amarelada pode ser visível na alumina, logo abaixo da areia no topo. Colete o fluxo através de um copo de precipitação de resíduos como o hexano não é mais limpo. Feche a torneira quando ~ 3 mL permanece em cima da areia.
      Atenção: Os lipídios no extrato, agora vinculado a alumina e a coluna, não podem secar ou a amostra será perdida.
    4. Coloque um balão de fundo redondo de preweighed e rotulado (100 mL, 250 mL ou 500 mL) sob a coluna antes de derramar a primeira fração. Fracções para serem descartados podem ser coletadas em um recipiente de vidro comum.
    5. Preparar a primeira fração (100% hexano: 0% de éter dietílico [até agora, "éter"]) em um cilindro graduado. Se a preparação das fracções com antecedência, cubra com papel alumínio ou rolha de cortiça.
      Nota: Progresso de frações na polaridade; Portanto, o cilindro não precisa ser lavado entre frações.
    6. Adicione a primeira fração para o reservatório por derramamento através de um funil de vidro exalada direcionado para um lado do reservatório para evitar perturbar a camada de areia. Abra a torneira para iniciar a eluição. Feche a torneira quando ~ 3 mL de hexano permanece acima da areia no topo da coluna.
      Nota: Nunca pare uma eluição dentro de uma fração individual, fechando a torneira antes da maioria do eluato foram coletada. Entre frações, não deixe a torneira fechada por mais de 1 ~ h porque os atrasos podem alterar a qualidade e repetibilidade da eluição.
    7. Repita as etapas 3.2.4 - 3.2.6 para frações 2 e 3. Recolha as frações em frascos de tamanhos adequado que permitam headspace para evaporação rotativa, especialmente se as frações estão sendo colocados em pool.
    8. Preparar uma quarta fração (2% de éter) e adicioná-lo ao reservatório. Colocar o balão próximo sob a coluna, abra a torneira e coletar a fração de quarta. Preparar uma fração quinta; em seguida, continue conforme necessário.
      Nota: É possível evaporar a primeiro fraction(s) via giratório evaporação enquanto coleta frações sucessivas.
    9. Para a preparação das fracções para ser usado em análises de GC-MS, obter uma massa de fração, utilizando uma balança de precisão 0,01 ou 0,1 mg. Solubilize as frações lipídicas para render 1 mg de lipídios por 1 mL de hexano.

4. limpeza

  1. Deixar a torneira aberta e inverter a coluna no copo de resíduos. A alumina e a areia vão ficar sem a coluna; Alternativamente, agite para agilizar o processo. Use uma haste de ferragens para buscar a lã de fibra de vidro, se ele está preso (evitar arranhar o vidro) ou explodi-la com um fluxo de2 N.
  2. Desmontar e limpar todos os produtos vidreiros, laboratório-grau detergente em água quente em uma banheira de plástico com uma escova de vidro (com pelos ou cerdas de plástico). Lave 3x. Enxaguar bem com água morna até que o vidro não é mais liso ao toque.
  3. Lavagem do material de vidro e ferramentas 3x com água desionizada. Coloque-os em uma cremalheira para secar ao ar livre. Para acelerar a secagem, adicionar um pequeno volume de acetona (3 mL) para o material de vidro, agite e deixe-o secar ao ar livre ou executá-lo sob um fluxo de2 N.

Representative Results

Extração seguinte, o lipídeo total massa é o primeiro tipo de dados que podem ser adquiridos através do protocolo aqui apresentado. No entanto, valores de massa lipídica total nunca devem ser analisadas sem alguma tentativa de padronizar os valores obtidos. Várias abordagens podem ser usadas, mas recomendamos também padronizar a massa de lipídios extraídos CRC do animal (em centímetros) ou para a massa da pele barracão que foi extraída. O antigo resulta em um valor de lipídios-massa-por-comprimento e o último será uma proporção de fonte em massa. A razão para a padronização é que animais maiores produzem naturalmente mais pele lipídios porque eles têm uma maior área de superfície total da pele. Figura 1A exemplifica esta associação, onde as escalas de massa de lipídios extraídos da pele linearmente com a massa de trocar a pele extraída. Uma vez padronizado para a massa de pele total galpão, essa relação linear é completamente removido (figura 1B).

Após o fracionamento, a mesma abordagem de padronização pode ser usada com as massas das frações individuais (Figura 2). Neste conjunto de dados de amostra, cada fração não contribui igualmente para o total lipídios extraídos massa: lipídios neutros (frações 1-3) são o conjunto dominante de compostos por proporção em massa em comparação com cada conjunto de lipídios polares mais (frações 4-6, 7-9 e 10-12).

Figure 1
Figura 1: relações entre extraído de material de entrada e massa lipídica. (A) nos répteis, a relação entre o galpão total da pele em massa e os lipídios extraídos da pele massa está correlacionada positivamente (P < 0,001). (B) quando os lipídios extraídos da pele massa é padronizada para derramar a massa total (o lipídeo massa dividido pelo galpão em massa), essa relação já não está presente (P = 0,46). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: padronizado massas fração após eluição. Cromatografia de coluna, pele lipídica extratos podem ser eluídos em frações, com base na polaridade do composto. A fração de massa é, então, expressa como uma proporção do extrato lipídico total (fração massa [em mg] dividido pela massa de extrato lipídico total [em mg) para determinar diferenças entre fracções ou experimental grupos de8. As barras representam os meios. O erro superior é SEM; o erro de fundo é 95% CI. Pontos de dados individuais são fornecidos para fins de esclarecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: cromatógrafos de gás representativos de frações de metil cetona. (A) com a eluição adequada, metil cetonas são os compostos mais abundantes na fração 7 do quadro 2 e pode ser vistas como parelhas de versos de picos (tempo de retenção = 24-34 min). (B) fração 6 do quadro 2, no entanto, só produz compostos nontarget. Esse mesmo resultado pode ocorrer quando o solvente polar utilizado na fase móvel expirou ou se a coluna for interrompida por longos períodos de tempo (> 1h) entre frações. Observe a diferença de abundância molecular entre os dois traços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fração Hexano (mL) Éter dietílico (mL)
1, 2,3 100 [30] 0 [0]
4, 5,6 98 [29,4] 2 [0,6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1.2]
10,11,12 92 [27,6] 8 [2.4]
13,14,15 84 [25.2] 16 [4.8]

Tabela 1: volumes de eluição padrão para fracionamento de lipídios da pele. Volumes de solventes e porcentagens são dadas para grande volume (por exemplo, 250 mL) e [volume pequeno] (por exemplo, 100 mL) colunas de cromatografia utilizando alumina (atividade III). Hexano é o solvente do portador; éter dietílico é a fase móvel.

Fração Hexano (mL) Éter dietílico (mL) Notas
1, 2, 3 30 0 Eluir; Não recolher
4, 5 28.8 1.2 Eluir; Não recolher
6, 7, 8 28.8 1.2 recolher individualmente; a maioria de metil cetona missa será na fração 7; GC-MS verificações de controlo de qualidade devem ser executadas em 6 e 8 para assegurar adequada eluição das cetonas

Quadro 2: esquema de eluição modificados para cetonas de metilo sirtalis. Esses volumes são para uso com uma coluna de cromatografia de pequeno volume e com a marca de alumina disponível atualmente. A fração eluted positiva para cetonas metil tem uma forte Bioatividade em ensaios de campo com selvagem, cortejando cobras masculino1,7. Para confirmar a presença de metil cetonas em frações alvo, as amostras podem ser diluídas para 1 mg/mL e analisaram através de GC-MS. a Figura 3 fornece cromatogramas representativas para obter resultados positivos e negativos após eluição.

Discussion

A extração dos lipídios da pele nos répteis pode ser aplicada a pele viva ou morta, além da pele de galpão, que oferece versatilidade na aplicação desta técnica experimental. Além disso, as extrações de lipídios da pele podem ser feitas no campo, para permitir uma aplicação dinâmica do método para uma ampla gama de biólogos2,13. Extração de lipídios da pele é simples; Portanto, é fácil de scale-up extrações conforme necessário por experimento ou projeto, e os praticantes não precisam ter experiência significativa para executar os métodos. Os único fatores limitantes para ampliação do são a disponibilidade de espaço de capa das emanações, uma abundância de vidro limpo, selável e espaço de armazenamento de solventes.

Fracionamento de extrato lipídico da pele pode ser adaptado às necessidades do pesquisador e, portanto, tem flexibilidade semelhante para extração de lipídios. Por exemplo, lipídios neutros podem ser eluídos e depois descartados, para resultar em fracções de destino que podem purificar compostos de interesse ou simplificar os bioensaios. Fracionamento pode ser executado em várias escalas dentro e entre as amostras de lipídios. Por exemplo, várias colunas podem ser executadas simultaneamente para tornar o processo mais eficiente. Ou, apenas uma parte de um extrato lipídico total pode ser fracionada em uma coluna pequena para, assim, poupar tempo e reagentes. Fracionamento é limitado principalmente pela massa do extrato lipídico total e a precisão dos equipamentos disponíveis para o pesquisador. Por exemplo, se o pesquisador tem um equilíbrio com uma precisão de 10,0 mg, a determinação da fração de massa e, portanto, a precisão da preparação da amostra para a análise de GC-MS é significativamente, se não completamente, impedida. O mesmo é verdadeiro para o vidro. Se o pesquisador tem uma coluna de grande volume para fracionamento, mas tem uma massa de lipídios totais pequena para separar, a eluição ou separação dos compostos progredirá, mas exigirá um desperdício significativo de solventes, reagentes, tempo e, potencialmente, o alvo compostos de si mesmos.

É aconselhável executar uma verificação de controle de qualidade antes de determinar o regime de eluição, como pode ser visto na tabela 2e decidir que frações podem ser descartadas. Para confirmar a eluição dos lipídeos desejados, uma coluna pode ser executar onde cada fração, 1-15, é coletada individualmente e depois analisada utilizando GC-MS. Na Figura 3, rastreamentos de representante cromatógrafo mostram que cetonas metil de cobras eluir apenas da coluna em uma fração específica. Realizando este passo de controle de qualidade, um regime de eluição modificados pode ser desenvolvido para uma determinada espécie garantir o rendimento máximo dos compostos de interesse. Alterações nos materiais, tais como o fornecedor ou lote da alumina ou a idade do éter dietílico, absolutamente resultará em diferenças de eluição que deve ser controlada para, através da realização de um teste de controle de qualidade.

As técnicas descritas são limitadas principalmente pela natureza química do sinais que podem ser obtidos. Principalmente, esses métodos apenas permitem aos investigadores isolar e separar os lipídios de cadeia longa da pele dos répteis. Muitas espécies de répteis usam indicações no ar e/ou proteicas como sinais químicos, e os métodos descritos são incompatíveis com isolar pistas disse. Solventes apolares, mais não irão extrair pistas aquosas das superfícies de répteis ou fontes de deposição de sinalização (por exemplo, água de gaiola, matéria fecal, substrato aquático) que na verdade pode conter sinais químicos abundantes. Métodos adequados para capturar esses tipos de pistas estão disponíveis para pesquisadores (por exemplo, fase sólida microextraction [SPME] para pistas voláteis e cromatografia líquida de alta performance [HPLC] de pistas aquosas), embora, como os métodos descritos acima, há uma curva de aprendizagem técnica.

Mais importante ainda, a utilidade da mistura química final ao pesquisador deve nortear os métodos utilizados. Por exemplo, se um pesquisador quer saber se um animal macho focal pode distinguir entre as pistas produzidas por masculino vs feminino coespecíficos em um alvo bioensaio, extração é que o único método necessário2,3. Se a identificação de compostos sexualmente dimórficos é o objetivo, no entanto, o extrato deve ser purificado, para permitir maior confiança em atribuir identificações para moléculas específicas ou grupos de moléculas através de análise química1, 6,9,11. No entanto, para o mesmo realizar a cromatografia com uma fonte de lipídios, uma massa significativa de começando o extrato é necessária para que massas de fração mensurável podem ser obtidas; caso contrário, o pool de amostras pode ser perseguido, mas não é ideal14.

Futuros desenvolvimentos do presente protocolo incluem medidas para utilizar e adaptar-se ao processo de espécies de répteis mais. Métodos não-invasivos adicionais de extração de lipídios da pele também estão sendo desenvolvidos.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O desenvolvimento desses métodos, especialmente o extração galpão pele lipídica, ocorreu durante os acordos de cooperação (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA e 16-7412-1269-CA) entre Animal do Ministério da agricultura e James Madison University (JMU) e plantar Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. reconhece as contribuições dos seguintes alunos para o desenvolvimento dos métodos de pele de galpão: S. Pinheiro (Washington e Lee University [WLU]), J. levodopa (WLU), R. Ferreira de Souza (JMU), J. Noll (JMU) e S. Ashton (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

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References

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Químico isolamento, quantificação e separação dos lipídios da pele dos répteis
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Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

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