Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Kimyasal yalıtım, miktar ve sürüngenler cilt lipidler, ayrılık

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

Sürüngenler, cilt lipidler conspecifics üzerinden cinsel, istilacı türlerin yönetimi potansiyel kullanımı ile sinyal için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz döken deri ya da tüm hayvanların, deri lipidler ayıklamak için protokolleri açıklamak belirleme ve toplam lipid kütle analiz ve ayırma ile sütun Kromatografi kullanarak lipidler ayıran.

Abstract

Sürüngenler lipidler öncelikle dostum izleme ve değerlendirme sağlamak için onların deri kullanarak conspecifics için sinyal. Bu lipitlerin yalıtım evrimsel desen ve mekanizmaları lipidler karasal yaşamın evrimi içinde su yalıtım rolünün anlaşılması yanı sıra kimyasal iletişim odaklı araştırma yarar vardır. Bir uygulanan yaklaşım, böyle deri tabanlı ipuçları invaziv türler ile ilgili yaban hayatı yöneticileri için olası kullanımları vardır. Ayıklama, toplam lipid tayini ve ayırma ile sütun Kromatografi, hangi-ebilmek o zaman bileşikler arıtılmış eluates içinde ortaya çıkan ikinci işlem sürüngen cilt lipidler burada sunulan protokolündeki miktarının ana adımları içerir ya bileşik tanımlamaları (Örneğin, gaz kromatografi-kütle spektrometresi [GC-MS]) atamak için analiz ve/veya doğrudan daha rafine biyoanalizler kullanılan. Cilt lipidler yaşam deri elde edilebilir, deri veya ölü tüm hayvanlar, nonpolar organik çözücüler (Örneğin, hekzan, benzen, Toluen) kullanarak döken. Ayıklama lipidler solubilizes ve sonra solvent ölçülebilir bir salt lipid özü vermeye buharlaşmış. Ayırma toplam lipid özü belirli eluates yolu ile geleneksel sütun Kromatografi içine ayrılması içerir. Toplam lipid özü ilk substrat tabanlı sütun için (Örneğin, Alümina) bağlıdır ve sonra bireysel eluates ("kesirler") belirli miktarlar solvent sırayla üzerinden sütun kümeleri bileşiklerin lipit karışımından elute geçti temel alınarak ortak polarite. Polarite nonpolar solvent kutup solvent (Örneğin, dietil eter) göreli miktarını artırarak standartlaştırılmış bir sıra, kesirler sürüyor. Bu makale içinde biz sürüngenler cilt yağlar ayıklamak için birkaç yöntem açıklar ve, sonra standart bir protokol farklı polarite üzerinde esaslı bileşikleri grupları yalıtmak için geleneksel sütun Kromatografi kullanarak sağlar. Bütün lipid özleri veya belirli kesirler daha sonra biyoanalizler içinde orada tarafından bileşikler elde edildi herhangi bir biyolojik etkinliğini belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

Lipidler epidermis, doğrudan deri hücreleri veya dostum değerlendirme ve izleme, şimdi ve içi - ve interspecific tanıma1,2 gibi sosyal iletişimde kullanılan ayrık bezleri içinde sürüngenler üretmek ,3,4. Bu cilt lipitlerin yalıtım evrimsel desen ve mekanizmaları lipidler evrim karasal yaşam2,3 ve su yalıtım rolünün anlaşılması yanı sıra kimyasal iletişim odaklı araştırma yarar vardır ,4. Ayrıca, birçok sürüngenler, özellikle squamates (kertenkele, yılan), hassas ekosistemler endişe invaziv türü vardır ve Kalkınma feromon tabanlı lures yakalama ve Temizleme geliştirmek için devam eden5,6. Sürüngen cilt sızdırmazlık lipidler nispeten saf çekimi kimyasal sinyallerin potansiyel olarak güçlü bir kaynak elde etmek için mevcut ekstraksiyon kolaylaştırır. Sürüngen cilt lipidler açıklanan protokolündeki miktarının için ilke adımlar ayıklama, toplam lipid tayini ve sütun Kromatografi1,6, üzerinden ayırma7içerir. Onlar çok dostum seçim ve seçim, özellikle de yılan2hakkında açıklamak biyoaktif yalıtır verim gibi yöntemler rutin olarak kullanılmaktadır.

Cilt lipitler ya yaşam cilt, döken cilt, ya da ölü tüm sürüngenler, nonpolar kullanarak veya polar organik çözücüler1,7,8,9elde edilebilir. Bu maddeleri etanol gibi depolanan Müzesi numuneler cilt yağlar ekstraksiyon için uygun değillerdir ve sadece taze veya taze dondurulmuş karkas çıkarılması için olası kaynaklar olarak kabul edilmelidir unutulmamalıdır. Cilt lipidler etkisiz, onları kararlı deri yüzey ve7ayıklamak kolay yapar. Sinyal rolleri sürüngen ekoloji cilt lipid cues kez sert ortamlarda yatırılan ancak güçlü kimyasal özellikleri nedeniyle, bu tür yardımlar saat10,11 uzun süre bilgi değerlerine koruyabilirsiniz , 12. lipid özü7 ölçülebilir bir kitle bırakmak solvent, buharlaşma tarafından takip bir saat süren poşeti üzerinde bir nonpolar çözücü (Örneğin, hekzan, benzen, Toluen) kullanarak lipidler, ayıklama işlemi solubilizes , 8. Cilt lipidler nonpolar çözücüler son derece karışan ve geniş bir hidrokarbon kaynakları aynı şekilde çeşitli bir dizi elde edilebilir.

Ayırma daha ayıklama zahmetli ama toplam lipid özü bileşikleri arıtma ve olası kimlik orada1, yardım etmek için belirli kesirler ile sütun Kromatografi, içine ayırmak için hizmet vermektedir 6 , 7 , 8. toplam lipid özü substrat tabanlı bir sütun bağlıdır ve sonra bireysel eluates ("kesirler") belirli miktarlar solvent sırayla kümeleri ortak bir sahip bileşiklerin lipit karışımından elute sütunu boyunca iletilir polarite6,7,8. Lipid Kromatografi polarite bazı kesirler sürüyor standart sıra nonpolar çözücü içinde kutup solvent (Örneğin, dietil eter) göreli miktarını artırarak (genellikle bir yüzdesi olarak ifade edilir: % 0, %2, % 4 eter, vs. )6,7,8. Gibi ince katmanlı Kromatografi (TLC) lipidler bir karışımı ve daha basit ayırmak için kullanılan yöntemleri, sütun Kromatografi olduğunu kapalı bir sistem, kullandığı için tercih kontrol edebilirsiniz kolaydır, ama ayrı daha karışımları konsantre ve ile uyumludur verimlilik için çoğullama. Bu makale içinde biz sürüngenler cilt yağlar ayıklamak için birkaç yöntem açıklar ve, sonra standart bir protokol farklı polarite üzerinde esaslı bileşikleri grupları yalıtmak için geleneksel sütun Kromatografi kullanarak sağlar. Kimyasal sopasıyla yalıtım içeren birçok araştırma projelerinde bu yardımlar için maruz alıcıları etkisi değişim amacıdır. Bütün lipid özleri veya belirli kesirler daha sonra biyoanalizler içinde herhangi bir biyolojik aktivitesi tarafından bileşikler orada elde edildi1,2,6,7belirlemek için kullanılabilir. Temel biyolojik araştırma, örneğin, belirli kesirler kullanarak biyoanalizler araştırmacılar için Feromonlar arıtılmış kaynağı izole edildikten ve daha sonra hedef bileşikler tanımlaması için yöntemleri takip edilebilir ortaya çıkarabilir. Bir yaban hayatı yönetimi açısından kimlik amaç olmayabilir ve bunun yerine, etkin kesir alanında conspecifics tuzaklara çekmek veya özgün olmayan yaşam alanı13,14' te izleme dostum inhibe için kullanılabilir.

Protocol

Tüm yordamları omurgalılar kullanımıyla ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi, James Madison Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. çıkarma

  1. Cilt ayıklama döken
    1. Dökmek yaklaşık2 30 cm baş ve örnekleri kontamine cloacal bölümleri kaldırma bir tek sürüngen toplamak. Kloropren eldiven giymek ve enkaz döken temiz.
    2. Bir çanta ile denge Dara veya tekne tartmak ve döken (± 0,01 g) ağırlığında.
      Not: Kitle hassas dengeyi hassas tarafından belirlenir. Döken cilt kitle standardizasyon etken için ayıklanan cilt lipid kitle (aşağıya bakın) ve önemli ölçüde ile ayıklanan lipid covaries kitle.
    3. Kulübeye daha küçük (5 cm2) parçalara ayırmak ve bir yapışmalı cam kaba bir hekzan uyumlu kapaklı (Örneğin, metal kapaklı bir cam mason kavanoz ya da bir laboratuvar şişesi PTFE kapaklı) ekleyebilirsiniz. Yeterli hekzan döken deri parçaları tamamen batırmak için konteyner içine dikkatle boşaltmak. Konteyner mühür.
      Dikkat: Hekzan yanıcı, solunum tahriş edici ve çeşitli kısa ve uzun vadeli sağlık tehlikeleri ile ilişkilidir. Yordamlar hekzan içeren bir duman hood (laboratuvar) veya açık havada (alanı) uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (Örneğin, sıçrama gözlük, Kloropren eldiven, uzun kollu, yakın parmaklı ayakkabılar) giyerken gerçekleştirilir.
    4. Container(s) bir kalem veya solvent dayanıklı kalem ile etiketleyin. Container(s) Oda sıcaklığında gecede veya 24 h duman kukuleta bırakın.
    5. Temiz metal forseps veya maşa kullanarak döken parçaları kaldırın. Kapta kalan herhangi bir hekzan korumak için parçaları sallamak. Kağıt havlu üzerinde kurumaya cilt adet izin; sonra bunları atma. Birden fazla çekimi gerçekleştiriliyor, maşa/forseps her örnek arasında temiz. Maşa/forseps temizlemek için bir ölçek hekzan ~ 50 ml yıka.
    6. Özü hemen kullanılmak üzere ise, dikkatle boşaltmak veya uygun birim bir cam şişe içine özü pipette, PTFE kaplı bir kap ile kapatın, etiketlemek ve -20 ° C'de depolayın
      Dikkat: özü hekzan içerdiğinden, şişeleri bir patlama koruyucu dondurucuda saklayın.
  2. Bütün ölü hayvan çıkarma
    1. Burun deliği uzunluğu kaydetmek (SVL; santimetre) ve seviye (gram), hayvan. Toplam lipid veya feromon üretim birimi başına deri yüzey alanının tespit edilecek, terzi şerit metre maksimum vücut çevresi (cm) olarak elde etmek için kullanın.
    2. Çıkarma için 1/3 hayvan uzunluğu çapında bir kapsayıcı seçin. Karkas konteyner ile baş ve cloaca altındaki güvenli bir şekilde üstüne getirin. Yeterli hekzan vücudun Batık yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için konteyner içine dikkatle boşaltmak.
      Not: baş veya cloaca herhangi bir süreyi ayıklama için su altında olmak, Not almak.
    3. Kapağı güvenli, etiket kapsayıcının ve oda sıcaklığında gecede veya 24 h duman başlıklı ıslatın.
    4. Karkas kaldırırken, temiz metal forseps veya maşa kullanın. Karkas konteyner üzerinde kalan hekzan vücuttan kafa ve kuyruk damla için izin vererek korur. Konteyner mühür.
    5. Özü hemen kullanılmak üzere ise, özü dikkatle boşaltmak veya uygun birim bir cam şişe pipette, PTFE kaplı bir kap ile kapatın, etiketlemek ve -20 ° C'de depolayın

2. lipid kitle belirlenmesi

Not: Ayıklanan lipid kitle belirlenen iki yoldan biriyle: bir cam şişe veya bir yuvarlak alt şişesi, bir döner buharlaştırıcı kullanarak.

  1. Ayıklanan lipid kitle ile cam şişe yöntemi belirleyin.
    1. Preweighed bir şişe, yeterli boyuta (7 mL, 22 mL, 50 mL, vb) kullanın. Toplam kütle kap ve etiket eklemek veya her zaman şişeyi kap ve etiket olmadan tartmak (etiket üzerindeki işaretleri de kitle ekleyin). Etiket şişeye su temasından kaçının boynunda yerleştirin.
      Not: Cam tüpler buharlaşma araştırmacı nerede birden çok şişeleri aynı anda bir N2 akışı altında buharlaşmış gaz manifold sistemi erişimi varsa etkilidir.
    2. Özü şişe, tek kullanımlık 10 mL Cam Pipet ile bir elektronik pipet denetleyicisi bir lastik ampul veya büyük hacimli özleri, cam pipet kullanarak aktarın. ~ 3 mL hekzan ve transfer kapsayıcıyla şişeyi de durulayın.
    3. Örnek bir nazik N2 dere altında buharlaşır. Şişeyi bir açıda maksimum solvent yüzey alanı etkinleştirmek için eğimli. Hekzan buharlaşır gibi yoğuşma şişeyi dışarıdan oluşturacak.
      Not: hekzan buharlaşır gibi lipid halkaları şişede oluşturacak kadar düzenli olarak özü girdap.
    4. Kuruluk için örnek buharlaşır; sonra coorect. Kayıt toplam lipid verim.
      Not: farklı gruplar arasında analiz için lipid standartlaştırmak kitle ya kitle döken (lipid seviye döken kitle [gram] 100 x bölü [, gram] verimleri döken yüzde lipid kütlesi) veya hayvanın SVL (SVL [bölü lipid kitle [mg] santimetre]; «««verimleri) lipid kütle başına birim uzunluğu. Daha büyük hayvanlar daha fazla lipid üretmek ve türlerin hangi veri önemli önyargı dayatır güçlü cinsel dimorfik.
  2. Ayıklanan lipid kitle ile döner buharlaştırıcı belirlemek.
    1. Bir daha hızlı buharlaşma bireysel örnek başına için özü preweighed bir yuvarlak alt şişesi aktarmak ve döner buharlaştırıcı kullanarak buharlaşır.
      1. Parçacıklar hulâsa içinde fark varsa, örnek şişeye boynundan bir filtre kağıt koni yerleştirerek filtre; daha sonra özü şişesi için transfer ve yerçekimi filtresiyle. Tam özü aktarıldıktan sonra filtre kağıdı atın.
        Not: numune hacmi Transfer (~ %80 şişesi birim ilâ) döner buharlaşma önce. Herhangi bir rotary evaporatör kondansatör içine ekstresinin köpüren kirlilik neden olur ve temizlenmesi için kondansatör gerektirir. Kabarcıklar veya "darbeleme" çoğu örneklerinde oluşursa bir yumru tuzak şişeye ve kondansatör boyun arasında yerleştirilebilir.
    2. Rotary Evaporatör ve su banyosu için açın (50 ° C; solvent kaynama noktası daha düşük). Kondansatör için soğuk su akışını açın.
      Not: Dolaşan bir soğutucu veya drenaj havalandırma soğuk su bir tıkaç rotary evaporatör kondansatör bağlıdır. Debi su ortam daha, şişeye bırakarak ve kondansatör girilmesi solvent buharı yoğunlaşmaya soğutucu ise yavaş olabilir.
    3. Vakum kaynağında (su vakum veya pompa) açın. Vakum basıncı şişeye kondansatör boyun için fazlasını saklamak için yeterli olduğundan emin olun. Havalandırma kondansatör sonundaki şişeye bağlanmadan önce açın. Balonun üzerine kondansatör boyun slayt, mühür ve şişeye serbest bırakıldığında balonun kondansatör kesilemiyor sağlamak için havalandırma kapatın.
    4. ~ %50 banyoda batık kadar balon düşür. Orta hızda şişeye dönüş başlar. Vakum, hız, kondansatör akışı ve banyo sıcaklığı en iyi durumda, şişeye bırakarak solvent buharı bobin üzerinde yoğunlaşmak ve kurtarma şişesi damla.
      1. Eğer örnek kaynar (Örneğin, büyük kabarcıklar, hızlı gaz), hemen vakum ve/veya rotary evaporatör hızını azaltmak. Kaynama devam ederse, şişesi döndürmeyi devre dışı bırakmak, vakum açmak, banyo gelen şişeye yükseltmek ve vakum mühür yayın. 2.2.3 ve 2.2.4 adımları yineleyin.
        Not: Eğer hiçbir solvent kurtarma şişeye topluyor ama özü belli ki buharlaşan, vakum olasılıkla nonoptimal ve ayarlamalara gidilmesi gerekir.
    5. ~ 2 mL şişe (büyük hacimli özler) çözücü kalıntıları kadar vakum altında örnek buharlaşır veya preweighed bir şişesi kullanılmakta ise, bir boncuk ile sıvı kadar buharlaşır bir < 1 cm çapında şişeye alt kısmında görünür. Döndürme ve Vakum devre dışı bırakma; o zaman, şişeye banyo dışına kaldırın.
    6. Şişe boyun mühür serbest vakum tutun; o zaman, kondansatör slayt için boyun bükmek. Bir büyük şişe kullanılıyorsa, sıkıştırılmış özü görünür lipidler çözülmeye şişeye girdap; ardından, pipet çözüm yolu ile bir daha küçük hacimli, preweighed şişesi aktarın. 3 mL büyük şişeyi çalkalayın, bu girdap, daha küçük şişeye pipette ve yeniden buharlaşır için hekzan ekleyin (adım 2.2.3 - 2.2.5).
    7. Hekzan buharlaşır gibi sıvı özü boncuk kuvvetlendirmek. Kuru bir kez, bu oda sıcaklığında ulaşmak bekleyin. Lipidler şişeye (~ 5 dk) sarı balmumu için şeffaf, beyaz oluşturacak. Son kitle elde etmek için balonun ağırlığı.
      Not: özellikle fraksiyonlara lipidler (aşağıya bakın) buharlaşıp zaman çıkarılan lipidler niteliğine bağlı olarak, onlar katı (Örneğin, balmumu) veya semisolid (Örneğin, ham petrol) özellikleri, olacaktır.
  3. Lipidler hekzan ≥1 mg lipid hekzan 1 mL başına verim kaydedilen hacmine solubilize. Kromatografi için ilerleme için çalışma ~ 5 mL birimdir. Eğer şişe şişe, şişe için özü çoğunluğu aktardıktan sonra şişeye durulama için toplam hacminin 2 mL korumak için geçiş yapan.
  4. Şişeleri etiket, PTFE kaplı kapaklar ile mühür ve onları-20 ° C'de depolayın

3. sütun Kromatografi

Not: bilinmeyen bileşikler polarite belirli kesirler, ayıklanan lipid içine göre ayırmak için kütle ekledi hazır sıvı kromatografi sütunlar olabilir ve standart elüsyon kullanarak şeker.

  1. Sütun hazırlanması
    1. Özü lipid kitle bağlı olarak, bir büyük - ya da bir küçük hacimli cam Kromatografi sütun bir Teflon stopcock ile kullanın. Sütun donatılmış bir ya da bir sabit hacimli rezervuar (büyük bir sütun için 500 mL; küçük bir sütun için 250 mL) için erimiş. Şu andan itibaren bu iletişim kuralı yalnızca bir rezervuar erimiş büyük hacimli Kromatografi sütuna başvuruyor. İyice temiz herhangi bir yeni cam eşya ve parçalar Kromatografi içinde 4 bölümde açıklandığı gibi kullanılmak üzere; o zaman, hekzan ya da başka bir nonpolar solvent ile yıka.
    2. Bir parça cam elyaf yün kat (~ 14 cm uzunluğunda [L] x 4 cm genişliğinde [W]) kadar art arda ~ 4 cm x 4 cm kare oluşur. Sütun uzun bir ahşap Kavela çubuk sütunun altındaki fiberglas konumlandırmak için kullanın.
    3. Bir başlık (Örneğin, döner veya modüler) iki kelepçeler ile standart masa standı, stopcock yukarıda ve boyun baraj gölünün altında bir sütunda güvenli. Sütun düzey. Yeterli çalışma mesafesi kolayca altında sütun sığdırmak 500 mL kabı için izin vermek için bir yükseklik adresindeki sütun konumu. Stopcock açın.
    4. Pour yıkanmış ve kum ~ 3 cm fiberglas aittir kadar sütun, içine kum kurutulmuş. Sütununun altında siyah veya koyu kağıdı yerleştirin ve hafifçe dokunun. Kum her dokunmayla sütundan düşerse, fiberglas yetersiz engeldir. Adımları yineleyin 3.1.2 - 3.1.4.
      Not: dübel rod sonuna kadar bantlanmış bir gelişeceğini ataç fiberglas alttan getirmek için kullanın.
    5. 500 mL kabı sütununun altında yerleştirin. Yavaş yavaş ~ 25 mL 100 mL kabı veya mezun silindir hekzan ıslak kum için sütun göle dikkatle boşaltmak. Hekzan kum yukarıda ~0.5 cm olduğunda stopcock kapatın.
    6. Tarafsız alümina tartın. Küçük her sütun için kullanım ~ 50 g; ~ 175 g büyük her sütun için. Alümina bir 1 L Erlenmeyer şişe dökün. Alümina 1 L şişe başına 400 g sınırlayın.
    7. Alümina (etkinlik III) etkinleştirmek, bir birimin alümina % 6 eşit deiyonize su pipet kitle (yani, Alümina, 100 gr için 6 mL su ekleyin). Alümina boyunca damla olarak su ekleyin.
    8. Alüminyum folyo ya da mantar ile şişesi kapağı. Şiddetle girdap (değil sallamak) şarj eşit olarak dağıtmak için. Görünür hiçbir kümeleri kalıncaya kadar devam edin.
      Not: su beklenen bir şey alümina ile tepki olarak şişeye sıcak olacak.
    9. Alümina tamamen, hekzan alümina yukarıda ~0.5 cm ile kaplı kadar hekzan ekleyin. Şişeye bir bulamaç formu girdap.
    10. Sütun ve sütunun altına 500 mL Cam kabı rezervuar Bacalı huni yerleştirin. Stopcock açın. Alümina girdap ve sürekli sütun dökün. Alümina eşit sütun ve büyük hava kabarcığı yok yerleşme veya çatlaklar alümina sütununda oluşturan emin olun. Yavaşça eşit alümina yerleşmek için sütun yan dokunun.
      Not: Ek hekzan Bulamaç korumak için ek dökülen için eklenmiş olması gerekir. Cam kabı başında temiz olsaydı ölçek sütununun altında toplama hekzan yeniden kullanılabilir.
    11. Alümina üst istikrarlı ve baraj gölünün dibinde sütunun boyun altında ~ 4 cm olduğunda sütun oluşturulur. Bir pipet ile hekzan kalan alümina için rezervuar iç durulama için kullanın. Bir huni kullanarak, yavaşça kum alümina üzerine ikinci bir katman ~ 1 cm baraj altında ekleyin.
      Not: stopcock açık kalır gibi hekzan sütundan akacaktır. Sütun kurumasına izin vermeyin. Sütun kurur, işlemi tekrar, 3.1.2 adımda başlayan başlaması gerekir. Sütunları bir gün ayırma önce hazırlanan protokol burada durdurulabilir. Sıkıca mantar baraj gölünün içinde yerleştirin veya sıkıca folyo ile kapatın. Havzanın hekzan ~ 100 mL ile doldurulması. Stopcock sıkın.
  2. Lipid ekstresinin ayırma
    Not: sütun boyutu ne olursa olsun, kesirler lipid ekstresinin olabilir ayrı ayrı toplanan ve tamamen, herhangi bir bilinen/tanımlanan hedef bileşikler içeren kendi kesir polarizasyona göre veya gözardı edilen havuza alınmış. Çoğalt elüsyon Tur (n = 3 cilt) lipidler yeterli elüsyon sağlamak için sütun geçirilir. Tablo 1 için büyük sütun elüsyon izleyin (bir özü ile kitle > 30 mg) veya küçük sütunlu elüsyon (bir özü ile kitle < 30 mg). Sadece metil Ketonlar izole bir özel elüsyon Tablo 2' de protokolüdür.
    1. Büyük hacimli pipet kullanarak sütun, üst kısmında kalan hekzan kaldırmak veya temiz bir ölçek damlamaya hekzan izin verebilirsiniz. ~ 3 mL hekzan sütunun üstündeki kum üzerinde bırakın.
      Not: Eğer sadece temiz cam temas ve ilk kesir recycled toplanan hekzan saf.
    2. Lipid özü uzun cam pipet kullanarak sütuna aktarmak. Yavaş yavaş kum katman rahatsız edici önlemek için özü pipette. Özü şişe veya şişeye hekzan ~ 5 mL ile durulayın ve sütun için transfer.
      Not: özü-20 ° C'de depolanmışsa, çöktürülmüş lipidler. Artık çökelti görünene kadar şişe sıcak.
    3. Stopcock açmak ve örnek sütun yüklemek izin vermek. Özü büyük bir kitle varsa (> 30 mg), sarımsı bir grup hemen üstündeki kum altında alümina içinde görülebilir. Bu hekzan artık temiz olduğu gibi atık bir ölçek aracılığıyla akış toplamak. Stopcock ~ 3 mL üstünde tepe-in kum kalır kapatırken.
      Dikkat: Şimdi Alümina ve sütun, bağlı özü, lipid olamaz veya toz örnek-ecek yitmek.
    4. Bir preweighed ve etiketli yuvarlak alt balon (100 mL, 250 mL veya 500 mL) altında sütun ilk kesir dökülmeden önce yerleştirin. Kesirler atılmak üzere ortak bir cam kap içinde toplanabilir.
    5. İlk kesir hazırlamak (% 100 hekzan: %0 dietil eter [şimdiye kadar "Eter"]) mezun silindir. Eğer kesirler peşin, folyo ile kapatın veya tıpa mantarı ile hazırlanıyor.
      Not: Kesirler polarite sürüyor; Bu nedenle, silindir arasında kesirler durulanır gerekmez.
    6. İlk kesir için rezervuar tarafından dökme yoluyla Bacalı cam huni kum katman rahatsız edici önlemek için rezervuar tarafına yönetmen ekleyin. Elüsyon başlatmak için stopcock açın. Stopcock ~ 3 mL hekzan sütunun üstündeki kum yukarıda kalır kapatırken.
      Not: Bir elüsyon bireysel bir fraksiyonu içinde durdurmak asla eluate çoğu toplanan önce stopcock kapatarak. Kesirler arasında gecikmeler elüsyon tekrarlanabilirlik ve kalitesini değiştirebilirsiniz çünkü ~ 1 h daha uzun süre kapalı stopcock bırakmayın.
    7. 3.2.4 - 3.2.6 kesirler 2 ve 3 için yineleyin. Kesirler özellikle havuzlu kesirler headspace döner buharlaşma için izin uygun ölçekli şişeler içinde toplamak.
    8. Dördüncü kesir (% 2 Eter) hazırlamak ve rezervuar için ekleyin. Sütununun altında sonraki şişeye koyun, stopcock açın ve 4. fraksiyonun toplamak. Beşinci bir kısmını hazırlamak; ardından, gerektiği gibi devam edin.
      Not: Art arda gelen kesirler toplarken ilk fraction(s) üzerinden döner buharlaşma buharlaşır mümkündür.
    9. GC-MS analizleri içinde kullanılmak üzere kesirler hazırlamak için bir 0,01 ya da 0,1 mg hassas denge kullanarak bir kesir kitle elde etmek. Lipid fraksiyonları lipid hekzan 1 mL başına 1 mg vermeye solubilize.

4. Temizleme

  1. Stopcock açık bırakın ve Atık kabı sütununda tersine çevirin. Alümina ve kum sütun dışında çalışır; Alternatif olarak, süreci hızlandırmak için sallayın. Bu takılırsa fiberglas yün getirmek için dübel rod kullanın (cam çizilmemesi önlemek) veya bir N2 akışıyla üfle.
  2. İkiyüzlülük ve tüm Züccaciye Mağazaları, Züccaciye Mağazaları fırçayla (saç veya plastik kıllar) ile plastik bir küvette sıcak suya laboratuvar-grade deterjan kullanarak temiz. 3 x yıkayın. Cam artık kaygan dokunmatik olana de bol sıcak su ile durulayın.
  3. Züccaciye Mağazaları durulama ve deiyonize su ile 3 x araçları. Onları kurumasını bir rafa yerleştirin. Kurutma hızlandırmak için küçük bir birim eklemek aseton (3 mL) cam eşya için girdap ve kuruması veya bir N2 akışı altında çalıştırmak izin vermek.

Representative Results

Aşağıdaki ayıklama, toplam lipid kitle burada sunulan protokolü ile elde edilebilir veri ilk türüdür. Ancak, toplam lipid toplu değerleri hiçbir zaman bazı girişim elde edilen değerler standartlaştırmak için analiz edilmelidir. Birkaç yaklaşım kullanılabilir, ancak her iki hayvanın SVL (santimetre) ın veya ayıklandı döken deri kütlesi ayıklanan lipid kitle standartlaştırılması öneririz. Eski sonuçları bir lipid kütle başına uzunluk değeri ve ikinci bir oranda kaynak olacak kitle. Standardizasyonu için daha büyük bir toplam deri yüzey alanı olduğundan daha büyük hayvanlar doğal olarak daha fazla cilt yağlar üretmek nedenidir. Şekil 1A nerede Ayıklanan cilt lipid toplu ölçekler kitle ile doğrusal olarak çıkarılan deri döken bu ilişki örneğidir. Toplam döken cilt ayine standart bir kez bu doğrusal ilişki tamamen vardır (Şekil 1B) kaldırıldı.

Ayırma aynı standardizasyon yaklaşım bireysel kesirler (Şekil 2) kitleler ile kullanılabilir. Bu örnek veri kümesinde, her kesir eşit için toplam ayıklanan lipid katkıda bulunmaktadır değil kitle: nötr lipitler (kesirler 1-3) bileşikleri kütle oranı daha fazla kutup lipidler (kesirler 4-6, 7-9 ve 10-12) kümelerine göre tarafından baskın kümesi vardır.

Figure 1
Şekil 1: arasındaki ilişkileri çıkarılan lipid kitle ve giriş malzeme. (A)içinde sürüngenler, toplam döken arasındaki ilişki cilt kitle ve ayıklanan cilt lipid kütle pozitif korelasyon (P < 0.001). (B) ne zaman ayıklanan cilt lipid kitle kitle döken toplam standart (kitle barakanın bölünmüş lipid kitle), bu ilişki artık yok (P = 0,46). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Standart elüsyon takip kesir kitleler. Sütun Kromatografi kullanarak, cilt lipid özleri kesirler Bileşik polarite dayalı, içine eluted. Kesir kitle sonra ifade edilen toplam lipid özü (toplam lipid özü seviye [, miligram bölü kesir kitle [mg]) bir kısmı olarak farklılıklar arasında kesirler veya deneysel grupları8belirlemek için. Çubuklar anlamına gelir gösterir. En iyi SEM hatadır; % 95 CI alt hatadır. Tek tek veri noktalarını netlik için sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: metil keton kesirler temsilcisi gaz kromatograflar. (A)uygun elüsyon ile metil Ketonlar en bol bulunan bileşiklerdir kesir 7 Tablo 2 ve tepeler couplets görülebilir (tutma zamanı 24-34 dk =). (B) kesir 6 Tablo 2, ancak, yalnızca nontarget bileşikler görüntüler. Bu aynı sonucu mobil aşamasında kullanılan kutup solvent süresi sona erdiğinde veya sütun uzun bir süre için durdurulursa oluşabilir (> 1 h) arasında kesirler. Moleküler bolca iki izlemeler arasındaki farka dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kesir Hekzan (mL) Dietil eter (mL)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29.4] 2 [0,6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1,2]
10,11,12 92 [27,6] 8 [2.4]
13,14,15 84 [25,2] 16 [4,8]

Tablo 1: Standart elüsyon birimleri cilt lipid ayırma için. Solvent birimleri ve yüzdeleri büyük hacimli (Örneğin, 250 mL) ve [küçük hacimli] (Örneğin, 100 mL) için alumina (etkinlik III) kullanarak Kromatografi sütunları verilmiştir. Hekzan, taşıyıcı solvent olduğunu; dietil eter mobil aşamasıdır.

Kesir Hekzan (mL) Dietil eter (mL) Notlar
1, 2, 3 30 0 elute; toplamıyoruz
4, 5 28.8 1.2 elute; toplamıyoruz
6, 7, 8 28.8 1.2 ayrı ayrı toplamak; metil keton çoğunlukta kitle-ecek var olmak kesir 7; GC-MS kalite kontrol denetimleri 6 ve Ketonlar uygun elüsyon emin olmak için 8 üzerinde çalışması gereken

Tablo 2: değiştirilmiş elüsyon düzeni garter yılanı metil Ketonlar için. Bu birimler kullanmak bir küçük hacimli Kromatografi sütunla ve alümina mevcut marka ile vardır. Eluted kesir metil Ketonlar için pozitif alan deneyleri çıldırdı, Erkek garter yılanları1,7Kur ile güçlü bir bioactivity var. Metil keton hedef kesirler, örnekleri 1 mg/mL sulandırılmış ve yoluyla GC-Bayan analiz varlığını doğrulamak için Şekil 3 temsilcisi chromatograms için hem olumlu hem de olumsuz sonuçlar elüsyon takip sağlar.

Discussion

Sürüngenler cilt yağlar ekstraksiyon yanı sıra deneysel uygulama bu tekniğin çok yönlülük sunuyor döken cilt, ölü ya da diri cilde uygulanır. Ayrıca, cilt lipidler çekimi yönteminin dinamik bir uygulama niteliğindeki biyologlar2,13geniş bir yelpazesi için etkinleştirmek için bu alanın içinde yapılabilir. Cilt yağlar ekstraksiyon basittir; Bu nedenle, deneme veya tasarım başına gerektiği gibi çekimi kadar ölçeklemek kolay ve uygulayıcıları yöntemleri yürütmek için önemli uzmanlık olmak zorunda değildir. Yükseltme için sadece sınırlayan faktörler duman başlık alanı kullanılabilirliğini, temiz, yapışmalı Züccaciye Mağazaları ve solvent depolama alanı bir bereket vardır.

Cilt lipid özü ayırma bir araştırmacı ihtiyaçlarına göre ve bu nedenle, lipid ayıklama için benzer esnekliğe sahiptir. Örneğin, nötr lipitler eluted ve sonra hedef kesirler bileşikler ilgi arındırmak veya biyoanalizler basitleştirmek neden olarak atılır. Ayırma ve lipid örnekleri arasında içinde birden çok ölçeklerde gerçekleştirilebilir. Örneğin, birden çok sütun aynı anda süreci daha verimli hale getirmek için çalıştırabilirsiniz. Veya bir toplam lipid özü yalnızca bir bölümünü böylece, yedek reaktifler ve zaman için küçük bir sütun üzerinde şeker. Ayırma öncelikle toplam lipid özü kütlesi ve araştırmacı için kullanılabilir ekipman duyarlığını ile sınırlıdır. Örneğin, araştırmacı kitle ve bu nedenle bir denge kesir belirlenmesi 10.0 mg hassasiyetle varsa, GC-MS analiz için numune hazırlama doğruluğunu önemli ölçüde, değilse tamamen engelledi. Aynı cam ürünleri için geçerlidir. Araştırmacı ayırma için bir büyük hacimli sütun vardır ancak ayırmak için bir küçük toplam lipid kitle varsa, elüsyon veya ayrılık bileşiklerin başlarsınız ama önemli israfını çözücüler, reaktifler, zaman ve büyük olasılıkla, hedef gerektirir kendilerini bileşikleri.

Bu Tablo 2' de görüldüğü gibi elüsyon düzeni belirlemeden önce bir kalite kontrol denetimi yapmak ve ne kesirler atılır olabilir karar için tavsiye edilir. İstenen lipidler, bir sütun elüsyon onaylamak için çalışma nerede her kesir, 1-15, ayrı ayrı toplanır ve sonra analiz GC-MS kullanarak olabilir. Şekil 3' te, temsilcisi gaz Kromatograf metil Ketonlar garter yılanları üzerinden yalnızca belirli bir kısmını sütunda bulunan elute göstermektedir. Bu kalite kontrol adımı uygulayarak, değiştirilmiş elüsyon düzeni ilgi bileşiklerin maksimum verim sağlamak belirli bir tür için geliştirilebilir. Değişiklikleri tedarikçi veya Alümina sürü veya dietil eter, yaş gibi maddeler kesinlikle için bir kalite kontrol test gerçekleştirerek denetlenmelidir elüsyon farklılıkların neden olur.

Açıklanan teknikler elde edilebilir ipuçları kimyasal doğası gereği esas sınırlıdır. Öncelikle, bu yöntemler sadece araştırmacılar yalıtmak ve uzun zincirli lipidler sürüngen derisinden ayırmak olanak sağlar. Sürüngenler türlerin kimyasal sinyaller olarak hava ve/veya proteinaceous ipuçlarını kullanın ve açıklanan yöntemleri dedi cues yalıtkan ile uyumsuzdur. Ayrıca, nonpolar çözücüler sulu cues sürüngenler yüzeyler veya kaynakları yükünün bol kimyasal sinyalleri gerçekten içeren işaret (Örneğin, kafes su, dışkı, su yüzey)-ecek hulâsa değil. Rağmen bu tür yardımlar yakalamak için uygun yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME] geçici ipuçları ve yüksek performanslı sıvı kromatografi [HPLC] sulu yardımlar için), araştırmacılar için kullanılabilir yöntemler gibi Yukarıda açıklanan, teknik bir öğrenme eğrisi olduğunu.

En önemlisi, araştırmacı son kimyasal karışıma yardımcı programı kullanılan yöntemleri yönlendirmelidir. Bir araştırmacı bir erkek odak hayvan erkek vs kadın conspecifics içinde hedeflenen bioassay tarafından üretilen yardımlar arasında ayırt edebilirsiniz Eğer bilmek istiyorsa, örneğin, ayıklama tek yöntem2,3gereklidir. Cinsel dimorfik bileşikler tanımlaması hedefi ise, ancak, özü tanımlamaları belirli molekülleri veya moleküller ile kimyasal analiz1grupları atanmasında daha fazla güven etkinleştirmek için saf lazım, 6,9,11. Ölçülebilir kesir kitleler elde edilebilir ancak, hatta kromatografi ile lipid kaynak yapmak için özü başlayan önemli bir kitle gereklidir; Aksi takdirde, örnekleri havuzu takip edilebilir ancak en uygun14değil.

Bu protokol gelecekteki gelişmeler yararlanmak ve yordamı daha sürüngen türler için uyum için önlemler içerir. Cilt lipidler ayıklama ek noninvaziv yöntemler de geliştirilmektedir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu yöntem, özellikle döken cilt lipid ayıklama, geliştirme James Madison Üniversitesi (JMU) ve ABD Tarım Bakanlığı'nın hayvan arasında işbirliği anlaşmaları (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA ve 16-7412-1269-CA) sırasında meydana gelen ve sağlık teftiş Servisi (APHIS) bitki. M.R.P. kabul eder döken cilt Yöntem geliştirme aşağıdaki öğrencilere katkıları: S. Patel (Washington ve Lee Üniversitesi [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) ve S. Ashton (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245, (4915), 290-292 (1989).
  2. Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196, (10), 729-749 (2010).
  3. Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
  4. Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36, (3), 185-206 (2015).
  5. Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59, (2), 141-149 (2013).
  6. Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44, (2), 189-197 (2018).
  7. Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
  8. Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35, (10), 1234-1241 (2009).
  9. Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215, (5), 723-730 (2012).
  10. Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
  11. Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10, (6), e0131492 (2015).
  12. Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32, (2), 566-580 (2018).
  13. Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5, (3), 405-409 (1998).
  14. Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
  15. Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42, (11), 1164-1174 (2016).
Kimyasal yalıtım, miktar ve sürüngenler cilt lipidler, ayrılık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter