Vi rapporterer en simpel og alsidig metode til at udføre fluorescerende live-billeddannelse af Arabidopsis thaliana blade over en længere periode. Vi bruger en gensplejsede Arabidopsis plante at udtrykke et fluorescerende reporter gen under kontrol af en immunitet-relaterede promotor som et eksempel for at få spatiotemporelle forståelse af plante immunrespons.
Plante immunrespons tilknyttet en genome-wide transcriptional omprogrammering er indledt på infektionsstedet. Derfor, immunresponset reguleres rumligt og tidsligt. Brugen af et fluorescerende gen under kontrol af en immunitet-relaterede promotor i kombination med en automatiseret Fluorescens mikroskopi er en enkel måde at forstå spatiotemporelle regulering af anlægget immunitet. I modsætning til root væv, der har været brugt i en række forskellige intravital fluorescerende imaging eksperimenter, findes der få fluorescerende live imaging eksempler for blad væv, der støder på en bred vifte af luftbårne mikrobielle infektioner. Derfor, har vi udviklet en enkel metode til at montere blade af Arabidopsis thaliana planter til live-celle imaging over en længere periode. Vi brugte gensplejsede Arabidopsis planter at udtrykke gul fluorescerende proteiner (YFP) genefused til nukleare lokalisering signal (NLS) under kontrol af promotor af et forsvar-relaterede markørgen, () Pathogenesis-Related 1 PR1). Vi infiltreret en transgene blad med Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (avrRpt2) stamme (Pst_a2) og udføres in vivo time-lapse billeddannelse af YFP signalet for i alt 40 h ved hjælp af en automatiseret fluorescens stereomikroskopet. Denne metode kan udnyttes, ikke kun for undersøgelser af plante immunrespons, men også for analyser af forskellige udviklingsmæssige begivenheder og miljømæssige svar forekommer i blad væv.
Plante immunrespons indebærer en dynamisk transcriptional omprogrammering reguleret af flere transskription faktorer samt Phytohormoner1. Ophobning af transkriptom data giver mulighed for at indsamle oplysninger om anlægget immunsystemet: for eksempel, netværksstruktur signalering kaskader2. Vores viden om den rumlige og tidsmæssige dynamikken i anlægget immunitet forbliver dog stadig begrænset3,4,5.
I tidligere undersøgelser, har spatiotemporelle regulering af forsvarsrelaterede genekspression primært analyseret ved hjælp af in situ hybridisering og en β-glucuronidasesystemer (GUS) reporter assay6,7,8. Disse metoder gør det muligt at visualisere transcriptional aktiveringen af forskellige gener af interesse på stedet. Men disse procedurer kræver kemisk fiksering af prøver, og dermed resultere i tab af alle tidsmæssige oplysninger. Biologiske hændelser, såsom immunitet, fremskridt over tid. Brug af luciferase som reporter har aktiveret erobringen af tidsmæssige dynamics af interesse3fredsskaber. Luciferase-baserede analyse kræver imidlertid en bekostelig substrat og meget følsomme detektorer. For at øge vores forståelse af de spatiotemporelle aspekter af plante immunresponset ved hjælp af en enkel procedure, vi genereret gensplejsede Arabidopsis thaliana planter at udtrykke gul fluorescerende proteiner (YFP) genet smeltet til den nukleare lokalisering signal (YFP-NLS) under kontrol med promotor af den forsvarsrelaterede markørgen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Vi brugte klorofyl autofluorescence, en markør af levende celler, til at fange processen af programmeret celledød (PCD), som ofte opstår under effektor-udløst immunitet (ETI), en form for anlægget immunitet induceret af specifikke patogen infektion9 , 10. overvågning tidsmæssige dynamikken af fluorescens signal intensitet i frit bevægelige objekter, såsom levende Arabidopsis blade, kræver en kompleks billedbehandling software enten indbygget in-house eller tilgængelige kommercielt. Alternativt, forhindrer enheder fra at flytte er en enkel metode til at løse problemet. Her udviklede vi en alsidig og enkel metode til montering bor blade af en gensplejsede Arabidopsis anlæg til langsigtet observation under en automatiseret fluorescens stereomikroskopet. Metoden tillader os at hente promoter dynamik inden for jord-vokset intakt plante blade over et par dage.
Her rapporterer vi en enkel metode til at montere en levende Arabidopsis blad udtrykker et fluorescerende reporter gen under kontrol af en promotor af interesse for langsigtet observation ved hjælp af en automatiseret fluorescerende stereomikroskopet. Time-lapse imaging af en fluorescerende reporter har været ofte udføres i root væv; dog er kun et par lignende undersøgelser blevet gennemført i blad væv. Dette er mest sandsynligt fordi bladene kan frit bevæge sig i rummet, mens rødder er ofte begravet og fast i solid agarsubstratet.
I denne rapport fokuserer vi på spatiotemporelle dynamikken i pPR1 aktivitet under ETI induceret af Pst_a2. Udover den blide fiksering af bladet beskrevet ovenfor, er det vigtigt klart visualisere spatiotemporelle dynamikken i cellulære begivenheder som promotor aktivering og PCD. Hvis skelnen mellem celler viser pPR1 aktivitet og PCD ikke er skarpe, Sørg for at alle intercellulære rum i området infiltreret helt fyldt med patogenet suspension (Se trin 2.4). Dette er kritisk, når ved hjælp af wide-felt fluorescens stereomikroskoper, da disse mikroskoper fange alle påviselige signaler langs den samme lodrette placering af modellen. Klorofyl autofluorescence fra overlevende celler over eller under cellerne i domænet PCD masker nemt de døde celler udviser ingen autofluorescence. Dette gælder også for YFP signal.
Betingelser for time-lapse imaging skal være etableret omhyggeligt gennem flere foreløbige forsøg under forskellige forsøgsbetingelser. Parametre for time-lapse imaging afhænger af flere faktorer såsom mikroskopiske system, transgene planter og patogener. For at opnå disse parametre, analyseret vi først forskellige eksponeringstider for YFP signal intensitet i infiltreret bladet på 7 hpi, som næsten falder sammen med den første aktivering af pPR1. En 5 s eksponering blev fastsat som passende til at indfange YFP signal med stereomikroskopet anvendes i denne undersøgelse. En lignende test blev udført for imaging klorofyl autofluorescence. Udsættelse af modellen for lys mellem 3 min. mellemrum var indkodet i time-lapse billedbehandlingsprogrammet som normale lysfelt imaging med maksimal eksponeringstid. Vores system (Table of Materials) tillod os at have 2,5 min ud over YFP, TXR og lysfelt billeddannelse. Denne betingelse var den primære grund til at vælge et interval på 3 min. Næste, vi bekræftet, at denne time-lapse betingelse forårsagede ingen synlige skader på planten prøver, og ikke fremkalde ektopisk lys stress-relaterede aktivering af pPR1 (fig. 3B, C). Dette førte til udviklingen af det program, der bruges i denne undersøgelse. Således, 3-min. intervaller af fluorescens imaging blev anset for tilstrækkeligt til at indfange pPR1 dynamics under Pst_a2-medieret ETI9.
Promotor-reporter konstruktioner, har især med fluorescerende journalist smeltet til NLS, udnyttet af mange grupper, og er let tilgængelige fra forskersamfundet; vi brugt den udgivet af Kubo et al. 13. dermed, protokollen beskrevet her kan bruges i enhver plante biologi studiet undersøger blad væv, hvis relevante transgene planter er tilgængelige. Vores enkle og let protokollen giver en stor chance for forskere, der er ivrige efter at analysere de spatiotemporelle dynamics enhver biologisk hændelse forekommer i blade, som immunrespons. Det er plausibelt, at vores metode ved hjælp af tape stykker fremkalder en lille fysisk stress på enhederne. Men dette spørgsmål kan styres ved at medtage passende positive og negative kontroller, såsom mock behandlinger, i eksperimenter (figur 3C). De eksperimentelle betingelser kan være yderligere ændret og optimeret ved at analysere disse kontrolelementer under forskellige betingelser.
I de seneste år, har hurtige udvikling af imaging instrumenter og teknikker stimuleret interesse af forskere i de komplekse spatiotemporelle aspekter af biologiske hændelser. I enhver tænkelig analyse er passende montering og fastsættelse af enheder blandt de vigtigste spørgsmål. Den enkle og alsidig metode til montering levende Arabidopsis efterlader udviklet i denne undersøgelse kan anvendes og optimeret til forskellige imaging eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Japan videnskab og teknologi agenturet [PRESTO117665 til S.B., ERATOJPMJER1502 til NN] og ved Japan samfundet til fremme af videnskab (Grants-in-Aid for forskning aktivitet Start-up [22880008 til S.B.] og for unge forskere (B) [ 23780040 til S.B.]). Vi takker A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa og E. Betsuyaku for fremragende teknisk bistand, J. Parker for at give den Pst_a2 stamme, og T. Demura for at give pBGYN vektor.
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |