Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir. Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.
Bir mutasyon kaynaklanan fenotipik kusurlar bastırmak mutant gen için genetik bir ekran yakından ilgili biyokimyasal yolları ait genlerin tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Önceki yöntemler sentetik genetik dizi (SGA) analiz ve ultraviyole (UV) veya etil methanesulfonate (EMS) veya N-etil-N-nitrosourea (TRK), gibi kimyasallar kullanarak rastgele mutagenesis teknikleri gibi yaygın olarak kullanılan ancak çoğu kez pahalı ve zahmetli. Ayrıca, bu alkil tabanlı tarama yöntemleri sık bastırıcılarının ayırma karmaşıklığına ek birden çok mutasyonlar inducing organizma üzerinde ciddi yan etkileri ile ilişkilidir. Burada, hangi Schizosaccharomyces pombebir büyüme üründe görüşmek mutantlar mutasyonların bastırıcı tanımlamak için basit ve etkili bir iletişim kuralı mevcut. Fitness standart zengin sıvı veya sentetik sıvı ortamlardan bir büyüme eksikliği içeren hücrelerin üzerinde uzun bir süre bir otomatik 96-şey plaka okuyucu kullanarak kurtarma için izlenebilir. Bir hücre kültürü bir bastırıcı mutasyon satın aldı sonra alt öğelerin bu ebeveyn hücre kul. Ebeveyn hücreleri üzerinde bir rekabetçi büyüme avantaj içeren kurtarılan hücreleri izole ve ebeveyn hücreleri ile backcrossed. Bastırıcı mutasyon sonra bütün-genom sıralama kullanılarak tanımlanır. Bu yaklaşımı kullanarak, başarılı bir şekilde Elf1, bir AAA + aile nükleer mRNA taşıma ve genomik istikrar bakımından önemlidir ATPaz kaybı nedeniyle ciddi büyüme kusurları hafifletmek birden çok bastırıcılarının izole ettim. Sitemizde şu anda 400 genler üzerinde S. pombe içinde büyüme hata conferring mutantlarla. Bu genlerin uncharacterized çoğu gibi bizim yöntemi kullanıcı dostu, yüksek-den geçerek bu yaklaşımla roman fonksiyonel etkileşimleri tanımlaması acele edecektir öneriyorum.
Genler arasındaki fonksiyonel bağlantılar anlayışının temelini hangi tarafından çeşitli fenotipleri1üretmek için karmaşık genetik özellikleri sapmak moleküler mechanism(s) tanımlama yeteneği dayanır. Fisyon mayası, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), protein kodlayıcı genlerin çoğunluğu canlılık2için gereksiz. Bu sonuç, bu genlerin önemsizlik ama oldukça karmaşık telafi edici mekanizmaların böyle genler ait biyokimyasal yolları temel konuşmuyor. Bu telafi edici mekanizmaların dissekan kapsamlı genetik etkileşimler ele geçen ve fonksiyonel biyokimyasal yolları3,4anlayışımızı genişletti epistasis haritalar üretti.
Yüksek üretilen iş yöntemleri (örneğin, sentetik genetik dizi analizi veya ÖYD) mayası genom genelindeki genetik etkileşimler tanımlamak ve fisyon mayası5,6kullanmak için genişletilmiş için geliştirilmiştir. Bu tür yaklaşımlar, çoğunlukla tüm uygun tek protein kodlayıcı gen silme içeren suşları içeren bir kitaplık kullanır (kapsayan yaklaşık 3300 haploit silme mutantlar fisyon mayası genom üzerinde % 92) ve genetik haçlar arasında gerçekleştirmek için bir robot kol gerektirir ilgi ve library6 tüm olası suş strain. Ayrıca, SGA teknikleri doğru ve verimli çiftleşme yeteneğimizi Kütüphane suşlarının üzerinde bağlıdır, şu anda 444 için anormal bir fenotip S. pombe2genler ile karakterizedir.
Genetik etkileşimler karmaşıklığına rağmen büyük bir yük için bireysel mutasyonlar her gen taşıyan iki suşlar fenotip iki genlerdeki mutasyonlar taşıyan fenotip karşılaştırma birinde iki önemli sonucu olabilir: 1) Çift Kişilik mutant fenotip olduğunu beklenen çarpımsal ebeveyn fenotipleri hastalık şeklinde veya en aşırı durumda, ölümcül daha kötü. Bu, negatif bir genetik etkileşim adlandırılır ve genellikle iki gen paralel biyolojik yollar hareket bir işarettir. 2) Çift Kişilik mutant fenotip ebeveyn fenotipleri, olarak da bilinen olumlu bir genetik etkileşim beklenen kombinasyonu iyidir. Olumlu bir genetik etkileşim özellikle ilginç çünkü bu genlerin aynı işlemde işlev gösterir. İki olumlu etkileşen genlere sahip üç olası ilişkileri: bir mutant gen up-paralel bir yol diğer gen ifadesinin düzenleyen, iki gen birbirine aynı yolu aşağı içinde konserde çalışabilir veya iki gen kodlamak birbirleriyle doğrudan etkileşim proteinler. Bu nedenle, pozitif genetik etkileşimler gen düzenleyici düğümleri eşleme ve biyokimyasal yolları7,8uncharacterized genlerinde sınıflandırmak için kullanılabilir.
Bir bastırıcı genellikle iki gen9,10arasında pozitif bir genetik etkileşim temsil eden başka bir gen mutasyon hastalık fenotip hafifletmek olabilir bir mutasyon var. Onlar bastırmak mutasyon bundan farklı bir odağı üzerinde baskılayıcı mutasyonlar extragenic bastırıcılarının bilinir. Onlar sentetik öldürücü fenotip (Lazarus etkisi olarak da bilinir)11tahlisiye tarafından uygun olmayan Genetik mutasyonlar okumak özellikle değerlidir. Onlar da kalıtsal hastalıklar12,13tedavisinde potansiyel terapötik uygulamalar var.
Tüm bu nedenlerle, çeşitli model organizmalar mutasyonların bastırıcı tanımlaması yaygın olarak çeşitli biyokimyasal yolları14,15,16anlayışımızı kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Tarama için bastırıcılarının genellikle söz konusu mutasyon fenotip üzerinde temel alır ve fenotip hafifletmek mutasyonlar yalıtmak için rastgele mutagenesis iletken gerektirir. Hemen hemen tüm canlılar rasgele mutagenesis yöntemleri kurduk. Örneğin, N-etil-N-nitrosourea (TRK) ve ethylmethanesulfonate (EMS), nokta mutasyonlar DNA inducing Kabil, yaygın olarak çeşitli bakteri fareler17,18,19 modelleri ve istihdam edilmektedir iki değiştirme . Buna ek olarak, mangan klorür uzun Mayalar manganez katyon yetenek DNA onarım yolları20inhibe için kullanılmıştır. Başka bir ortak yaklaşım genom çapında mutajenik pirimidin dimer21,22oluşturur UV kaynaklı mutagenesis var.
Bastırıcı mutasyonlar tanımlamak için kimyasal mutagenesis kullanımı popüler olmasına rağmen birçok sakıncaları, tehlikeli kimyasallar, son derece değişken başarı oranları ve giriş ekstra karıştırıcı değişkenlerin kullanımı da dahil olmak üzere yöntemi vardır birden çok hücresel23,24alkil olumsuz yan etkileri tarafından sunulan. Ayrıca, kimyasal mutagenesis kez birden çok karmaşıklığı kullanarak genetik ve organizma25bastırıcı fenotip haiz tam mutasyonu tanımlamak için sıralama teknikleri ekler genom mutasyonların neden olmaktadır.
Güncel mutagenesis yaklaşımları eksiklikleri gidermek için herhangi bir değiştirme veya silme kitaplıkta dayanmaz fisyon mayası spontan bastırıcı mutasyonlar için ekran için bir yöntem mevcut. Yöntem bastırıcılarının pozitif seçim tahlil ile izole ediyor. Bu yöntem prensibi bir otomatik plaka okuyucu tarafından izlenebilir sıvı kültüründe mutasyona uğramış bastırıcı subpopulation büyüme avantajı temel alır. Sadece bir genetik arka plan kadar temiz ya da monogenic allelleri bastırıcılarının bütün-genom sıralama önce varlığını doğrulamak istiyorsanız çiftleşme ve mayoz kullanılır. Bastırma fenotip tek bir mutasyon neden olup olmadığını, bastırıcı fenotip 2:2 ebeveyn suşları ile backcrossing sonra ayırmak. Bastırıcı mutasyon sonra bütün-genom sıralama kullanılarak belirlenebilir. Önerdiğimiz bu yöntem büyük bir nüfus için sıvı kültüründe büyüyebilir tüm mikroorganizmaların bastırıcılarının eleme için geçerlidir.
Burada açıklanan Protokolü temsil eden bir roman ve spontan bastırıcı mutasyonlar fisyon mayası, bir fenotip S. pombe, 400’den fazla genlerin karakteristik yavaş büyüme veriyor mutasyonların fenotipik kurtarma yoluyla tespit için basit ekran Bunların çoğu fonksiyonun bilinmeyen2,32kalır. Önceki yöntemler mikroorganizmaların mutajen21kullanımı veya uygulamanın bir sıcaklık değişimi sıcaklığa duyarlı mutant arka planlar33olarak da dahil olmak üzere, mutasyonların bastırıcı için ekran için diğer yaklaşımlar almış. Buna ek olarak, bu iletişim kuralını fenotipik kurtarma ek çevre/kimyasal sorunsuz oluşur ve sıvı içinde kullanılabilir kaynakları sonunda devralarak bastırma mutasyonlar yükselişi fitness avantajı vurgular gösterir Kültür. Elf1∆ veya fal1∆ gibi her iki işlev kaybı mutasyonlar ve nokta mutasyon gibi clr6-1, mutantlar olarak sürece etkilidir çünkü bu ekran bypass bastırıcılarının veya etkileşim bastırıcılarının yalıtım sağlar Fitness kusurları sıvı kültüründe göstermektedir.
Şimdiye kadar biz araştırdık tüm kurtarılan S suşları fenotipik kurtarma değişen derecelerde göstermiştir. Genetik geçiş yoluyla tespit gibi kurtarılan fenotip tek genetik öğe atfedilebilecek olup ( Şekil 2‘ de gösterilen kalıtsal örnekler). Bu yöntem genellikle birden fazla genomik loci hedef kimyasal veya UV tabanlı bastırıcı ekranlara kıyasla en önemli avantajlarından biri bu. 16 kolonileri dışında/soy (%10) kurtarılan bir ya da iki kolonileri gözlemlemek için ortaktır bir hafta içinde. Ancak, biz kaybı-in-işlevini hiç bulunamadı neredeyse vahşi türü büyüme oranı Rrp6, nükleer özgü eksozom alt birim gibi belirli mutantlar elf1Δ hücreleri31içinde gözlenen fark ettim. Rrp6 fonksiyonu yalnızca kısmen bastırıcılarının, önemli işlevi aracılığıyla ağır segregasyonun kusuru düzenleyici içinde neden için gösterilen fal1∆, dahil olmak üzere test, diğer mutantları işlevinin aksine tarafından telafi ki muhtemelen 34eklemek. Yfg benzersiz, değiştirilebilir roller hücre büyüme olduğunda eleme yöntemleri bu alternatif bastırıcı aynı sorun tabi olacağına inanıyorum.
Genomik sıralama gerçekleştirmeden önce arka çapraz plaka-okuyucu, genetik arka plan temizlemek ve biyolojik çoğaltır elde etmek için ebeveyn suşları ile tanımlanan phenotypically kurtarılan kolonileri için en iyi yöntemdir. Buna ek olarak, derin bütün genom sıralama tek nükleotid değişiklikleri olan en küçük ilgilendikleri için tarama biyolojik çoğaltır arasında özdeş değil, yüzlerce tanımlar. Örneğin, iki elf1Δ P ve beş farklı S suşları (şekil 3) arasındaki tüm üç kromozomlar arasında Toplam 660 genomik değişikliklerini bulduk. Biz yaygın olarak sıralı biyolojik arasında özdeş mutasyonlar çoğaltır her tür yeni mutasyonlar genomik Kütüphanesi inşaat önce elf1Δ hücreleri kültür sırasında çıkabilecek veya rasgele hatalar olabilir düşündüren gözlemleme Kütüphane inşaat ve sıralamanın sırasında tanıttı. Bu nedenle, biyolojik çoğaltır tutarlı mutasyonlar yalıtma bastırıcılarının bütün-genom sıralama kullanarak başarılı tanımlaması içinde önemli bir yönü var.
Tespit ve beş sıralı S suşları CD bölgelerde iki bastırıcılarının doğruladı. SPBPJ4664.02 mutasyonlar S-A1 ve S-A2 suşları tespit edildi, SPBPJ4664.02 geçerli bir bastırıcı çünkü onlar () ile birbirlerini tamamlayıcı değildir olarak S-A1 ve S-A2 bir bastırıcı aynı gen içermez olası olsa da veri) gösterilmez. Ayrıca rli1 elf1Δile backcrossed S fenotip ile birlikte ayırmak değil S-A3’doğruladı değil. Alternatif olarak, belirli mutasyonlar kodlamayan bölgeler S-A1, S-A2 ve S-A3 bulduk. Bu değiştirilmiş bu kodlamayan genomik bölgeler bizim gelecekteki çalışmalarda ele alınacaktır elf1Δ fenotip hafifletmek mümkündür. Gibi bir genetik mutasyon eşlemek için yıl sürebilir, bir bağlantı yöntemi, geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında biz monogenic bir öğe S fenotip neden teyit sonra iki ay içinde iki bastırıcılarının tespit. Bütün-genom sıralama teknolojinin hızlı gelişimi ile bu yöntem tutarlı Genetik mutasyonlar öngörülebilir gelecekte tanımlamak için daha verimli olacaktır iyimser.
Özet olarak, bu iletişim kuralı başarıyla herhangi bir gen bastırıcı mutasyonlar sıvı kültüründe yavaş büyüyen bir kusur ile ilgi tanımlamak için adım adım yönergeler sağlar. Bu tahlil sadeliği birden fazla genetik arka plan ilgi küçük uygulamalı eğitim ile büyük ölçekli tarama sağlar. Daha fazla işlem günlük dilutions gerçekleştirmek için bir sıvı işleme robot kullanarak otomatik hale getirmek için oda var. Laboratuvar manipülasyon mikroorganizmaların kaçınılmaz büyüme sıvı kültüründe, uygunluk, doğal olarak seçici bir işlemde gerektirdiğinden önerdiğimiz bu protokol geniş bakteri gibi diğer büyük nüfus model organizmalar için uygulanabilir ve diğer Maya türler.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü, hibe 1R15GM119105-01 K.Z. için destek verdi Bütün yorumcular anlayışlı yorum için teşekkür ederiz. Biz de James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth siyah ve Glen Marrs tartışma ve bu el yazması üzerine yorumlar için teşekkür ederim.
Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100×15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range |
Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
Sterile workspace and burners | |||
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |