I reptiler är hudens lipider från artfränder avgörande för sexuella signaler, med potentiella användning i hantering av invasiva arter. Här, vi beskriver protokoll för att extrahera hudens lipider från skjul hud eller hela djur, att fastställa och analysera den totala lipid massan och separera de lipider som använder fraktionering via kolonnkromatografi.
Reptiler signal till artfränder med lipider i sin hud, främst för att aktivera mate spårning och bedömning. Isolering av dessa lipider har verktyget i forskning inriktad på evolutionära mönster och mekanismer av kemisk kommunikation, förutom förstå rollen tätskikt av lipider i utvecklingen av terrestrial liv. I en tillämpad metod har sådan hud-baserade ledtrådar potentiella användning för wildlife chefer behandlar invasiva arter. De viktigaste stegen för att kvantifiera reptil hudens lipider i protokollet presenteras här inkluderar utvinning, totala lipid beslutsamhet och fraktionering via kolonnkromatografi, senare processen resulterar i renat eluat av föreningar som sedan kan antingen vara analyseras för att tilldela förening identifieringar (t.ex., gaskromatografi-masspektrometri [GC-MS]) eller användas direkt i mer raffinerad bioassays. Hudens lipider kan extraheras från levande hud, skjul hud, eller döda hela djur, använder nonpolar organiska lösningsmedel (t exhexan, bensen, toluen). Utvinning solubilizes lipider, och sedan kan lösningsmedlet förångas för att ge en mätbar endast lipid-extrakt. Fraktionering omfattar separation av totala lipid extraktet till specifika eluat via traditionella kolonnkromatografi. Totala lipid extraktet binds först till ett substrat-baserade kolumn (t.ex., aluminiumoxid) och, sedan, enskilda eluat (”bråk”) av lösningsmedel vid specifika volymer skickas sekventiellt genom kolumnen till eluera uppsättningar av föreningar från lipid blandningen baserat på gemensamma polaritet. De fraktioner framsteg i polaritet vid en standardiserad sekvens genom att öka den relativa mängden polära lösningsmedel (t.ex., dietyleter) i opolära lösningsmedel. I detta manuskript, vi beskriva flera metoder för att utvinna hudens lipider av reptiler och sedan ge ett standardprotokoll för att isolera olika uppsättningar av föreningar baserat på polaritet, med traditionella kolonnkromatografi. Hela lipid extrakt eller särskilda fraktioner kan sedan användas i bioassays för att avgöra någon biologisk aktivitet som framkallas av föreningarna som däri.
Reptiler producerar lipider i epidermis, antingen direkt från hudceller eller diskret körtlar som används i social kommunikation, såsom mate bedömning och spårning, territorialitetsprincipen, och intra- och mellanartskonkurrens erkännande1,2 ,3,4. Isolering av dessa hudens lipider har verktyget i forskning inriktad på evolutionära mönster och mekanismer av kemisk kommunikation, förutom förstå rollen tätskikt av lipider i utvecklingen av terrestrial liv2,3 ,4. Vidare, många reptiler, särskilt squamates (ödlor, ormar), är invasiva arter av oro i känsliga ekosystem, och utvecklingen av feromon-baserat beten att förbättra fångstmetoder och avlägsnande är pågående5,6. Ogenomtränglighet av reptil hud underlättar utvinning av lipider närvarande att få relativt ren extraktioner av en potentiellt robust källa kemiska signaler. Principen stegen för att kvantifiera reptil hudens lipider i protokollet beskrivs omfattar utvinning, totala lipid beslutsamhet och fraktionering via kolumnen kromatografi1,6,7. Metoderna har använts rutinmässigt som ger de bioaktiva isolat som förklarar mycket om mate val och urval, särskilt i ormar2.
Hudens lipider kan extraheras från antingen levande hud, skjul hud, eller döda hela reptiler, använder nonpolar eller polära organiska lösningsmedel1,7,8,9. Det bör noteras att museiexemplar lagras i lösningsmedel som etanol är inte optimala för utvinning av hudens lipider, och endast färska eller färska frysta slaktkroppar bör betraktas som möjliga källor för utvinning. Hudens lipider är inerta, vilket gör dem stabila på ytan av huden och lätt att extrahera7. I sin signalering roller i reptil ekologi, hudens lipid cues sätts ofta i tuffa miljöer, men på grund av sin robusta kemiska egenskaper, sådana signaler kan behålla sin information värde över lång tid10,11 , 12. extraheringen solubilizes de lipider, med ett icke-polära lösningsmedel (t.ex.hexan, bensen, toluen) över en timmar långa blöt, följt av avdunstning av lösningsmedlet, lämna en mätbar massa lipid extrakt7 , 8. hudens lipider är mycket blandbar i nonpolar vätskor, och ett brett utbud av kolväten kan utvinnas från ett likaså varierande utbud av källor.
Fraktionering är mer arbetskrävande än utvinning men tjänar till att separera totala lipid extraktet till särskilda fraktioner via kolonnkromatografi, till stöd i rening och möjliga identifiering av föreningarna som däri1, 6 , 7 , 8. totalt lipid extraktet är bunden till ett substrat-baserade kolumn och sedan individuella eluat (”bråk”) av lösningsmedel vid specifika volymer skickas sekventiellt genom kolonnen till eluera uppsättningar av föreningar från lipid blandningen som har en gemensam polaritet6,7,8. I lipid kromatografi, fraktioner framsteg i polaritet på några standardiserade sekvens genom att öka den relativa mängden polära lösningsmedel (t.ex., dietyleter) i opolära lösningsmedel (vanligen uttryckt i procent: 0%, 2%, 4% eter, etc. )6,7,8. Men metoder som tunnskiktskromatografi (TK) kan användas för att separera lipider i en blandning och är enklare, kolonnkromatografi är program eftersom den använder ett slutet system, är lätt att kontrollera, kan separat mer koncentrerad blandningar, och är kompatibel med Multiplexing för effektivitet. I detta manuskript, vi beskriva flera metoder för att utvinna hudens lipider av reptiler och sedan ge ett standardprotokoll för att isolera olika uppsättningar av föreningar baserat på polaritet, med traditionella kolonnkromatografi. I många forskningsprojekt som innebär isolering av kemiska signaler, är slutmålet att åstadkomma förändring i de mottagare som utsätts för dessa signaler. Hela lipid extrakt eller särskilda fraktioner kan sedan användas i bioassays för att avgöra någon biologisk aktivitet framkallas av föreningarna som däri1,2,6,7. I grundläggande biologisk forskning, exempelvis kan bioassays med särskilda fraktioner avslöja att forskare att en renad källa av feromoner har isolerats, och sedan, metoder för identifiering av föreningarna som mål kan eftersträvas. Från en wildlife managementperspektiv, identifiering kanske inte målet, och i stället den aktiva fraktionen kunde användas i fältet att locka artfränder till fällor eller hämma mate spårning nonnative livsmiljö13,och14.
Utvinning av hudens lipider i reptiler kan tillämpas på levande eller döda hud, förutom skjul hud, som erbjuder mångsidighet i experimentell tillämpningen av denna teknik. Extraktioner av hudens lipider kan dessutom göras i fältet, för att möjliggöra en dynamisk tillämpning av metoden till ett brett utbud av biologer2,13. Utvinning av hudens lipider är enkel; Därför är det lätt att skala upp extraktioner som behövs per experiment eller design och utövare behöver inte har betydande expertis för att köra metoderna. De enda begränsande faktorerna för uppskalning är tillgängligheten av rök hood utrymme, ett överflöd av ren, sealable glasvaror och lösningsmedel lagringsutrymme.
Hudens lipid extrakt fraktionering kan anpassas till en forskares behov och har därför liknande flexibilitet till utvinning av lipider. Exempelvis kan neutrala lipider elueras och därefter kasseras, för att resultera i mål fraktioner som kan rena föreningar av intresse eller förenkla bioassays. Fraktionering kan utföras på flera skalor inom och över lipid prover. Till exempel kan flera kolumner köras samtidigt för att göra processen effektivare. Eller bara en del av en total lipid extrakt kan vara fractionated på en liten kolumn till, således bespara reagenser och tid. Fraktionering begränsas främst av massan av de totala lipid-extraktet och precisionen av utrustningen som är tillgängliga för forskaren. Till exempel om forskaren har en balans med en 10,0 mg precision, bestämning av fraktionen nettomassa och, därför, är riktigheten av provberedningen för GC-MS analys väsentligt, om inte helt, hindras. Samma sak gäller för glas. Om forskaren har en stor volym kolumn för fraktionering, men har en liten totala lipid massa att separera den eluering eller separation av föreningarna som kommer att göra framsteg men kommer att kräva en betydande slöseri med lösningsmedel, reagenser, tid och potentiellt, målet föreningar själva.
Det rekommenderas att utföra en kvalitetskontroll kontroll innan fastställande eluering systemet, som kan ses i tabell 2, och bestämma vilka fraktioner kan kasseras. Till bekräfta elueringen av de önskade lipider, en kolumn kan vara kör där varje fraktion, 1-15, samlas in separat och sedan analyseras med GC-MS. I figur 3visar representativa gaskromatograf spår att metyl ketoner från strumpeband ormar bara eluera från kolumnen i en viss fraktion. Genom att utföra denna kvalitetskontroll steg, kan en modifierad eluering system utvecklas för en viss art att säkerställa maximal avkastning av föreningarna som av intresse. Ändringar i material, såsom den leverantör eller massa av aluminiumoxid eller ålder dietyletern, kommer absolut leda till skillnader i eluering som bör kontrolleras för genom att utföra en kvalitetskontroll test.
De tekniker som beskrivs begränsas främst av kemiska beskaffenhet ledtrådar som kan erhållas. Primärt, tillåta dessa metoder endast forskare att isolera och separera långkedjiga lipider från huden på reptiler. Många arter av reptiler använda luftburna eller proteinhaltiga ledtrådar som kemiska signaler och metoderna som beskrivs är oförenliga med isolera nämnda ledtrådar. Ytterligare, nonpolar lösningsmedel kommer inte extrahera aqueous cues från ytbehandlar av reptiler eller källor av cue nedfall (t.ex., Bur vatten, avföring, vattenlevande substrat) som faktiskt kan innehålla rikliga kemiska signaler. Lämpliga metoder för att fånga dessa typer av ledtrådar är tillgängliga för forskare (t.ex., fasta fasen microextraction [SPME] för flyktiga cues och högpresterande vätskekromatografi [HPLC] för vattenhaltiga signaler), även om, gillar metoderna beskrivs ovan, finns det en teknisk inlärningskurva.
Viktigast av allt, bör nyttan av den slutliga kemiska blandningen som forskaren vägleda de metoder som används. Exempelvis om en forskare vill veta om en fokal handjur kan skilja mellan de ledtrådar som produceras av manliga vs kvinnliga artfränder i en riktad bioassay, är utvinning den enda metoden behövs2,3. Om identifiering av könsdimorfisk föreningar är målet, borde extraktet dock renas, för att möjliggöra större förtroende för tilldela specifika molekyler eller grupper av molekyler via kemisk analys1, identifieringar 6,9,11. Dock att även bedriva kromatografi med en lipid källa, krävs en betydande massa börjar utdrag så att mätbar bråkdel massorna kan erhållas; annars en sammanslagning av prover kan eftersträvas men är inte optimala14.
Framtida utveckling av detta protokoll omfatta åtgärder för att utnyttja och anpassa förfarandet för mer reptils arter. Ytterligare noninvasiva metoder för extraktion av hudens lipider utvecklas också.
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen av dessa metoder, särskilt skjul hud lipid utvinning, uppstod under samarbetsavtal (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA och 16-7412-1269-CA) mellan James Madison University (JMU) och US Department of agricultures djur och Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. erkänner bidrag från följande studenterna till utvecklingen av skjul hud metoder: S. Patel (Washington och Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) och S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |