Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico. Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.
Un screen genetico per alleli mutanti che sopprimono fenotipici difetti causati da una mutazione è un approccio potente per identificare i geni che appartengono a vie biochimiche strettamente correlate. Metodi precedenti quali la matrice genetica sintetico (SGA) analisi e tecniche di mutagenesi casuale usando raggi ultravioletti (UV) o sostanze chimiche come methanesulfonate etilico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU), sono stati ampiamente usati ma sono spesso costosi e laborioso. Inoltre, questi metodi di screening basato su mutageno sono frequentemente associati a gravi effetti collaterali sull’organismo, inducendo mutazioni multiple che aggiungono alla complessità di isolare i soppressori. Qui, presentiamo un protocollo semplice ed efficace per identificare le mutazioni soppressore in mutanti che conferiscono un difetto di crescita in Schizosaccharomyces pombe. L’idoneità delle cellule ad un deficit di crescita standard multimediali liquido o mezzi liquidi sintetici possa essere monitorato per il recupero utilizzando un lettore di piastra a 96 pozzetti automatizzato per un periodo prolungato. Una volta che una cellula acquisisce una mutazione di soppressore nella cultura, suoi discendenti prevalere quelle di cellule parentali. Le cellule recuperate che hanno un vantaggio di crescita competitiva rispetto a cellule parentali possono essere isolate e backcrossed con cellule parentali. Vengono quindi identificate le mutazioni soppressore tramite sequenziamento intero genoma. Utilizzando questo approccio, abbiamo con successo isolato soppressori più che alleviare i difetti di sviluppo severo causati dalla perdita di Elf1, una famiglia di AAA + ATPasi che è importante nel trasporto di mRNA nucleare e mantenimento della stabilità genomica. Ci sono attualmente oltre 400 geni in S. pombe con mutanti che conferisce ad un difetto di crescita. Come molti di questi geni sono atipici, proponiamo che il nostro metodo si affretterà l’identificazione di nuove interazioni funzionali con questo approccio user-friendly, ad alta velocità.
La base della comprensione di legami funzionali tra geni si basa sulla capacità di identificare i meccanismi molecolari con cui tratti genetici complessi divergono per produrre fenotipi vari1. Il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la maggior parte dei geni di proteina-codificazione è superflua per redditività2. Questo risultato non parla il unimportance di questi geni, ma piuttosto intricati meccanismi compensativi le vie biochimiche a cui appartengono tali geni. Questi meccanismi compensativi di dissezione ha generato epistasi mappe, che hanno scoperto complete interazioni genetiche e ampliato la nostra comprensione dei meccanismi biochimici funzionali3,4.
Metodi di alto-rendimento (ad es., analisi sintetica matrice genetica o SGA) sono stati sviluppati per identificare interazioni genetiche del genoma in lievito e sono state ampliate per fissione lievito5,6. Tali approcci si basano spesso su una libreria di valida tutte le singole delezioni gene proteina-codificazione dei ceppi (circa 3.300 mutanti di delezione aploide che coprono oltre il 92% del genoma di lievito di fissione) e richiedono un braccio robotico per eseguire incroci genetici tra il ceppo di interesse e tutti i possibili ceppi nella library6. Inoltre, tecniche di SGA dipendano dalla capacità dei ceppi di libreria per avere la corretta ed efficiente di accoppiamento, un fenotipo che è anormale al 444 attualmente caratterizzati geni in S. pombe2.
Nonostante la complessità delle interazioni genetiche, confrontando il fenotipo di un ceppo che trasportano le mutazioni in due geni al fenotipo di due ceppi che presentano mutazioni individuali di ciascun gene può avere uno dei due risultati importanti: 1) il doppio fenotipo mutante è peggio che i fenotipi parentali moltiplicativi previsti sotto forma di malattia o, nel caso più estremo, letalità. Questo è indicato come un’interazione genetica negativa ed è generalmente un segno che i due geni agiscono in parallele vie biologiche. 2) il fenotipo mutante doppio è meglio che la combinazione prevista dei fenotipi parentali, noto anche come una positiva interazione genetica. Una positiva interazione genetica è particolarmente interessante perché indica che questi geni funzionano nello stesso processo. Due geni positivamente interagenti hanno tre potenziali relazioni: un gene mutante può up-regolare l’espressione del gene in un percorso parallelo, due geni possono lavorare in concerto all’interno della stessa via a valle di uno altro, o i due geni codificano per proteine che interagiscono direttamente con l’altro. Di conseguenza, positive interazioni genetiche utilizzabile per nodi normativi gene di mappare e classificare geni atipici nelle vie biochimiche7,8.
Un soppressore è una mutazione che può alleviare il fenotipo di malattia della mutazione di un altro gene, in genere rappresenta una positiva interazione genetica tra i due geni9,10. Mutazioni di soppressore su un luogo diverso da quello della mutazione che sopprimono sono conosciute come soppressori di extragenic. Essi sono particolarmente preziosi nello studiare le mutazioni genetiche non vitali di salvataggio sinteticamente il fenotipo letale (conosciuto anche come l’effetto del Lazarus)11. Essi hanno anche potenziali applicazioni terapeutiche nel trattamento di malattie ereditarie12,13.
Per tutte queste ragioni, l’identificazione di mutazioni soppressore in vari organismi di modello è stata ampiamente utilizzata per facilitare la nostra comprensione di varie vie biochimiche14,15,16. Screening per soppressori è basato solitamente sul fenotipo della mutazione in questione e richiede lo svolgimento di mutagenesi casuale per isolare le mutazioni che alleggerirebbe il fenotipo. Quasi tutti gli organismi modello hanno stabilito metodi mutagenesi casuale. Ad esempio, N-etil-N-nitrosourea (ENU) ed ethylmethanesulfonate (EMS), due agenti mutageni che sono in grado di indurre mutazioni puntiformi nel DNA, sono largamente impiegate in vari modelli da batteri a topi17,18,19 . Inoltre, cloruro di manganese è stato utilizzato a lungo sui lieviti per la capacità del catione del manganese di inibire il DNA riparazione vie20. Un altro approccio comune è mutagenesi indotta da UV, che genera il genoma mutagene della pirimidina dimeri21,22.
Anche se l’utilizzo di mutagenesi chimica per identificare le mutazioni soppressore è stato popolare, il metodo ha molti svantaggi, compreso l’uso di prodotti chimici pericolosi, i tassi di successo altamente variabile e l’introduzione di variabili extra confusione presentato da effetti collaterali negativi di mutageno su più processi cellulari23,24. Inoltre, mutagenesi chimica induce spesso più mutazioni nel genoma che aggiunge alla complessità dell’utilizzo di genetica e tecniche di sequenziamento per identificare la mutazione esatta che ha conferito il fenotipo soppressore nell’ organismo25.
Per colmare le lacune degli attuali approcci di mutagenesi, presentiamo un metodo alla schermata per le mutazioni spontanee soppressore in lievito di fissione che non si basano su qualsiasi mutageni o una libreria di eliminazione. Il metodo consente di isolare soppressori attraverso un test di selezione positiva. Il principio di questo metodo si basa sul vantaggio di crescita della sottopopolazione soppressore mutato in coltura liquida, che può essere monitorata da un lettore di piastre automatizzato. Corrispondersi e meiosi vengono utilizzate solo se uno vorrebbe ripulire il background genetico o confermare la presenza di alleli monogeniche di soppressori prima di sequenziamento intero genoma. Se il fenotipo di soppressione è causato da una singola mutazione, il fenotipo soppressore segregare i 2:2 dopo retroincroci con i ceppi parentali. Le mutazioni di soppressore possono quindi essere identificate mediante sequenziamento intero genoma. Proponiamo che questo metodo è applicabile per lo screening di soppressori in tutti i microrganismi che possono crescere fino a una grande popolazione in coltura liquida.
Il protocollo descritto qui rappresenta un romanzo e una semplice schermata per le mutazioni spontanee soppressore rilevabile attraverso recupero fenotipica delle mutazioni che conferiscono una crescita lenta nel lievito di fissione, un fenotipo caratteristico di oltre 400 geni in S. pombe, la funzione di molte delle quali rimane sconosciuto2,32. Metodi precedenti hanno preso altri approcci allo schermo per mutazioni soppressore nei microrganismi, tra cui l’uso di agenti mutageni21, o l’applicazione di un cambiamento di temperatura in sfondi mutante termosensibile33. Al contrario, questo protocollo Mostra che recupero fenotipico si verifica senza interferenza ambientale/chimico ed evidenzia il vantaggio di fitness dell’aumento delle mutazioni di soppressione alla fine prendendo sulle risorse disponibili in liquido cultura. Questa schermata permette l’isolamento di soppressori di bypass o di soppressori di interazione perché è efficace per entrambe le mutazioni di perdita-de-funzione come elf1∆ o fal1∆ e mutazioni puntiformi come clr6-1, fintanto che i mutanti dimostrano i difetti di fitness in coltura liquida.
Finora, tutti i ceppi di S recuperati che abbiamo studiato hanno dimostrato vari gradi di recupero fenotipica. Come rilevato attraverso incroci genetici, il fenotipo recuperato è attribuibile ad un singolo elemento genetico ed è ereditabili (esempi mostrati nella Figura 2). Questo è uno dei vantaggi più significativi di questo metodo rispetto agli schermi di soppressore basato su UV o chimico, che spesso prendono di mira più loci genomici. È comune osservare una o due colonie recuperati fuori 16 colonie/ceppo (10% circa) entro una settimana. Tuttavia, abbiamo notato che alcuni mutanti, come ad esempio la perdita di funzione di Rrp6, la subunità nucleari specifici esosomi, mai recuperato per il tasso di crescita quasi selvaggio-tipo osservato in cellule di elf1Δ 31. È probabile che la funzione di Rrp6 può essere compensata solo parzialmente da soppressori, a differenza della funzione di altri mutanti testato, tra cui fal1∆, che è stato indicato per causare un grave difetto meiotico attraverso la sua importante funzione nella regolamentazione 34di splicing. Noi crediamo che soppressore alternativi metodi di screening sarebbe soggetto al problema stesso quando yfg ha ruoli unici, non sostituibile nella crescita delle cellule.
Prima di eseguire il sequenziamento genomico, è ottima per retro-croce le colonie fenotipico recuperate, identificate dal lettore della piastra, con i ceppi parentali per cancellare i precedenti genetici e ottenere repliche biologiche. Inoltre, sequenziamento profondo intero genoma identifica centinaia di modifiche di singolo nucleotide, la maggior parte dei quali non sono identica tra repliche biologiche che sono di scarso interesse per lo screening. Ad esempio, abbiamo trovato un totale di 660 alterazioni genomiche tra tutti i tre cromosomi tra le due elf1Δ P e cinque diversi ceppi di S (Figura 3). Non abbiamo comunemente osservato mutazioni identiche tra biologico sequenziata replica di ogni ceppo, suggerendo che nuove mutazioni possono sorgere durante la coltura delle cellule di elf1Δ prima della costruzione della libreria genomica o errori casuali possono essere introdotta durante la costruzione della libreria e il sequenziamento. Quindi, isolando le mutazioni che sono coerenti in replicati biologici è un aspetto importante nell’identificazione riuscita di soppressori mediante sequenziamento intero genoma.
Abbiamo identificato e confermato due soppressori nelle regioni di CD in cinque sequenziate ceppi di S. Sebbene sia S-A1 e A2 S ceppi sono state individuate mutazioni in SPBPJ4664.02 , è improbabile che SPBPJ4664.02 è un soppressore valido perché S-A1 e S-A2 non contengono un soppressore sullo stesso gene, come non sono complementari con l’altro ( dati non mostrati). Abbiamo anche avuto conferma non rli1 in S-A3, che non ha fatto co-segregano con il fenotipo di S quando backcrossed con elf1Δ. In alternativa, abbiamo trovato specifiche mutazioni nelle regioni non codificanti in S-A1, A2-S e S-A3. È possibile che queste regioni genomiche non codificanti alterate alleviare il fenotipo di elf1Δ , che sarà affrontato nei nostri studi futuri. Rispetto ai metodi tradizionali come un’analisi di linkage, che può richiedere anni per mappare una mutazione genetica, abbiamo identificato due soppressori entro due mesi dopo la conferma che un elemento monogenico causato il fenotipo di S. Con il rapido sviluppo della tecnologia di sequenziamento di interi genomi, siamo ottimisti che questo metodo sarà più efficiente per identificare le mutazioni genetiche coerente nel prossimo futuro.
In sintesi, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per identificare con successo le mutazioni soppressore per ogni gene di interesse con un difetto di crescita lenta in coltura liquida. La semplicità di questo test consente per lo screening su larga scala dei più ambiti di provenienza genetici di interesse con poco addestramento hands-on. C’è spazio per automatizzare ulteriormente il processo utilizzando un robot di manipolazione dei liquidi per eseguire le diluizioni quotidiane. Poiché il laboratorio di manipolazione di microrganismi richiede inevitabilmente la crescita in coltura liquida, un processo che è intrinsecamente selettivo per il fitness, proponiamo che questo protocollo può essere ampiamente applicato ad altri organismi di modello di grande popolazione come i batteri e altre specie di lieviti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences, sovvenzioni 1R15GM119105-01 di K.Z. Ringraziamo tutti gli ospiti per penetranti commenti. Ringraziamo anche James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth nero e Glen Marrs per la discussione e Commenti su questo manoscritto.
Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100×15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range |
Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
Sterile workspace and burners | |||
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |