हम Arabidopsis थालियाना के फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक सरल और बहुमुखी विधि की रिपोर्ट समय की एक विस्तारित अवधि में पत्तियों । हम एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के spatiotemporal समझ पाने के लिए एक उदाहरण के रूप में एक प्रतिरक्षा संबंधी प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त संयंत्र का उपयोग करें ।
संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक जीनोम चौड़ा transcriptional reprogramminging के साथ जुड़े संक्रमण के स्थल पर शुरू की है । इस प्रकार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्थानिक और लौकिक विनियमित है । एक एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में एक प्रतिरक्षा से संबंधित प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट जीन का उपयोग एक सरल तरीका है संयंत्र प्रतिरक्षा के spatiotemporal विनियमन समझ है । जड़ ऊतकों है कि विभिंन intravital फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रयोगों की एक संख्या के लिए इस्तेमाल किया गया है के विपरीत, वहां कुछ फ्लोरोसेंट रहते है पत्ती ऊतकों कि हवाई माइक्रोबियल संक्रमण की एक सरणी मुठभेड़ के लिए इमेजिंग उदाहरण मौजूद हैं । इसलिए, हम समय की एक विस्तारित अवधि में लाइव सेल इमेजिंग के लिए Arabidopsis थालियाना पौधों की पत्तियों को माउंट करने के लिए एक सरल तरीका विकसित किया । हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त पौधों का इस्तेमाल किया (YFP) परमाणु स्थानीयकरण संकेत करने के लिए genefused (एनएलएस) एक रक्षा से संबंधित मार्कर जीन के प्रवर्तक के नियंत्रण में, रोगजनन-1 से संबंधित ( PR1) । हमने Pseudomonas syringae पीवी के साथ एक ट्रांसजेनिक पत्ती से घुसपैठ की । टोमॅटो DC3000 (avrRpt2) तनाव (Pst_a2) और vivo में प्रदर्शन YFP संकेत की एक कुल के लिए समय-चूक इमेजिंग ४० एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope का उपयोग कर एच । इस विधि न केवल संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर अध्ययन के लिए लेकिन यह भी विभिंन विकासात्मक घटनाओं और पर्यावरण पत्ती ऊतकों में होने वाली प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक गतिशील transcriptional एकाधिक प्रतिलेखन कारकों द्वारा विनियमित reprogramminging के रूप में के रूप में अच्छी तरह से phytohormones1शामिल है । transcriptome डेटा का संचय संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली के बारे में जानकारी एकत्रित करने के लिए अवसर प्रदान करता है: उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग कैस्केडिंग की नेटवर्क संरचना2. हालांकि, हमारे ज्ञान संयंत्र प्रतिरक्षा के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता अभी भी3,4,5सीमित रहता है ।
पिछले अध्ययनों में, रक्षा से संबंधित जीन अभिव्यक्ति का spatiotemporal विनियमन ज्यादातर सीटू संकरण और एक β-glucuronidase (गस) रिपोर्टर परख6,7,8में उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । ये विधियां हमें सीटू में रुचि के विभिन्न जीनों की transcriptional सक्रियण की कल्पना करने में सक्षम बनाती हैं । हालांकि, इन प्रक्रियाओं नमूनों की रासायनिक निर्धारण की आवश्यकता है, और इस प्रकार सभी लौकिक जानकारी के नुकसान में परिणाम । प्रतिरक्षा, समय के साथ प्रगति के रूप में जैविक घटनाओं, । एक संवाददाता के रूप में luciferase का उपयोग3ब्याज के प्रवर्तक के लौकिक गतिशीलता का कब्जा सक्षम है । हालांकि, luciferase आधारित परख एक महंगी सब्सट्रेट और अति संवेदनशील डिटेक्टरों की आवश्यकता है । संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के spatiotemporal पहलुओं की हमारी समझ बढ़ाने के लिए एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis थालियाना पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) जीन से जुड़े पौधों को व्यक्त करने के लिए उत्पंन नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत (YFP-एनएलएस) रक्षा संबंधी मार्कर जीन के प्रवर्तक के नियंत्रण में, रोगजनन-संबंधित 1 (PR1)9. हम क्लोरोफिल autofluorescence, जीवित कोशिकाओं के मार्कर का इस्तेमाल किया, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (PCD) है, जो अक्सर प्रभाव के दौरान होता है की प्रक्रिया को पकड़ने के लिए ट्रिगर प्रतिरक्षा (एति), संयंत्र प्रतिरक्षा विशेष रोगज़नक़ संक्रमण9 द्वारा प्रेरित का एक रूप , 10. इस तरह के Arabidopsis पत्ते रहने के रूप में स्वतंत्र रूप से चलती वस्तुओं, में प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के लौकिक गतिशीलता की निगरानी, एक जटिल छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर या तो घर में बनाया या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध की आवश्यकता है । वैकल्पिक रूप से, चलती से नमूनों को रोकने के मुद्दे को हल करने के लिए एक सरल तरीका है । यहां, हम एक स्वचालित प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत लंबी अवधि के अवलोकन के लिए एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्र के बढ़ते रहने पत्तियों के लिए एक बहुमुखी और सरल विधि विकसित की है । विधि हमें मिट्टी के भीतर प्रवर्तक गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है बरकरार संयंत्र कुछ दिनों में छोड़ देता है ।
यहां, हम एक सरल विधि की रिपोर्ट के लिए एक जीवित Arabidopsis पत्ती लंबी अवधि के लिए एक स्वचालित फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग कर अवलोकन के लिए ब्याज की एक प्रमोटर के नियंत्रण में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त माउंट । एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की समय-चूक इमेजिंग अक्सर रूट ऊतकों में प्रदर्शन किया गया है; हालांकि, केवल कुछ इसी तरह के अध्ययन पत्ती के ऊतकों में आयोजित किया गया है । यह सबसे अधिक संभावना है क्योंकि पत्तियां स्वतंत्र रूप से अंतरिक्ष में ले जाने में सक्षम हैं, जबकि जड़ें अक्सर दफन होती हैं और ठोस आगार माध्यम में तय होती हैं ।
इस रिपोर्ट में, हम Pst_a2द्वारा प्रेरित एति के दौरान pPR1 गतिविधि की spatiotemporal गतिशीलता पर ध्यान केंद्रित किया । इसके बाद के संस्करण विस्तृत पत्ती के कोमल निर्धारण के अलावा, यह स्पष्ट रूप से इस तरह के प्रमोटर सक्रियण और PCD के रूप में सेलुलर घटनाओं की spatiotemporal गतिशीलता कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि pPR1 गतिविधि और PCD दिखाने कोशिकाओं के बीच अंतर तेज नहीं है, सुनिश्चित करें कि घुसपैठ क्षेत्र में सेलुलर रिक्त स्थान के सभी पूरी तरह से रोगज़नक़ निलंबन (२.४ कदम देखें) के साथ भर रहे हैं । यह महत्वपूर्ण है जब व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति stereomicroscopes का उपयोग कर के बाद से इन सूक्ष्मदर्शी नमूना के एक ही ऊर्ध्वाधर स्थिति के साथ सभी जासूसी संकेतों पर कब्जा । क्लोरोफिल ऊपर या PCD डोमेन में कोशिकाओं के नीचे जीवित कोशिकाओं से autofluorescence को आसानी से मृत कोशिकाओं को प्रदर्शित नहीं autofluorescence मास्क । यह भी YFP संकेत के लिए सच है ।
समय के लिए शर्तों-चूक इमेजिंग विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत कई प्रारंभिक प्रयोगों के माध्यम से ध्यान से स्थापित करने की आवश्यकता है । समय के लिए पैरामीटर-चूक इमेजिंग सूक्ष्म प्रणाली, ट्रांसजेनिक पौधों, और रोगजनकों जैसे कई कारकों पर निर्भर करतेहैं । इन मापदंडों को प्राप्त करने के लिए, हम पहले घुसपैठ की पत्ती में 7 hpi, जो लगभग pPR1के प्रारंभिक सक्रियण के साथ मेल खाता है में YFP संकेत तीव्रता के लिए विभिंन जोखिम बार विश्लेषण किया । एक 5 एस एक्सपोजर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया stereomicroscope के साथ YFP संकेत पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त के रूप में निर्धारित किया गया था । इसी तरह का परीक्षण इमेजिंग क्लोरोफिल autofluorescence के लिए किया गया था । 3 मिनट के अंतराल के बीच प्रकाश करने के लिए नमूना के एक्सपोजर अधिकतम जोखिम समय के साथ सामान्य उज्ज्वल फील्ड इमेजिंग के रूप में समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम में क्रमादेशित किया गया था. हमारी प्रणाली (सामग्री की मेज) हमें YFP, TXR, और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के अलावा २.५ मिनट के लिए अनुमति दी । यह बाधा एक 3 मिनट के अंतराल को चुनने के लिए प्राथमिक कारण था । अगले, हम पुष्टि की है कि इस समय चूक हालत संयंत्र नमूनों के लिए कोई स्पष्ट नुकसान का कारण बना है, और अस्थानिक प्रकाश तनाव से संबंधित सक्रियकरण pPR1 (चित्रा 3बी, सी) के प्रेरित नहीं किया । इस अध्ययन में इस्तेमाल कार्यक्रम के विकास के लिए नेतृत्व किया । इस प्रकार, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के 3-ंयूनतम अंतराल Pst_a2मध्यस्थता एति9के दौरान pPR1 गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त समझा गया ।
प्रमोटर-रिपोर्टर, विशेष रूप से एनएलएस से जुड़े फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ constructs, कई समूहों द्वारा उपयोग किया गया है, और अनुसंधान समुदाय से आसानी से उपलब्ध हैं; हम क्युबो एट अल द्वारा प्रकाशित निर्माण करते थे । 13. इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी संयंत्र जीव विज्ञान अध्ययन पत्ती ऊतकों की जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर उचित ट्रांसजेनिक संयंत्रों उपलब्ध हैं । हमारे सरल और आसान प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है जो किसी भी जैविक ऐसी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में पत्तियों में होने वाली घटना की spatiotemporal गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उत्सुक हैं । यह प्रशंसनीय है कि हमारे विधि टेप टुकड़े का उपयोग नमूनों पर एक मामूली शारीरिक तनाव लाती है । हालांकि, इस मुद्दे को उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, जैसे कि नकली उपचार, प्रयोगों में (चित्रा 3सी). प्रयोगात्मक शर्तों और संशोधित किया जा सकता है और विभिंन परिस्थितियों में इन नियंत्रणों का विश्लेषण द्वारा अनुकूलित ।
हाल के वर्षों में, इमेजिंग उपकरणों और तकनीकों के तीव्र विकास ने जैविक घटनाओं के जटिल spatiotemporal पहलुओं में शोधकर्ताओं के हित को उत्तेजित किया है । किसी भी इमेजिंग विश्लेषण में, उचित बढ़ते और नमूनों की फिक्सिंग सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों में से एक हैं । बढ़ते रहने Arabidopsis इस अध्ययन में विकसित पत्तियों की सरल और बहुमुखी विधि लागू किया जा सकता है और विभिंन इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम जापान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था [PRESTO117665 to S.B., ERATOJPMJER1502 to N.N.] और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा (अनुदान-में अनुसंधान गतिविधि शुरू करने के लिए सहायता [२२८८०००८ के लिए S.B.] और युवा वैज्ञानिकों के लिए (ख) [ २३७८००४० से S.B.]) । हम Pst_a2 तनाव प्रदान करने के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता, जे पार्कर के लिए ए Senzaki, वाई सुजुकी, वाई Sugisawa और ई. Betsuyaku धंयवाद, और धेमुरा वेक्टर प्रदान करने के लिए टी. pBGYN ।
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |