אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד. הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.
המסך עבור אללים mutant לדיכוי פנוטיפי ליקויים שנגרמו על ידי מוטציה גנטית היא גישה רב עוצמה לזיהוי גנים השייכים מסלולים ביוכימיים הקשורים קשר הדוק. שיטות קודמות כגון ניתוח מערך גנטי סינתטי (התלמידים) וכן באמצעות אולטרה סגול (UV) או כימיקלים כמו אתיל methanesulfonate (EMS) או N-אתיל-N-nitrosourea (ENU), טכניקות מוטגנזה מכוונת אקראי היה בשימוש נרחב, אבל הם בדרך כלל יקרים, מפרך. כמו כן, שיטות סינון שמבוסס מוטגן אלה קשורות לעתים קרובות תופעות לוואי חמורות על האורגניזם, גרימת מוטציות מרובות מוסיפים למורכבות של לבודד את מדכאי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לזהות מוטציות משתיק קול מוטציות אשר מעניקים פגם צמיחה שמר הביקוע. ניתן לנטר את הכושר של תאים עם חוסר צמיחה סטנדרטיים מדיה נוזלי עשיר או סינתטי נוזלי מדיה עבור שחזור משתמש בקורא צלחת 96-ובכן אוטומטית על פני תקופה ארוכה. ברגע תא רוכשת מוטציה משתיק קול בתרבות, שצאצאיו לגבור של התאים הורים. התאים התאושש שיש יתרון תחרותי צמיחה על פני התאים הורים יכולים להיות לאחר מכן מבודד, backcrossed עם תאי הורים. מוטציות משתיק קול ואז ניתן לזהות באמצעות רצף הגנום כולו. באמצעות גישה זו, יש בהצלחה בודדנו מדכאי מרובים על הליקויים צמיחה חמורה נגרמת על ידי אובדן של Elf1, AAA + משפחה של ATPase חשוב גרעיני mRNA תחבורה ותחזוקה של יציבות גנומית. כיום יש מעל 400 גנים ב ס הביקוע עם מוטציות היוועצות פגם צמיחה. כמו רבים מן הגנים האלה הם uncharacterized, אנו מציעים כי השיטה שלנו לזרז את הזיהוי של אינטראקציות תפקודית הרומן עם גישה זו ידידותי למשתמש, תפוקה גבוהה.
הבסיס להבנת פונקציונלי קישורים בין הגנים מסתמכת על היכולת לזהות את mechanism(s) המולקולרי שבאמצעותו גנטיים מורכבים מתפצלות לייצר פנוטיפים שונים1. שמרים ביקוע, שמר הביקוע (ס’ הביקוע), הרוב המכריע של חלבונים הם לוותר על הכדאיות2. תוצאה זו לא מדברים על unimportance של גנים אלו, אלא מעדיף המנגנונים לפיצוי הסבוך של מסלולים ביוכימיים שאליו שייכים גנים כאלה. לנתח את המנגנונים לפיצוי האלה יצר מפות אפיסטזה, אשר חשפו אינטראקציות גנטי מקיף הרחיבה את ההבנה שלנו של משעולים הביוכימי פונקציונלי3,4.
פותחו שיטות תפוקה גבוהה (למשל, ניתוח מערך גנטי סינתטי או מועצת התלמידים) כדי לזהות את האינטראקציות גנטי הגנום כולו ניצני שמרים ולאחר שהורחבו לשימוש בביקוע-שמרים-5,–6. גישות כאלה לעיתים קרובות לסמוך על ספריה של זנים המכילים כל קיימא יחיד חלבון-קידוד גנטי מחיקות (בסביבות 3,300 מוטציות מחיקה הפלואידי מכסה מעל 92% של הגנום שמרים ביקוע), דורשים זרוע רובוטית לבצע חוצה גנטי בין זן של עניין כל זנים אפשריים ב- library6. עוד יותר, התלמידים טכניקות תלוי היכולת של ספריית זנים נכונה ויעילה ההזדווגות, פנוטיפ שנמצא חריג כדי 444 כעת המאופיינת בגנים הביקוע ס’2.
למרות המורכבות של אינטראקציות גנטי, משווה את פנוטיפ של זן נשיאת מוטציות בגנים שני פנוטיפ של שני זנים נשיאת מוטציות בודדות של כל הגן יכול לקבל שתי תוצאות בולטים: 1) היא מוטציה כפולה גן # מושגים בסיסיים גרוע יותר הצפוי אוילר הורים פנוטיפים בצורה של מחלה או, במקרה הקיצוני ביותר, הקטלניות. זה מכונה של אינטראקציה גנטית השלילית, היא בדרך כלל סימן לכך שני גנים לפעול במקביל מסלולים ביולוגיים. 2 פנוטיפ מוטציה כפול) עדיף השילוב הצפוי של פנוטיפים הורים, המכונה גם השפעה חיובית הדדית גנטי. השפעה חיובית הדדית גנטי הוא מעניין במיוחד משום שהוא מציין כי גנים אלו מתפקד באותו תהליך. שני גנים אינטראקציה חיובית יש שלושה קשרים פוטנציאליים: הגן המוטנטי עשוי למעלה-לווסת את הביטוי של הגן השני במסלול מקביל, שני גנים עשויים לעבוד ביחד בתוך מסלול אותו במורד הזרם אחת לאחרת או לקודד שני גנים חלבונים לתקשר ישירות עם כל אחד את השני. לכן, אינטראקציה חיובית גנטי ניתן למפות צמתים רגולטוריות ג’ין ולסווג גנים uncharacterized משעולים הביוכימי7,8.
משתיק קול הוא מוטציה אשר יכול להקל על בחילות פנוטיפ של המוטציה של גן אחר, בדרך כלל המייצג השפעה חיובית הדדית גנטי בין שני גנים9,10. מוטציות משתיק קול על לוקוס שונה מזו של המוטציה שהם לדכא נקראות מדכאי extragenic. . הם יקר במיוחד בלימוד מוטציות גנטיות כלכלית בהצלה לאכסון קטלני פנוטיפ (הידוע גם בשם אפקט לזרוס)11. יש להם גם יישומים פוטנציאליים טיפולית בטיפול מחלות תורשתיות12,13.
מכל הסיבות האלה, זיהוי מוטציות משתיק קול אורגניזמים שונים דגם יש כבר נרחב מנוצל כדי להקל על ההבנה שלנו של מסלולים ביוכימיים שונים14,15,16. הקרנה של מדכאי מבוסס בדרך כלל על פנוטיפ של המוטציה המדובר ודורש ניצוח אקראי מוטגנזה מכוונת לבודד מוטציות זה להקל על פנוטיפ. כמעט כל האורגניזמים דגם הקימו שיטות מוטגנזה מכוונת אקראי. לדוגמה, N-אתיל-N-nitrosourea (ENU) ו ethylmethanesulfonate (EMS), שני מוטגנים המסוגלים גרימת נקודת מוטציות ב- DNA, מועסקים נרחב במודלים שונים של חיידקים עכברים17,18,19 . בנוסף, מנגן כלורי זמן כבר בשימוש שמרים על היכולת של הקטיון מנגן לעכב את ה-DNA תיקון מסלולים20. גישה נפוצה אחרת היא מוטגנזה מכוונת UV-induced, אשר מפיק פירימידין מוטגניות הגנום כולו הדימרים21,22.
למרות הניצול של כימי מוטגנזה מכוונת כדי לזהות מוטציות משתיק קול היה פופולארי, לשיטה חסרונות רבים, כולל השימוש של כימיקלים מסוכנים, שיעורי הצלחה משתנה מאוד המבוא של המשתנים מבלבלים במיוחד שהציג תופעות הלוואי השליליות של מוטגן על תהליכים תאיים מרובים23,24. בנוסף, מוטגנזה מכוונת כימית גורם לעיתים קרובות מספר מוטציות בגנום המוסיף המורכבות של שימוש הגנטית ואת רצף טכניקות כדי לזהות את המוטציה המדויק זה הוענקו על פנוטיפ משתיק קול האורגניזם25.
לפנות את החסרונות של גישות מוטגנזה מכוונת הנוכחי, אנו מציגים שיטה למסך משתיק קול ספונטנית מוטציות שמרים ביקוע כי אין להסתמך על כל מוטגנים או מחיקת ספריה. השיטה מבודד מדכאי דרך וזמינותו הבחירה חיובי. העיקרון של שיטה זו מבוססת על היתרון צמיחה subpopulation משתיק קול מוטציה בתרבות נוזלי, אשר ניתן יהיה פיקוח על ידי בקורא צלחת אוטומטית. הזדווגות של מיוזה משמשים רק אם אחד רוצה לנקות את הרקע הגנטי או לאשר הנוכחות של אללים monogenic של מדכאי לפני רצף הגנום כולו. אם פנוטיפ דיכוי נגרם על ידי מוטציה יחידה, פנוטיפ משתיק קול הפרדת 2:2 לאחר backcrossing עם זנים הורים. ניתן לזהות מוטציות משתיק קול ואז באמצעות רצף הגנום כולו. אנו מציעים כי שיטה זו ישימה הקרנת מדכאי ב כל המיקרואורגניזמים יכולים לגדל אוכלוסיה גדולה בתרבות נוזלי.
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג את הרומן של המסך פשוט מוטציות משתיק קול ספונטנית לזיהוי באמצעות שחזור פנוטיפי של מוטציות היוועצות צמיחה איטית בביקוע שמרים, הפנוטיפ האופייני של גנים מעל 400 ס הביקוע, הפונקציה של רבים מהם נשאר לא ידוע2,32. שיטות קודמות לקחו גישות אחרות על המסך עבור מוטציות משתיק קול מיקרואורגניזמים, לרבות השימוש מוטגנים21, או את היישום של שינוי טמפרטורה הרגיש רקע מוטציה33. לעומת זאת, פרוטוקול זה מראה התאוששות פנוטיפי מתרחשת ללא התערבות סביבתית/כימי נוסף מדגיש את היתרון כושר של עלייתו של דיכוי מוטציות בסופו של דבר משתלטים על המשאבים הזמינים בנוזל תרבות. מסך זה מאפשר בידודו של שניהם מדכאי מעקף או אינטראקציה עם מדכאי כי זה יעיל עבור שתי מוטציות אובדן-של-פונקציה כגון elf1∆ או fal1∆ , מוטציות נקודה כגון clr6-1, כל עוד המוטנטים להפגין כושר פגמים בתרבות נוזלי.
עד כה, כל זני S התאושש אנו חקרו הראו בדרגות שונות של שחזור פנוטיפי. כפי שאותרו במעבר גנטי, פנוטיפ התאושש הוא לייחס רכיב גנטי יחיד והוא heritable (דוגמאות באיור 2). זהו אחד היתרונות המשמעותיים של שיטה זו לעומת מסכי משתיק קול המבוססות על חומרים כימיים או מבוסס-UV, אשר לעתים קרובות יעד מרובים לוקוסים גנומית. נהוג לקיים מושבות אחד או שניים התאושש מתוך 16 מושבות/זן (בסביבות 10%) בתוך שבוע אחד. עם זאת, לב כי מוטציות מסוימות, כגון האובדן-של-הפונקציה של Rrp6, יחידת משנה הגרעין ספציפית exosome, מעולם לא החלימה לקצב גדילה פראי-סוג כמעט נצפו תאים elf1Δ 31. סביר להניח כי הפונקציה של Rrp6 יכולים רק חלקית יפוצו על ידי מדכאי, בניגוד הפונקציה של אחרים המוטציות שנבדקו, כולל fal1∆, אשר הוצגה לגרום פגם חמור meiotic דרך תפקידה החשוב של רגולציה שחבור34. אנו מאמינים כי משתיק קול אלטרנטיבי הקרנה שיטות תהיה נתונה באותה הבעיה כאשר yfg יש תפקידים ייחודי, שאינו ניתן להחלפה בצמיחת תאים.
לפני ביצוע רצף גנטי, רצוי הגב-צלב המושבות phenotypically המשוחזר, זוהה דרך הצלחת-הקורא, עם זנים הורים כדי לנקות את הרקע הגנטי להשיג משכפל ביולוגי. בנוסף, רצף הגנום כולו עמוק מזהה מאות שינויים נוקלאוטיד יחיד, אשר רובם אינם זהים בין הביולוגי משכפל יש עניין קטן להקרנה. לדוגמה, מצאנו בסך של 660 גנומית. שינויים על פני כל שלושת הכרומוזומים בין שני elf1Δ P את חמש S זנים (איור 3). לא נפוץ נתבונן מוטציות זהים בין הביולוגי ברצף ושכפול של כל זן, רומז כי מוטציות חדשות שעשויות להתעורר במהלך culturing של תאים elf1Δ לפני בניית ספרייה גנומית או שגיאות אקראיים עשויים להיות הציג במהלך בניית ספריה ואת רצף. ומכאן, לבודד מוטציות יהיו עקביים ברחבי משכפל הביולוגי הוא היבט חשוב בזיהוי מוצלחת מדכאי באמצעות רצף הגנום כולו.
אנו מזוהה, אישר מדכאי שני באזורים תקליטורים חמישה זנים S ברצף. למרות מוטציות בגן SPBPJ4664.02 התגלו ב S-A1 ו- S-A2 זנים, סביר להניח כי SPBPJ4664.02 הוא משתיק קול בתוקף כי S-A1 ו- S-A2 מכיל משתיק קול על אותו גן כפי שהם אינם משלימים עם אחד את השני ( נתונים לא מוצג). אנחנו גם לא אימת rli1 ב S-A3, אשר לא הפרדת במשותף עם פנוטיפ S כאשר backcrossed עם elf1Δ. לחלופין, מצאנו מוטציות ספציפיות באזורים ללא קידוד ב S-A1, S-A2 ו- S-A3. זה אפשרי כי שינו ללא קידוד גנומית אזורים אלה להקל על פנוטיפ elf1Δ , אשר יטופלו מחקרים עתידיים שלנו. לעומת שיטות מסורתיות כמו assay הצמדה, אשר עשויה להימשך שנים כדי למפות מוטציה גנטית, זיהינו שני מדכאי בתוך חודשיים לאחר שנוכח כי רכיב monogenic גרם של פנוטיפ S. עם מהירות הפיתוח הטכנולוגי רצף הגנום כולו, אנחנו אופטימיים כי שיטה זו תהיה יעילה יותר לזהות מוטציות גנטיות עקבי בעתיד הנראה לעין.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק הנחיות צעד אחר צעד בהצלחה לזהות מוטציות משתיק קול עבור ג’ין כל עניין עם פגם הגדלים לאט בתרבות נוזלי. הפשטות של assay הזה מאפשר ההקרנה בקנה מידה גדול של רקע גנטי מרובים עניין עם קצת הדרכה מעשית. יש חדר נוסף למכן את התהליך באמצעות רובוט טיפול בנוזלים כדי לבצע את דילולים יומי. מאז מעבדה מניפולציה של מיקרואורגניזמים דורשת צמיחה בתרבות נוזלי, תהליך סלקטיבי מטבעו ופיטנס, אנו מציעים כי ניתן להחיל בהרחבה בפרוטוקול זה על אורגניזמים אוכלוסייה גדולה דגם אחרים כגון חיידקים, מינים אחרים שמרים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים, מענקים 1R15GM119105-01 כדי K.Z. אנו מודים כל הבודקים להערות תובנה. אנו מודים גם ג’יימס טאקר, אלישיה אנדרסון, אליזבת שחור, גלן Marrs הדיון והערות על כתב היד הזה.
Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100×15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range |
Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
Sterile workspace and burners | |||
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |