En reptiles, los lípidos de la piel de sus congéneres son cruciales para la señalización sexual, con uso potencial en la gestión de especies invasoras. Aquí, describimos protocolos para la extracción de lípidos de la piel de la piel de la vertiente o animales enteros, determinar y analizar la masa total de lípidos y los lípidos cromatografía fraccionamiento mediante columna de separación.
Reptiles de la señal a sus congéneres con lípidos en su piel, sobre todo para permitir el mate de seguimiento y evaluación. El aislamiento de estos lípidos tiene utilidad en la investigación que se centró en los mecanismos de comunicación química, además de entender el papel impermeabilizante de los lípidos en la evolución de la vida terrestre y patrones evolutivos. En un enfoque aplicado, tales señales basadas en la piel tienen uso potencial para los administradores de fauna con especies invasoras. Los pasos principales para la cuantificación de lípidos de la piel de reptil en el protocolo que presentamos incluyen extracción, determinación de lípidos totales y fraccionamiento por cromatografía de columna de, este último proceso resultando en eluídos purificados de compuestos que pueden entonces ya sea ser analizado para asignar identificaciones compuestas (por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas [GC-MS]) o utilizados directamente en las pruebas biológicas más refinados. Los lípidos de la piel se puede extraer de la piel vivos, animales de piel, o el muerto enteros, usando solventes orgánicos no polares (por ejemplo, hexano, benceno, tolueno) de la vertiente. Extracción solubiliza los lípidos y, entonces, se puede evaporar el solvente para obtener un extracto lipídico sólo medible. Fraccionamiento implica la separación del extracto lipídico total en eluidos específica vía tradicional cromatografía de columna. El extracto lipídico total primero está enlazado a una columna base de sustrato (por ejemplo, alúmina) y, luego, eluatos individuales (“fracciones”) de solvente en volúmenes específicos pasan secuencialmente a través de la columna a fin de eluir conjuntos de compuestos de la mezcla de lípidos basado en la polaridad común. El progreso de fracciones de polaridad en una secuencia estandarizada mediante el aumento de la cantidad relativa de solvente polar(por ejemplo, el éter dietílico) en solvente no polar. En este manuscrito, describen varios métodos para la extracción de lípidos de la piel de los reptiles y, luego, un protocolo estándar para aislar diferentes conjuntos de compuestos basados en polaridad, utilizando cromatografía de columna tradicional. Todo lípido extractos o fracciones específicas, entonces, utilizable en pruebas biológicas para determinar cualquier actividad biológica provocada por los compuestos en el mismo.
Reptiles producen lípidos en la epidermis, directamente en las células de la piel o de las glándulas discretas que se usan en comunicación social, tales como mate evaluación y seguimiento, territorialidad, intra – y reconocimiento interespecífico1,2 ,3,4. El aislamiento de estos lípidos de la piel tiene utilidad en la investigación que se centró en patrones evolutivos y los mecanismos de comunicación química, además de entender el papel impermeabilizante de los lípidos en la evolución de la vida terrestre2,3 ,4. Además, muchos reptiles, especialmente escamosos (lagartos, serpientes), son especies invasoras en ecosistemas sensibles, y el desarrollo de señuelos basados en feromonas para mejorar la captura y eliminación continua5,6. La impermeabilidad de la piel de reptil facilita la extracción de los lípidos presentes para obtener extracciones relativamente puras de una fuente potencialmente robusta de señales químicas. Los pasos de principio para la cuantificación de los lípidos de la piel de reptil en el protocolo descrito incluyen extracción, determinación de lípidos totales y fraccionamiento mediante columna cromatografía1,6,7. Los métodos se han utilizado habitualmente como rinden bioactivos aislados que explican mucho sobre la elección de pareja y la selección, especialmente en serpientes2.
Los lípidos de la piel se pueden extraer de la piel viva, cubierto de piel, o reptiles muerto enteros, usando no polares o solventes orgánicos polares1,7,8,9. Cabe señalar que especímenes de Museo en solventes como el etanol no son óptimos para la extracción de lípidos de la piel, y sólo frescos o recién congelados cadáveres deben considerarse como posibles fuentes para la extracción. Los lípidos de la piel son inertes, que hace que se estable en la superficie de la piel y fácil de extraer7. En sus funciones de señalización en la ecología de reptiles, señales de lípidos de la piel a menudo se depositan en ambientes ásperos, pero debido a sus propiedades químicas robustas, tales señales pueden conservar su valor de la información durante largos periodos de tiempo10,11 , 12. el proceso de extracción solubiliza los lípidos, utilizando un disolvente no polar (por ejemplo, hexano, benceno, tolueno) en un remojo de horas de duración, seguido de la evaporación del disolvente, para dejar una masa medible de lípidos extracto7 , 8. lípidos de la piel son altamente miscibles en solventes no polares, y una amplia gama de hidrocarburos puede ser extraída de una igualmente amplia gama de fuentes.
Fraccionamiento es más laborioso que la extracción pero sirve para separar el extracto lipídico total en fracciones específicas mediante cromatografía en columna, para ayudar en la purificación y la posible identificación de los compuestos en1, 6 , 7 , 8. el extracto total de lípidos está enlazado a una columna base de sustrato, y luego, eluatos individuales (“fracciones”) de solvente en volúmenes específicos pasan secuencialmente a través de la columna a fin de eluir conjuntos de compuestos de la mezcla de lípidos que tienen un común la polaridad6,7,8. En cromatografía de lípidos, el progreso de fracciones de polaridad en algunos estandarizados secuencia mediante el aumento de la cantidad relativa de solvente polar(por ejemplo, el éter dietílico) en solvente no polar (normalmente expresado como un porcentaje: 0%, 2%, 4% éter, etcetera. )6,7,8. Aunque métodos como la cromatografía en capa fina (TLC) puede ser utilizado para separar lípidos en una mezcla y son más simple, cromatografía en columna es preferido debido a que utiliza un sistema cerrado, es fácil de controlar, puede independiente más concentraron mezclas y es compatible con Multiplexación para la eficiencia. En este manuscrito, describen varios métodos para la extracción de lípidos de la piel de los reptiles y, luego, un protocolo estándar para aislar diferentes conjuntos de compuestos basados en polaridad, utilizando cromatografía de columna tradicional. En muchos proyectos de investigación que implica el aislamiento de señales químicas, el objetivo final es lograr un cambio en los receptores expuestos a esas señales. Todo lípido extractos o fracciones específicas se pueden, entonces, utilizados en pruebas biológicas para determinar que cualquier actividad biológica provocada por los compuestos en1,2,6,7. En la investigación biológica básica, por ejemplo, pruebas biológicas utilizando fracciones específicas pueden revelar a los investigadores que purificada fuente de las feromonas ha sido aislada, y luego, métodos para la identificación de los compuestos de la blanco pueden ser perseguidos. Desde una perspectiva de manejo de vida silvestre, identificación puede no ser el objetivo, y en cambio, la fracción activa puede ser utilizada en el campo para atraer a sus congéneres a trampas o inhibir a mate de seguimiento en el hábitat de especies no nativas13,14.
La extracción de lípidos de la piel en los reptiles puede aplicarse a la piel viva o muerta, además de piel de la vertiente, que ofrece versatilidad en la aplicación experimental de esta técnica. Además, se pueden hacer extracciones de los lípidos de la piel en el campo, para permitir una aplicación dinámica del método a una amplia gama de biólogos2,13. Extracción de lípidos de la piel es simple; por lo tanto, es fácil de escalar extracciones según sea necesario por experimento o diseño, y los médicos no necesitan conocimientos importantes para ejecutar los métodos. Los factores limitantes sólo para escalar son la disponibilidad de espacio de campana de humo, una abundancia de vidrio limpio, hermético y espacio de almacenamiento de solventes.
Piel lípidos Extracto de fraccionamiento puede ser adaptado a las necesidades del investigador y, por lo tanto, tiene una flexibilidad parecida a la extracción de lípidos. Por ejemplo, lípidos neutros pueden ser eluidos y luego descartados, para dar lugar a fracciones objetivo purificar compuestos de interés que pueden simplificar pruebas biológicas. Fraccionamiento puede realizarse en múltiples escalas dentro y a través de las muestras de lípidos. Por ejemplo, pueden ejecutar varias columnas al mismo tiempo para hacer más eficiente el proceso. O solamente una porción de un extracto lípido total puede ser fraccionada en una pequeña columna a, por lo tanto, los reactivos y el tiempo. Fraccionamiento está limitado principalmente por la masa del extracto total de lípidos y la precisión de los equipos disponibles para el investigador. Por ejemplo, si el investigador tiene una balanza con una precisión 10,0 mg, la determinación de la fracción de masa y, por tanto, la exactitud de la preparación de muestras para el análisis de GC-MS es significativamente, si no totalmente, impedida. Lo mismo vale para la cristalería. Si el investigador tiene una columna de gran volumen para el fraccionamiento, pero tiene una masa pequeña lípido total para separar, la elución o separación de los compuestos progresará, pero requerirá un importante despilfarro de solventes, reactivos, tiempo y potencialmente, el objetivo compuestos ellos mismos.
Se recomienda realizar una verificación de control de calidad antes de determinar el esquema de elución, como se ve en la tabla 2, y decidir qué fracciones pueden ser descartadas. Para confirmar la elución de los lípidos deseadas, una columna puede se run donde cada fracción, 1-15, se recoge individualmente y luego analiza utilizando GC-MS. En la figura 3, representante de cromatógrafo de gases trazas muestran que las cetonas metil de serpientes de la Liga sólo procederá a la elución de la columna en una fracción específica. Al realizar este paso de control de calidad, se puede desarrollar un esquema modificado de elución para que una determinada especie garantizar el máximo rendimiento de los compuestos de interés. Cambios en los materiales, como el proveedor o el lote de la alúmina o la edad del éter dietílico, resultará absolutamente en las diferencias de elución que deben controlarse para realizar una prueba de control de calidad.
Las técnicas descritas están limitadas principalmente por la naturaleza química de las señales que se pueden obtener. Principalmente, estos métodos sólo permiten a los investigadores aislar y separar los lípidos de cadena larga de la piel de los reptiles. Muchas especies de reptiles utilizan señales de aire o proteicos como señales químicas, y los métodos descritos son incompatibles con el aislamiento de dichas señales. Disolventes no polares, más no va a extraer señales acuosas de las superficies de los reptiles o de fuentes de deposición de cue (p. ej., agua de la jaula, materia fecal, sustrato acuático) que de hecho puede contener abundantes señales químicas. Métodos apropiados para la captura de estos tipos de señales están disponibles para los investigadores (e.g., microextracción en fase sólida [SPME] para claves volátiles y cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC] claves acuosa), aunque, como los métodos descritos anteriormente, existe una curva de aprendizaje técnica.
Lo más importante, la utilidad de la mezcla química final el investigador debe guiar los métodos utilizados. Por ejemplo, si un investigador quiere saber si un hombre animal focal puede distinguir entre las señales producidas por macho vs hembra conespecíficos en un bioensayo específico, la extracción es que el único método necesita2,3. Si el objetivo es la identificación de compuestos dimorfismo sexual, sin embargo, el extracto debe ser purificada, para permitir una mayor confianza en asignar identificaciones a moléculas específicas o grupos de moléculas a través de análisis químicos1, 6,9,11. Sin embargo, para incluso realizar cromatografía con una fuente de lípidos, una masa significativa de a partir de extracto es necesaria para que las masas medibles fracción pueden obtenerse; de lo contrario, la puesta en común de las muestras puede ser perseguido pero no es óptimo14.
Evolución futura de este protocolo incluye medidas para utilizar y adaptar el procedimiento para especies más reptilianas. También se están desarrollando métodos no invasivos adicionales de extracción de lípidos de la piel.
The authors have nothing to disclose.
El desarrollo de estos métodos, especialmente la vertiente piel extracción, produjo acuerdos de cooperación (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA y 16-7412-1269-CA) entre James Madison University (JMU) y el Animal Departamento de agricultura de Estados Unidos y planta de servicio de inspección sanitaria (APHIS). M.R.P. reconoce las contribuciones de los siguientes estudiantes para el desarrollo de los métodos de la piel de la vertiente: S. Patel (Universidad Washington and Lee [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) y S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |