Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biaxial mekanisk Characterizations av atrioventrikulær hjertet ventiler

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59170
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen innebærer characterizations av atrioventrikulær ventil brosjyrer med kraft-kontrollerte, forskyvning-kontrollert, og stress-avslapping biaxial mekanisk testing prosedyrer. Resultatene kjøpt med denne protokollen kan brukes for grunnleggende modellen utvikling for å simulere mekanisk virkemåten til fungerende ventilene under et begrenset element simulering rammeverk.

Abstract

Omfattende biaxial mekanisk testing av atrioventrikulær hjertet ventil brosjyrer kan benyttes for å utlede optimale parametere brukes i grunnleggende modeller, som gir en matematisk representasjon av den mekaniske de strukturene. Denne presentert biaxial mekanisk testing protokollen omfatter (i) vev oppkjøp, (ii) utarbeidelse av vevsprøver, (iii) biaxial mekanisk testing og (iv) postprosessering av oppkjøpte dataene. Først krever vev oppkjøpet å få svin eller ovine hjerter fra en lokal mat og Drug Administration-godkjent abattoir for senere disseksjon hente ventil løpesedler. Andre krever vev forberedelse bruk av vev prøven kniver på brosjyre vev å trekke ut en klar sone for testing. Tredje, biaxial mekanisk testing av brosjyre prøven krever bruk av en kommersiell biaxial mekanisk tester, som består av kraft-kontrollerte, forskyvning-kontrollert, og stress-avslapping testing protokoller betegner pakningsvedlegget vevets mekaniske egenskaper. Til slutt, etterbehandling krever bruk av data bilde korrelasjon teknikker og styrke og forskyvning opplesninger summere vevets mekanisk atferd svar på ekstern lasting. Vanligvis viser resultatene fra biaxial testing at pakningsvedlegget vev gir en ikke-lineær, Anisotrop mekanisk reaksjon. Presentert biaxial testing prosedyren er fordelaktig for andre metoder siden metoden presenteres her gjør det mer omfattende karakteristikk av ventilen pakningsvedlegget vev under en enhetlig testing ordningen, i motsetning til separate testing protokoller på forskjellige vevsprøver. Foreslåtte testmetoden har begrensninger i at skjæring stress er potensielt tilstede i Vevsprøve. Men antas noen potensielle skjær ubetydelig.

Introduction

Lated hjertefunksjon er avhengig av aktuelle mekanisk oppførsel av hjertet ventil løpesedler. I situasjoner hvor hjertet ventil pakningsvedlegget mekanikk er kompromittert, oppstår ventil hjertesykdom, som kan føre til andre problemer med hjertet. Forstå hjertesykdommer ventil krever en grundig forståelse av løpesedler riktig mekanisk oppførsel for bruk i datamodeller og terapeutiske utvikling, og som sådan, en testing ordningen må utvikles for å hente nøyaktig den sunne brosjyrer mekaniske egenskaper. I forrige litteratur, er denne mekaniske karakteristikken utført ved hjelp av biaxial mekanisk testprosedyrer.

Biaxial mekanisk testprosedyrer for bløtvev varierer over hele litteratur, med forskjellige testing rammeverk benyttes for å hente ulike egenskaper1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Testing metoder har blitt utvidet for undersøkelser av mekaniske egenskaper av hjertet ventil brosjyrer. Generelt basert biaxial mekanisk testing innebærer lasting hjertet ventil tissue med samtidig styrker i de to viktigste retningene, men hvordan denne testingen utføres varierer på egenskapene biomekaniske overholdes. Noen av disse testing protokoller inkluderer (i) belastning-rate, (ii) krype, (iii) stress-avslapping og (iv) force-kontrollerte testing.

Først blitt belastning-rate tester benyttet for å avgjøre den tid avhengig atferd av vev brosjyrer18,20. I denne testing protokollen, flygeblader lastet opp til en maksimal membran spenning på ulike tidspunkter, halv-syklusen (dvs. 1, 0,5, 0,1 og 0,05 s) å avgjøre om det er en betydelig forskjell i topp strekke eller hysteresis mellom innlastingstidene. Men har disse testene vist en ubetydelig aldersforskjell observert strekningen med varierende belastning-priser. Andre i krype testing, er vevet lastet til toppen membran spenningen og holdt på topp membran spenning. Denne testingen kan en demonstrasjon av hvordan vevets forskyvning kryper for å opprettholde topp membran spenningen. Men det har vist at creep er ubetydelig for hjertet ventil brosjyrer under fysiologisk funksjon3,20. Tredje stress-avslapning testing, vevet er lastet til toppen membran spenningen og tilknyttede forskyvning holdes konstant i lengre tid3,21,22. I denne typen tester, har vev stress en merkbar reduksjon fra topp membran spenningen. Til slutt, i kraft-kontrollerte testing, vev er syklisk lastet på ulike prosenter av topp membran spenning i hver retning17,23. Disse testene viser materialets anisotropy og ikke-lineære stress-belastning respons, og ved lasting av vev under forskjellige forhold, potensielle fysiologiske deformasjoner kan bli bedre forstått. Disse nyere undersøkelser gjorde det klart at stress-avslapping og kraft-kontrollerte protokoller være mest gunstig å utføre mekanisk karakteristikk av hjertet ventil brosjyrer. Til tross for disse fremskritt i hjertet ventil biomekaniske karakterisering, testing er ikke utført under en enhetlig testing ordningen, og det er begrensede metoder å undersøke koblingen mellom retninger.

Formålet med denne metoden er å lette full materiale karakteristikk av hjertet ventil løpesedler av et enhetlig biaxial mekanisk testing ordning. En enhetlig testing ordningen regnes som der hver brosjyre er testet under alle testing protokoller i én økt. Dette er en fordel, som vev egenskaper er iboende variabel mellom brosjyrer, slik en full analyse for hver brosjyre beviser mer nøyaktig som en beskrivelse enn utføre hver protokoll uavhengig på ulike brosjyrer. Testing ordningen består av tre hovedkomponenter, nemlig (i) en kraft-kontrollerte biaxial testing protokollen, (ii) en forskyvning-kontrollerte biaxial testing protokoll og (iii) en biaxial stress-avslapping testing protokoll. Alle testing ordninger bruke en overføringshastighet på 4.42 N/min, og 10 lasting-lossing sykluser å sikre stress-belastning kurven replicability av 10 syklus (som i tidligere arbeid)23. Alle protokoller er også bygget basert på membran spenning antagelsen, som krever at tykkelsen er mindre enn 10% effektiv prøven lengden.

Force-kontrollerte protokollen som brukes i denne presentert metoden består av 10 lasting og lossing sykluser med topp membran spenninger 100 N/m og 75 N/m for mitral ventil (MV) og trikuspidalklaff ventil (TV), henholdsvis15,17. Fem lasting prosenter anses i denne kraft-kontrollerte testing protokollen, nemlig 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0. 5. Disse fem lasting forholdene være nyttig i å beskrive den stress og påkjenningen korrespondenten til alle potensielle fysiologiske deformasjoner av brosjyren i vivo.

Forskyvning-kontrollerte protokollen presentert i denne metoden består av to deformasjon scenarier, nemlig (i) begrenset uniaxial strekking og (ii) ren skjær. I den begrensede uniaxial stretching, blir én retning av vev fortrengt til toppen membran spenningen mens bestemmer den andre retningen. I ren skjær stilling, er vevet strukket i en retning og judiciously forkortet i den andre retningen, så området av vev forblir konstant under deformasjon. Hver av disse forskyvning-kontrollerte testprosedyrer utføres for hver av de to vev retningene (omkrets og radial retninger).

Stress-avslapping protokollen presentert metoden som brukes er oppnådd ved lasting av vev peak membran spenningen i begge retninger og holder vev på korrespondent forskyvningene i 15 min overvåke vevets stress avslapning atferd. Detaljerte eksperimentelle prosedyrer diskuteres på neste.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene beskrevet ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på The University of Oklahoma. Alle dyr vev anskaffet fra en USA Department of Agriculture USDA godkjent slakteri (land hjem kjøtt co, Edmond, OK).

1. vev oppkjøp og rengjøring

  1. Hente dyr hjerter på samme dag som dyret er slaktet og lagre hjerter i en is brystet for å sikre friskhet vev. Transport hjertene til laboratoriet plass.
  2. Ved ankomst på laboratoriet, dykke hjertet i en bøtte med fosfat-bufret (PBS) saltvann skylle av eventuelle overskytende blod. Hente tang, en placemat, en kirurgisk blad, en bøtte med PBS løsning, blekemiddel og en plastpose. Forberede placemat ved å legge den på disseksjon disken, slik at en lettere rengjøring av blod-relaterte rot. Når hjertet har blitt tilstrekkelig skylt, plassere hjertet på underlag (figur 1a).
  3. Bruke pinsett, Finn avskjeds linje mellom atria og ventrikkel på hver side av hjertet. Bruker et barberblad, nøye gjør en snitt langs denne avskjeds linje og avsløre hjertet ventiler og ventriklene (figur 1b). Gjøre i snitt langs hele ytre omkretsen av hjertet, slik at atria og alle hjerte materiale overlegen ventriklene kan fjernes.
  4. Med tang, trekk forsiktig ut eventuelle observerte blodpropp i ventriklene (figur 1 c). Hvis prøver å fjerne en blodpropp, men det ikke flytte, sikre chordae tendineae eller brosjyrer har ikke blitt fanget. Plasser blodpropp i biohazard posen for avfallshåndtering.
  5. Når alle blodpropp er fjernet fra ventriklene, skyll hjertet til en siste gang i en bøtte med PBS løsning. Plasser ren hjertet i plastposen og oppbevares i en fryser.
  6. Med 10% blekemiddel og 90% angitt vann, blanding blod med bleike løsning og røre kontinuerlig i ca 10 min. se etter en vellykket blekemiddel behandling, med løsningen overgang fra rød til gul. Kast blekemiddel-behandlet blod gjennom drenering.
    FORSIKTIG: Bleach er et giftig stoff kan være farlig hvis ingested.
    Merk: Protokollen kan pauses her.

2. hjerte disseksjon og undersøkelse av anatomi

  1. Hente tidligere renset hjertet og la det tine i et varmt vannbad. De nødvendige materialene for disseksjon inkluderer tang, kirurgisk blader, placemats, PBS og små lagercontainere. Etter hjertet er helt tint, satte den på en placemat å absorbere alle gjenværende blod.
  2. Holde hjertet ovenfra og ned (overordnet) vise optimalt observere ventil strukturer. Begynner med MV på venstre side av hjertet, bruk tang til å nøye manipulere løpesedler og identifisere en commissure eller avskjeds linje mellom løpesedler.
  3. Gjør et snitt langs commissure og klippe gjennom ventrikkel veggen, sørge for ikke å skade løpesedler. Det kan være nødvendig å kutte akkordinstrument vedlegg under denne prosessen å fullt ut åpne ventrikkel. Når den fulle snittet er gjort, åpne ventrikkel (figur 2a).
  4. Identifisere MV fremre og bakre løpesedler og bruke en kirurgisk blad bryte akkordinstrument vedleggene til papillary muskler. Ved hjelp av pinsett, strekke løpesedler stram og kutt å skille løpesedler fra ringrommet. Plasser forbrukeravgift løpesedler i en hensiktsmessig merket beholder fylt med PBS løsning og oppbevares i kjøleskap på ca 4 ° C.
  5. Hold hjertet for en topp-ned visning og identifisere TV på høyre side av hjertet. Finn commissures og gjøre et snitt gjennom en av commissures og ventrikkel veggen (figur 2b).
  6. Identifisere TV septal, bakre og fremre løpesedler, og utføre pakningsvedlegget utvinning som gjort i trinn 2.4. Plasserer alle fått brosjyrer i merket beholder fylt med PBS løsning og lagrer beholderen i kjøleskap på ca 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her. Imidlertid bør vev biomekaniske testing og påfølgende histology analysene skje innen 2 dager med hjertet dissection.

3. vev disseksjon

  1. Hente en brosjyre fra kjøleskapet, vev kutteren for den angitte snitting størrelsen, kirurgisk penn, pinsetter, barberblad og skjæring mat.
  2. Ved hjelp av pinsett, fjerne prøven fra PBS løsning og legg den flatt på skjæring mat med den sirkulær retningen (R) justert etter Y-retningen og omkrets retning (C) justert til X-retningen (figur 3a). Identifisere heftets sentrale regionen som testing delen.
  3. Justere vev kutteren slik at regionen ønsket vev testing er innenfor grensene av barberblad. Gjør en kuttet vannrett og loddrett for å danne en firkantet regionen ønsket dimensjoner (figur 3b). Bruker kirurgisk pennen, etiketten vevets sirkulær retning (figur 3b).
  4. Bruker den razor bladet, klippe akkordinstrument vedlegg ved strekking chordae fra heftet med tang og gjøre en forsiktig kutt uten å forårsake skade på heftet.
    Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis protokollen er stoppet midlertidig, lagre valgte vevet i merket beholder fylt med PBS løsning og lagre beholderen i kjøleskap på ca 4 ° C (som forklart i trinn 2.6). Imidlertid bør vev testing skje innen 2 dager med dissection.

4. tykkelse måling og biaxial tester oppsett

  1. Hente inndelte vev prøven, digital calipers og små metall spatula. Bruker de digitale calipers, mål og registrere tykkelsen av metall spatula.
  2. Ved hjelp av pinsett, Legg vev prøven flatt på metall spatula. Bruker de digitale calipers, måle tykkelsen av spatel-vev par (Figur 3 c) på tre forskjellige pakningsvedlegget steder. Trekke spatula's tykkelse fra hver måling og registrere den gjennomsnittlige tykkelsen.
  3. Forberede en PBS bad på 37 ° C, som tilsvarer vevets fysiologiske forhold.

5. vev montering og fiducial markøren plasseringen

  1. Hente tang, vev prøven, montering maskinvare, en tynn verktøyet, glassperler (med diameter på 300-500 µm) og superlim.
  2. Montere vevet biaxial testing systemet (figur 3de). Mens montering, sikre at vevets omkrets og radial retninger justeres med maskinens X - og Y-retningene.
  3. For fiducial markør plassering, plassere glassperler i en liten beholderen og et lite basseng med superlim i en annen container. Bruke verktøyet tynn, pels spissen med en liten mengde superlim og stikke en personlige perle til spissen av verktøyet.
  4. Forsiktig bruk verktøyet for å overføre perlen til et hjørne av den midtre tredjedelen av vevets testing regionen (figur 3f). Gjenta dette trinnet til en matrise av fire perler er dannet (Figur 3 g).
    Merk: Det er avgjørende at overflødig lim. unngås, og at fiducial markørene ikke stikke sammen som senere digitalt bilde sammenheng (DIC) teknikker vil produsere ubrukelig sporing av resultater. Det er viktig at matrise må være innenfor den midtre tredjedelen av vevets testing regionen.

6. preconditioning trinn og varighet timing

  1. For å beregne riktige membran spenningen, få vevets effektiv testing kanten lengde og bruke følgende ligning.
    Equation 1(1)
    Merk: Her T er membran spenningen i en enhet force/lengde, f er makt og L er prøvens effektiv testing lengde.
  2. Opprette en preconditioning protokoll slik at vevet vil gjennomgå 10 lasting/lossing sykluser på styrkene forbundet med topp membran spenningen ved en overføringshastighet på 4.42 N/min, inkludert en preload på 2,5% av maksimal kraft (Figur 4).
    1. Opprette en ny vilkårlig testing katalog for å lagre preconditioning data, fordi det ikke er nødvendig for andre fremtidige beregninger. Etablere en overføringshastighet på 4.42 N/min for etterfølgende tester.
    2. Opprett et nytt sett med tester parametere og angi navnet på protokollen som Preconditioning0 (figur 4a). For X- og y-akser, angi kontrollmodus skal tvinge og kontrollfunksjon skal trinn. Angi laste omfanget som force knyttet målrettet peak membran spenning (jf trinn 6.1) (figur 4b). Angi preload omfanget 2,5% av maksimal kraft for første gjentagelse bare (Figur 4 c). Angi strekke varighet og utvinning varighet både til 25 s. Sett til antall gjentakelser å være 10 (figur 4e).
  3. Når preconditioning trinnet er ferdig, bør du notere vevets deformasjon i X - og Y-retningene. Forberede en protokoll flytte prøven til maksimal kraft, begynner fra størrelsen i katalogoppføringen.
    1. Hente en stoppeklokke for timing formål. Starte maksimal kraft lasting protokollen og start stoppeklokken samtidig når maskinen starter aktivering (figur 5a). Stopp stoppeklokken når actuation stopper. Stoppe blir tydelig gjennom auditiv signaler.
    2. Spille inn etter preconditioning peak vev deformasjon sammen med tiden fra stoppeklokken som representerer vevets optimal strekk tid (figur 5b).

7. biaxial mekanisk testing

  1. Forberede en kraft-kontrollerte protokoll frekvensen lasting av 4.42 N/min.
    1. Åpne en ny testing katalog og navnet testen. Angi dataene som skal lagre et kjent sted for bruk i senere stress og belastning beregninger. Flytte prøven tilbake til den opprinnelige konfigurasjonen av montering.
    2. Opprette en protokoll sett med tittelen FirstImage. Angi x- og y-aksen kontrollmodus å tvinge og funksjonen til trinn. Angi laste omfanget til 0 mN. Angi strekke varighet og utvinning varighet hver 1sekund. Angi antall gjentakelser til 1. Angi data output frekvensen og bilde output frekvensen hver til 1 Hz.
    3. Konstruere et nytt testing sett, kalt PreconditioningA. Opprette testing parametere slik at vevet vil gjennomgå 10 repetisjoner av syklisk lasting/lossing til målrettet kraft for ønsket membran spenningen akkurat som ble utarbeidet i trinn 6.2. Merk at nå, det strekke og gjenopprette tid bør være tiden registrert i trinn 6.3.2. Ingen bilder er fanget i A testing sett, men dataene er fanget på 15 Hz.
    4. Konstruere en annen testing sett, navngitt PreconditioningB. Alle testing parameterne skal være identiske med dem som nevnt i forrige trinn, med unntak at bildet output frekvensen er satt til 15 Hzog ingen preload brukes.
    5. Etter preconditioning protokollen, opprette testing protokoller slik at vevet er lastet til toppen membran spenningen i følgende omkrets-til-radielt lasting forholdstallene frekvensen lasting av 4.42 N/min: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0.5 (figur 6 ). Hente data fra to siste sykluser av hver lasting forhold påfølgende databehandling og analyser som er beskrevet i delen 10. Se tabell 1 for en detaljert beskrivelse av protokoller skal etableres.
  2. Forberede en forskyvning-kontrollerte testing protokoll frekvensen lasting av 4.42 N/min som følger. (i) Biaxial strekker seg i X-retningen og Y-retning forskyvningene forbundet med topp omkrets og radial strekninger, henholdsvis (figur 7a). (ii) Pure skjær langs X-retningen, stretching i X-retningen med topp omkrets strekningen og forkorte i Y-retningen, mens området stiplet konstant under deformasjon (figur 7b). (iii) begrenset uniaxial strekker seg langs X-retningen (figur 7 c). (iv) Pure skjær langs Y-retningen (figur 7 d). (v) begrenset uniaxial strekker seg langs Y-retningen (figur 7e).
    1. Mellom hver av disse trinnene, konstruere en "syklus" 1 min som holder vev på den opprinnelige monterte konfigurasjonen. Hente data fra de to siste syklusene av hver lasting forholdet for databehandling og analyser (inndelingen 9). Se tabell 2 for en detaljert beskrivelse av protokoller skal etableres.
  3. Klargjøre en stress-avslapping protokoll slik at vevet er lagt i hver retning, frekvensen lasting av 4.42 N/min, å forskyvningene forbundet med topp membran spenninger (trinn 7.2) og holdt på at forskyvning i 15 min (Figur 8 og Figur 9). Etter 15 min, bør protokollen settes til gjenopprette vevet til den opprinnelige montering konfigurasjonen.
    Merk: I tilfelle av vev rive, avbryte testen umiddelbart for å hindre potensielle skade forårsaket biaxial testsystem.

8. vev fiksering for histology analyse

  1. Demontere vev fra biaxial testing system. Plasser vevet i en container fylt med 10% formalin, og Plasser beholderen i et nedkjølt miljø på ca 4 ° C. Reparere vevet for 24 48 h, avhengig av vevets tykkelse.
    FORSIKTIG: Formalin er et kjent karsinogen, og hvis pustet inn, et overskudd kan forårsake lungene å bli fast. Alle arbeider med formalin skal utføres i avtrekksvifte med tilstrekkelig ventilasjon.
  2. Etter at vevet er løst i formalin for 24 48 h, overføre vev til en 80% etanol løsning for senere histology. Vevet skal lagres i løsningen i et nedkjølt miljø på 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her. Når vev er faste, kan de bli analysert når som helst. Hvis protokollen er stoppet midlertidig, lagrer vevet i merket beholder fylt med 80% etanol, og lagre beholderen i kjøleskap på ca 4 ° C (som forklart i trinn 8.2).
  3. Forberede vevet kommersielle histology analyse som leverandørens instruksjoner. Hvis en bestemt brosjyre bestanddel, som kollagen, elastin, glycosaminoglycans, etc., er studien rundt, kontrollerer du at riktig histology flekken er ansatt.
    Merk: Histology lysbilder kan visualiseres ved hjelp av et mikroskop for å observere ønsket bestanddeler (Figur 10).
  4. Bruke bildebehandlingen programmet ImageJ, utføre farge deconvolution metoder for å finne ut prosentandelen for hver farget bestanddel i vevet. For mer informasjon om disse prosedyrene, se Ruifrok og Johnston24.

9. biaxial tester data etterbehandling prosedyrer

  1. Utføre DIC-baserte sporing på fire fiducial markører fra bilder tatt under biaxial mekaniske testing (Figur 11) å avgjøre tidsavhengige markør stillingene.
    Equation 2(2)
    1. Hvis det er ønskelig å utføre analysen med hensyn til montering konfigurasjonen, la Xjeg være markør stillingene i undeformed tilstand i begynnelsen av biaxial test. Hvis det er ønskelig å utføre analysen med hensyn til post preconditioning deformasjon, la Xjeg være markør stillingene på slutten av preconditioning protokollen.
      Merk: De påfølgende trinnene vil bli utført på samme måte, uavhengig av referansekonfigurasjonen valgt.
      Merk: Her Xjeg og xjeg er undeformed og deformert plasseringen av markører, henholdsvis, og djeg er forskyvning vektoren for hver indikator.
  2. Beregne deformasjon gradient (F) av fiducial markører bruker en fire noder bilinear endelig element2,23,25.
    Equation 3(3)
    Merk: Her, BxIog ByIer endelig element figuren funksjon derivater i X - og Y-retningene for noden jeg henholdsvis og ujeg(t) og vjeg( t) er tidsavhengige X - og Y-forskyvningene, henholdsvis som tidligere bestemt fra trinn 9.1. Merk at X - og Y-koordinatene er justert til vevets omkrets og radial retninger.
  3. Beregne rett Cauchy-Green deformasjon tensoren (C) og den grønne belastning tensoren (E).
    Equation 4(4)
    Merk: Her er jeg andre-ordens identitet tensoren. Bestemme omkrets og radial strekker seg ved å ta plassen røttene av prinsippet verdiene til C.
  4. Bestemme den første Piola-Kirchhoff (1-PK) stress tensoren (P).
    Equation 5(5)
    Merk: Her er prøvens tykkelse , og T-C og TR er anvendt membran spenninger i omkrets og radial retninger, henholdsvis.
  5. Også beregne andre stress tensors, som Cauchy stress tensoren (σ) og den andre Piola-Kirchoff (2-PK) stress tensoren (S).
    Equation 6(6)
    Merk: Her J er Jacobian av deformasjon gradient tensoren F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stress-stretch data fra kraft-kontrollerte biaxial mekanisk testing avslører en lineær kurve med noen likhet med en eksponentiell kurve (Figur 12). Om svaret i hver viktigste retning er materielle atferden tvers isotropic, med radial strekningen større enn omkrets deformasjon. I noen tilfeller kan i anisotropy retninger vende, med omkrets retning viser større samsvar enn den sirkulær retningen. Dette snudd svaret er observert i TV mer ofte enn i MV.

Fra forskyvning-kontrollerte testing følger stress-stretch dataene en ikke-lineær respons for viktigste retning under spenning (ren-skjær, begrenset uniaxial spenning [figur 13]). Når vevet forkorter den andre viktigste veien, er en "negative (kompresjons) stress" observert. I den begrensede uniaxial spenning protokollen, viser det også en økende stress strekke respons i begrenset retning, viser koblingen av anvendt strekker seg i andre viktigste retning.

Fra stress-avslapping testing, normalisert membran spenningen tid data følger en lineær råtnende kurve (figur 14a, b). Både MV og TV pakningsvedlegget vev viser en større stress reduksjon i radial retning forhold i omkrets retning.

Representant histologiske resultatene av mitral ventil fremre brosjyre (MVAL) og trikuspidalklaff ventil fremre brosjyre (TVAL) vev bruker Masson's trichrome presenteres i Figur 10. Masson's trichrome flekken viser typisk bestanddeler som finnes i atrioventrikulær hjertet ventiler, som kollagenfibre (blå) og Valvulær interstitielle cellene (rød cytoplasma og svart kjerner). Andre flekker kan brukes å visualisere bestanddeler som elastin (Verhoeff-van Gieson flekk) og glycosaminoglycans (Alcian blå farge).

Figure 1
Figur 1: eksperimentell bilder av svin hjerter Hentet fra en lokal slakteri. (en) A hele hjerte skylles av blod med PBS løsning. (b) en kutt gjøres mellom atria og ventriklene å avsløre både mitral og trikuspidalklaff ventilene. (c) blodpropp fjernes deretter fra hjertet før lagring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksperimentell bilder av åpnet svin hjertet avsløre fem atrioventrikulær hjerte ventil brosjyrer og andre komponenter av ventilen apparater. (en) mitral ventil med dissection hjertets venstre langs commissure mellom to brosjyrer, viser den fremre brosjyre (MVAL) og bakre brosjyre (MVPL), og (b) trikuspidalklaff ventilen med en lignende disseksjon på høyre side av hjertet, avslører den fremre brosjyre (TVAL), bakre brosjyre (TVPL) og septal brosjyre (TVSL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksperimentell bilder av forbrukeravgift heftet forberedt for biaxial mekaniske testing. Hjertet ventil pakningsvedlegget testing krever (en) bulk brosjyren skal inndelt i (b) en 10 x 10 mm testing regionen (sirkulær retning bemerket ved kirurgisk penn). (c) heftet tykkheten er avmålt. Prøvene er montert til (d) det biaxial testing system av (e) piercing vevet med metall tinder. Etter montering, er (f) fiducial merkene festet på overflaten av vev før (g) neddykking i PBS løsning på 37 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel protokollparametere for preconditioning testing av en mitral ventil fremre brosjyre av en 7,5 x 7,5 mm testing regionen. Preconditioning protokollen opprettes ved å angi (en) protokollen navn, (b) testing kontrollmodus og kraften i x-aksen, (c) preload forhold, (d) y-aksen parametere som det samme som x-aksen, og (e. ) parameterne syklus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksempel protokollparametere for tidsberegning trinn for en mitral ventil fremre brosjyre av en 7,5 x 7,5 mm testing regionen. Det tidspunkt trinnet krever (en) flytte vev fra post preconditioning deformasjon til toppen membran spenning (og tilsvarende topp deformasjon) mens samtidig starter en stoppeklokke for å logge tidspunktet når strekk. Når målet styrken er nådd, registreres (b) etter preconditioning deformasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: skjematisk av kraft-kontrollerte biaxial testprosedyre for tester mitral og trikuspidalklaff ventil brosjyrer. Testing protokollen består av en equibiaxial lasting preconditioning trinn for å utøve vevet til tilstanden i vivo, etterfulgt av ulike lasting prosenter av topp membran spenning i hver vev retning (Tx:Ty): 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0. 5. Hvert ledd av kraft-kontrollerte testing protokollen utføres 10 lasting/lossing sykluser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: skjematisk forskyvning-kontrollerte biaxial testprosedyre for tester mitral og trikuspidalklaff ventil brosjyrer. Testing protokollen består av (en) biaxial forskyvninger forbundet med topp membran spenninger, (b) ren skjær i X-retningen, (c) begrenset uniaxial forskyvning i X-retningen, (d) ren skjær i den Y-retningen, og (e) begrenset uniaxial forskyvning i Y-retningen. Hvert ledd av forskyvning-kontrollerte testing protokollen utføres 10 lasting/lossing sykluser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: eksempel stress-avslapping testing parametere for mitral ventil fremre folder med en effektiv testing størrelsesorden 7.5 x 7,5 mm. Testing angi parametere for stress-avslapping testing for en mitral ventil fremre brosjyre der målrettet forskyvning er topp vev deformasjon gjelder for dette vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: skjematisk av 15 min stress-avslapping testprosedyre for tester mitral og trikuspidalklaff ventil brosjyrer. Testing protokollen innebærer holder biaxial forskyvninger forbundet med topp membran spenninger i 15 min, hvoretter vevet returneres til montering konfigurasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: histologiske eksempeldataene fra atrioventrikulær hjertet ventiler fremre brosjyrer. Representant histology bilder av (en) mitral ventil fremre brosjyre og (b) trikuspidalklaff ventil bakre heftet. Begge er farget med en Masson trichrome flekk: kollagen i blått, cytoplasma og keratin i rødt og kjerner i svart. Baren skala = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: representant bilder illustrerer sporing av koordinatene for fire fiducial under biaxial mekanisk testing ved hjelp av en image sammenheng (DIC) teknikk. (en) vevet montering konfigurasjon. (b) konfigurasjonen etter preconditioning trinn. (c) deformert konfigurasjonen knyttet til vev prøven under mekaniske belastninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12: representant data fra kraft-kontrollerte protokollene for mitral ventil fremre brosjyren (MVAL). Representant data demonstrerer materiale anisotropy og ikke-lineære belastning svar av vev under biaxial lasting i varierende lasting prosenter peak membran spenning i hver vev retning (Tx:Ty): (et) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, (d) 0.5:1 og (e) 1:0. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13: representant data fra forskyvning-kontrollerte protokollene for mitral ventil fremre brosjyren (MVAL). Representant data demonstrerer materiale anisotropy og ikke-lineære belastning svar av vev under (en) biaxial forskyvninger forbundet med topp membran spenninger, (b) ren skjær i X-retningen, (c) begrenset uniaxial forskyvning i X-retningen, (d) ren skjær i Y-retningen, og (e) begrenset uniaxial forskyvning i Y-retningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 14
Figur 14: representant data fra stress-avslapping protokollene for mitral og trikuspidalklaff ventil fremre brosjyrer. Representant data for (en) i MVAL og (b) TVAL, illustrerer eksponentiell stress reduksjon over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navnet X-aksen Y-aksen Strekk (s) Hold (s) Gjenopprette (s) Resten (s) XPreload (mN) YPreload (mN) Representanter Data (Hz) Bilde (Hz)
FirstImage Trinn 0,0 (mN) Trinn 0,0 (mN) 1 0 1 0 0,0 (første) 0,0 (første) 1 1 1
PreconditioningA Trinn F (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 0.025*F (første) 0.025*F (første) 8 15 0
PreconditioningB Trinn F (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:1A Trinn F (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:1B Trinn F (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
0.75:1A Trinn (0.75*F) (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
0.75:1B Trinn (0.75*F) (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:0.75A Trinn F (mN) Trinn (0.75*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:0.75B Trinn F (mN) Trinn (0.75*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
0.5:1A Trinn (0.5*F) (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
0.5:1B Trinn (0.5*F) (mN) Trinn F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:0.5A Trinn F (mN) Trinn (0.5*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:0.5B Trinn F (mN) Trinn (0.5*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15

Tabell 1: Full testing parametere for alle protokoller av kraft-kontrollerte testing ordningen. Styrker (i millinewtons) er skrevet som F å representere styrken forbundet med målrettet peak membran spenningen. Strekk tid er skrevet som representerer strekk tiden (i sekunder) bestemt til vev blir testet.

X-aksen Y-aksen Strekk (s) Hold (s) Gjenopprette (s) Resten (s) XPreload (mN) YPreload (mN) Representanter Data (Hz) Bilde (Hz)
Trinn 0,0 (mN) Trinn 0,0 (mN) 1 0 1 0 0,0 (første) 0,0 (første) 1 1 1
Rampen dx (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 0.025*F (første) 0.025*F (første) 10 15 0
Rampen dx (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampen 0,0 (%) Rampen 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampen dx (%) Rampen 1 /dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampen dx (%) Rampen 1 /dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampen 0,0 (%) Rampen 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampen 1 /dx (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampen 1 /dx (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampen 0,0 (%) Rampen 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampen dx (%) Rampen 0,0 (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampen dx (%) Rampen 0,0 (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampen 0,0 (%) Rampen 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampen 0,0 (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampen 0,0 (%) Rampen dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15

Tabell 2: Full testing parametere for alle protokoller av forskyvning-kontrollerte testing ordningen. Forskyvninger (i prosent) er skrevet som dx og dy representerer toppen etter preconditioning prosent forlengelse i X - og Y-retningene, henholdsvis. Strekk tid er skrevet som representerer strekk tiden (i sekunder) bestemt til vev blir testet. Forkortelser: PS = ren skjær; CU = begrenset uniaxial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avgjørende skritt for denne biaxial mekanisk tester inkluderer (i) riktig retning av brosjyren, (ii) riktig biaxial tester oppsett for ubetydelig skjær og (iii) en forsiktig anvendelse av fiducial markører. Retningen til heftet er avgjørende å fått mekanisk karakterisering av brosjyre vev som materiale er Anisotrop i naturen. Dermed må radial og omkrets instruksjonene være kjent for riktig justering vevsprøver med testing X - og Y-retningene. Det er også viktig at biaxial testeren er riktig kalibrert slik at prøven er montert til systemet med ubetydelig skjæring stress introdusert. Hvis en ikke-ubetydelig mengde skjær er observert, kan resultatene være sterkt fordreid i påfølgende vev påkjenningen og stress beregninger. Spesiell oppmerksomhet er nødvendig å programmet av de fire fiducial markørene for å sikre at ingen av markørene stick til andre å unngå unøyaktig beregninger av vev stammer. Med hensyn til vev belastning beregninger kalles interesserte lesere prosedyrene som beskrevet i tidligere studier2,23,25.

Noen endringer som kan gjøres til gjeldende protokoller omfatter tillegg strain-rate og krype testing til testing rammeverk. Disse testene tillate innsikt i ulike viskoelastiske egenskaper av aorta hjertet ventiler (AHV) brosjyren, men det har vist i tidligere litteraturen at belastning-rate og krype er ubetydelig for hjertet ventil pakningsvedlegget vev under fysiologisk fungerende vilkår.

Begrensninger ved denne metoden inkluderer potensialet for skjær innføring i tilfeller av uriktig planar justering av prøven og fast fiducial indikatorer som ugyldige data, som nevnte. Andre begrensninger i denne metoden inkluderer bruk av tinder for prøven montering, som prøven kontrolleres bare av fem poeng på hver kant, i stedet for en full kontroll kontroll prøven kantene. Bruk av tinder over klem metoder forårsaker problemer med uniaxial testing protokoller slik at tinder kan små deformasjoner tross forskyvning av tine-slutten koblet til biaxial testing systemet å være konstant. Denne deformasjon fra personlige tine bevegelsen kan imidlertid antas ubetydelig.

Denne metoden er betydelig i sine fordeler sammenlignet med andre metoder fordi alle testing protokoller (force-kontrollerte, forskyvning-kontrollert, og stress-avslapping) utføres i én enhetlig vev prøven. Alternativer til presentert metodikken kan bare utføre en testing protokoll for hvert vev, i stedet for tre kombinert testing protokoller. Dette innebærer at disse alternativene ikke være så nøyaktig i sin beskrivelse av vev, som vev egenskaper kan variere betydelig mellom vev fra ulike dyr fag.

Denne metoden kan utvides ved søknad til andre materialer foruten atrioventrikulær hjertet ventil løpesedler. Disse metodene kan for eksempel være nyttig i karakteriserer andre myke vev eller polymerer/gummi-type materiale. Den angitte ordningen vil gi for full karakterisering av slike materialer som er kompatibel med en biaxial testing enheten, forutsatt at det er en tilstrekkelig oppsett, som aktuelle belastning-cellen kapasitet og prøven størrelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association forsker Development Grant 16SDG27760143. Forfatterne vil også erkjenne forskningsstipend mentor fra University of Oklahoma's Office for Undergraduate forskning for å støtte både Colton Ross og Devin Laurence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Solution, Neutral Bufffered Sigma-Aldrich HT501128-4L 
40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope AmScope SKU: T120C
BioTester - Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5N Load Cell Capacity
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
MATLAB MathWorks Version 2018b
Phosphate-Buffered Saline n/a Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024 Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May-Newman, K., Yin, F. Biaxial mechanical behavior of excised porcine mitral valve leaflets. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 269 (4), H1319-H1327 (1995).
  2. Billiar, K., Sacks, M. A method to quantify the fiber kinematics of planar tissues under biaxial stretch. Journal of Biomechanics. 30 (7), 753-756 (1997).
  3. Grashow, J. S., Sacks, M. S., Liao, J., Yoganathan, A. P. Planar Biaxial Creep and Stress Relaxation of the Mitral Valve Anterior Leaflet. Annals of Biomedical Engineering. 34 (10), 1509-1518 (2006).
  4. Humphrey, J. D., Vawter, D. L., Vito, R. P. Quantification of strains in biaxially tested soft tissues. Journal of Biomechanics. 20 (1), 59-65 (1987).
  5. Sacks, M. A method for planar biaxial mechanical testing that includes in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 551-555 (1999).
  6. Sacks, M., Chuong, C. Biaxial mechanical properties of passive right ventricular free wall myocardium. Journal of Biomechanical Engineering. 115 (2), 202-205 (1993).
  7. Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
  8. Lanir, Y., Fung, Y. Two-dimensional mechanical properties of rabbit skin-II. Experimental results. Journal of Biomechanics. 7 (2), 171-182 (1974).
  9. Sun, W., Sacks, M. S., Sellaro, T. L., Slaughter, W. S., Scott, M. J. Biaxial mechanical response of bioprosthetic heart valve biomaterials to high in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (3), 372-380 (2003).
  10. Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), H898-H912 (2009).
  11. Tong, J., Cohnert, T., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Effects of age on the elastic properties of the intraluminal thrombus and the thrombus-covered wall in abdominal aortic aneurysms: biaxial extension behaviour and material modelling. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 (2), 207-219 (2011).
  12. Billiar, K. L., Sacks, M. S. Biaxial mechanical properties of the natural and glutaraldehyde treated aortic valve cusp-Part I: Experimental results. Transactions-American Society of Mechanical Engineers Journal of Biomechanical Engineering. 122 (1), 23-30 (2000).
  13. Jett, S., et al. Biaxial mechanical data of porcine atrioventricular valve leaflets. Data in Brief. 21, 358-363 (2018).
  14. Pham, T., Sun, W. Material properties of aged human mitral valve leaflets. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (8), 2692-2703 (2014).
  15. Pierlot, C. M., Moeller, A. D., Lee, J. M., Wells, S. M. Biaxial creep resistance and structural remodeling of the aortic and mitral valves in pregnancy. Annals of Biomedical Engineering. 43 (8), 1772-1785 (2015).
  16. Potter, S., et al. A Novel Small-Specimen Planar Biaxial Testing System With Full In-Plane Deformation Control. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), 051001 (2018).
  17. Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
  18. Grashow, J. S., Yoganathan, A. P., Sacks, M. S. Biaixal stress-stretch behavior of the mitral valve anterior leaflet at physiologic strain rates. Annals of Biomedical Engineering. 34 (2), 315-325 (2006).
  19. Huang, H. -Y. S., Lu, J. Biaxial mechanical properties of bovine jugular venous valve leaflet tissues. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , 1-13 (2017).
  20. Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
  21. Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. W. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
  22. Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
  23. Jett, S., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
  24. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 23 (4), 291-299 (2001).
  25. Sacks, M. S. Biaxial mechanical evaluation of planar biological materials. Journal of Elasticity. 61 (1), 199 (2000).

Tags

Bioteknologi problemet 146 Biaxial mekanisk testing mitral ventil trikuspidalklaff ventil vev biomekanikk stress og belastning beregninger digitalt bilde korrelasjon histologiske analyse stress avslapning
Biaxial mekanisk Characterizations av atrioventrikulær hjertet ventiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, C., Laurence, D., Wu, Y., Lee, … More

Ross, C., Laurence, D., Wu, Y., Lee, C. H. Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves. J. Vis. Exp. (146), e59170, doi:10.3791/59170 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter