Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.
De plant-immuunrespons die geassocieerd met een transcriptionele herprogrammering van genoom-brede wordt gestart op de plaats van de infectie. Dus, de immuunrespons ruimtelijk en stoffelijk is geregeld. Het gebruik van een fluorescerende gen onder de controle van een immuniteit-gerelateerde promotor in combinatie met een geautomatiseerde fluorescentie microscopie is een eenvoudige manier om te begrijpen van de spatio regulering van de immuniteit van de plant. In tegenstelling tot de root-weefsels die zijn gebruikt voor een aantal verschillende intravital fluorescerende imaging experimenten, bestaan er enkele fluorescerende live-imaging voorbeelden voor het blad weefsels die een matrix van airborne microbiële infecties optreden. Daarom ontwikkelden we een eenvoudige methode om te koppelen van de bladeren van Arabidopsis thaliana planten voor leven-cel beeldvorming over een langere periode van tijd. We gebruikten transgene planten van Arabidopsis uiting geven aan de gele fluorescerende eiwit (YFP) genefused aan de nucleaire localisatie signaal (NLS) onder de controle van de promotor van een defensie-gerelateerde marker-gen, () Pathogenesis-Related 1 PR1). We geïnfiltreerd een transgene blad met Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (avrRpt2) stam (Pst_a2) en in vivo time-lapse beeldvorming van het signaal van de YFP voor een totaal van 40 h met gebruikmaking van een geautomatiseerde fluorescentie stereomicroscoop uitgevoerd. Deze methode kan worden gebruikt, niet alleen voor studies over de immuunreacties van de plant, maar ook voor analyses van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen en milieu reacties die zich voordoen in blad weefsels.
Plant immuunrespons impliceert een dynamische transcriptionele herprogrammering geregeld meerdere transcriptie factoren evenals fytohormonen1. De accumulatie van transcriptome gegevens biedt mogelijkheden voor het verzamelen van informatie op het immuunsysteem van de plant: bijvoorbeeld, de structuur van het netwerk van signalering cascades2. Onze kennis van de ruimtelijke en temporele dynamiek van de immuniteit van de plant blijft echter nog steeds beperkt3,4,5.
In eerdere studies, heeft Spatio regulering van defensie-gerelateerde genexpressie zijn meestal geanalyseerd met behulp van de kruising in situ en β-glucuronidase (GUS) verslaggever assay6,7,8. Deze methoden kunnen visualiseren de transcriptionele activering van verschillende genen van belang ter plaatse. Echter deze procedures vereisen chemische fixatie van specimens, en dus leiden tot het verlies van alle tijdelijke informatie. Biologische gebeurtenissen, zoals immuniteit, vooruitgang na verloop van tijd. Het gebruik van luciferase als verslaggever heeft de opname van tijdelijke dynamiek van de promotor van belang3ingeschakeld. Luciferase gebaseerde bepaling vereist echter een dure substraat en zeer gevoelige detectoren. Het vergroten van ons begrip van de spatio aspecten van de immuunrespons van de plant met behulp van een eenvoudige procedure, we genereerden transgene Arabidopsis thaliana planten uiting geven aan de gele fluorescerende eiwit (YFP) gen gesmolten tot de nucleaire localisatie signaal (YFP-NLS) onder de controle van de promotor van de defensie-gerelateerde marker-gen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. We chlorofyl autofluorescence, een marker van levende cellen, gebruikt voor het vastleggen van het proces van geprogrammeerde celdood (PCD), die vaak tijdens effector geactiveerd immuniteit (ETI), een vorm van plant immuniteit geïnduceerd door specifieke pathogen infectie9 optreedt , 10. monitoring van de temporele dynamiek van fluorescentie signaalsterkte in vrij bewegende objecten, zoals wonen Arabidopsis bladeren, vereist een complexe beeld processing software beschikbaar of gebouwde huis commercieel. Anderzijds is verhinderen dat specimens verplaatsen een eenvoudige methode om het probleem op te lossen. Hier, ontwikkelden we een veelzijdige en eenvoudige methode voor montage leven van de bladeren van een transgene plant Arabidopsis voor de lange termijn waarneming onder een geautomatiseerde fluorescentie stereomicroscoop. De methode kan we vangen de promotor dynamiek binnen bodem-gegroeid intact plant over een paar dagen laat.
Wij rapporteren hier een eenvoudige methode om te monteren een levende Arabidopsis bladeren die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor van belang zijn voor de lange termijn observatie met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende stereomicroscoop. Time-lapse beeldvorming van een fluorescerende verslaggever is vaak uitgevoerd in wortel weefsels; echter, slechts een paar vergelijkbare studies zijn uitgevoerd in blad weefsels. Dit komt waarschijnlijk omdat de bladeren zijn kunnen vrij bewegen in de ruimte, overwegende dat wortels zijn vaak begraven en vastgesteld in solide agar medium.
In dit verslag, we gericht op de spatio dynamiek van pPR1 activiteit tijdens ETI geïnduceerd door Pst_a2. Naast de zachte fixatie van het blad hierboven is uiteengezet, is het belangrijk om duidelijk visualiseren de spatio dynamiek van cellulaire gebeurtenissen zoals de activering van de promotor en PCD. Als het onderscheid tussen cellen met pPR1 activiteit en PCD niet scherp is, zorg ervoor dat alle van de intercellulaire ruimten in het geïnfiltreerde gebied volledig zijn gevuld met de ziekteverwekker opschorting (zie stap 2.4). Dit is essentieel bij het gebruik van breed-gebied fluorescentie stereomicroscopes aangezien deze microscopen alle detecteerbare signalen langs de dezelfde verticale positie van het model vangen. Chlorofyl autofluorescence van overlevende cellen boven of onder de cellen in het domein van de PCD maskers gemakkelijk de dode cellen die geen autofluorescence vertonen. Dit geldt ook voor YFP signaal.
Voorwaarden voor time-lapse imaging moeten zorgvuldig worden vastgesteld door middel van verschillende voorbereidende experimenten onder verschillende experimentele omstandigheden. Parameters voor time-lapse imaging is afhankelijk van verschillende factoren zoals de microscopische systeem, transgene planten en ziekteverwekkers. Voor het verkrijgen van deze parameters, geanalyseerd wij eerst verschillende belichtingstijden voor YFP signaal intensiteit in het geïnfiltreerde blad op 7 hpi, die vrijwel samenvalt met de eerste activering van pPR1. Een 5 s blootstelling werd bepaald als geschikt voor het vastleggen van YFP signaal met de stereomicroscoop gebruikt in deze studie. Een gelijkaardige test werd uitgevoerd voor imaging-chlorofyl autofluorescence. Gasbedwelming met behulp van het proefstuk licht tussen 3 min intervallen was geprogrammeerd in de time-lapse imaging-programma als normale helder veld beeldbewerking met maximale blootstellingstijd. Ons systeem (Tabel van materialen) konden wij hebben 2,5 min naast YFP, TXR en heldere veld imaging. Deze beperking was de voornaamste reden voor het kiezen van een interval van 3 min. Volgende, we hebben bevestigd dat deze time-lapse voorwaarde geen zichtbare schade aan de plant monsters toegebracht, en niet ectopische lichte stressgerelateerde activering van pPR1 (Figuur 3B, C veroorzaken deed). Dit leidde tot de ontwikkeling van het programma in deze studie gebruikt. Zo 3-minuten intervallen voor fluorescentie imaging werden geacht tot voldoende voor het vastleggen van pPR1 dynamiek tijdens Pst_a2-gemedieerde ETI9.
Promotor-reporter constructies, hebben vooral met de fluorescerende verslaggever gesmolten aan de NLS, gebruikt door vele groepen, en zijn gemakkelijk beschikbaar uit de onderzoekswereld; We gebruikten de constructie geplaatst door Kubo et al. 13. dus het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in elke plant biologie studie onderzoekt blad weefsels, als passende transgene planten beschikbaar zijn. Onze eenvoudige en gemakkelijke-protocol biedt een geweldige kans voor onderzoekers die erop gebrand zijn om het analyseren van de spatio dynamiek van alle biologische gebeurtenissen die zich voordoen bladeren, zoals immuunrespons. Het is aannemelijk dat onze methode met behulp van tape stukken een lichte fysieke spanning op de specimens induceert. Echter kan dit probleem worden gecontroleerd door passende positieve en negatieve controles, zoals mock behandelingen, waaronder in de experimenten (Figuur 3C). De experimentele omstandigheden kunnen verder worden gewijzigd en geoptimaliseerd door het analyseren van deze besturingselementen onder verschillende omstandigheden.
In de afgelopen jaren heeft de snelle ontwikkeling van beeldvormende instrumenten en technieken het belang van onderzoekers in de complexe Spatio aspecten van biologische gebeurtenissen gestimuleerd. In een analyse van beeldvorming behoren juiste montage- en vaststelling van specimens tot de belangrijkste kwesties. De eenvoudige en veelzijdig wijze van montage levende die Arabidopsis verlaat ontwikkeld in deze studie kan worden toegepast en geoptimaliseerd voor verschillende beeldvormende experimenten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Japan Science and Technology Agency [PRESTO117665 naar S.B., ERATOJPMJER1502 naar N.N.] en door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (Grants-in-Aid voor onderzoek activiteit Start-up [22880008 naar S.B.] en voor jonge wetenschappers (B) [ 23780040 naar S.B.]). Wij danken Y. Suzuki, Y. Sugisawa, A. Senzaki en E. Betsuyaku voor uitstekende technische bijstand, J. Parker voor het verstrekken van de Pst_a2 stam, en T. Demura voor het verstrekken van de pBGYN-vector.
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |