Summary
Этот протокол включает характеристики предсердно клапан листовок с контролируемой силы, перемещения контролем, и релаксации напряжений двухосных механических процедур тестирования. Результаты, полученные с этот протокол может использоваться для разработки составных моделей для имитации механическое поведение функционирования клапанов в рамках моделирования методом конечных элементов.
Abstract
Обширные двухосных механических испытаний предсердно сердца клапан листовок могут быть использованы для получения оптимальных параметров, используемых в составных моделей, которые обеспечивают математическое представление механические функции этих структур. Этот представленных двухосных механических испытаний протокол включает в себя приобретение ткани (i), (ii подготовка образцов тканей, (iii) двухосных механических испытаний и (iv) постобработка полученных данных. Во-первых приобретение ткани требует получения баранину или свинину сердца от местных продуктов питания и медикаментов одобрил скотобойня для более поздних диссекции для извлечения клапан листовки. Во-вторых Подготовка тканей требует использование ткани образец фрезы на листовке ткани для извлечения четкие зоны для тестирования. Третьих, двухосных механических испытаний образца листовка требует использования коммерческих двухосных механических тестер, которая состоит из под контролем силы, контролируемые перемещения, и релаксации напряжений тестирования протоколов характеризовать листовка ткани механические свойства. Наконец, пост-обработки требует использования методов корреляции данных изображения и силы и перемещения чтений обобщить ткани механического поведения в ответ на внешние нагрузки. В целом результаты от двухосных тестирования показывают, что листовка тканей дают нелинейной, анизотропная механические ответ. Представленных двухосных процедуры тестирования выгодно для других методов, поскольку представленные здесь метод позволяет для более всеобъемлющего характеристика клапана листовка ткани под одной единой схемы тестирования, в отличие от отдельных протоколов испытаний на образцы различных тканей. Предлагаемый метод тестирования имеет свои ограничения в том, что напряжение сдвига потенциально присутствует в образце ткани. Однако любые потенциальные сдвига считается незначительным.
Introduction
Надлежащего сердца функция опирается на соответствующие механического поведения листовок клапан сердца. В ситуациях, где нарушена сердца клапан листовка механики заболевания клапанов сердца происходит, что может привести к другим вопросам, связанным с сердцем. Понимание заболевания клапанов сердца требует глубокого понимания листовки надлежащего механического поведения для использования в вычислительных моделей и терапевтические развития, и таким образом, схему тестирования должны быть разработаны для точного извлечения здоровых механические свойства листовки. В предыдущих литературы это механическая характеристика было проведено с использованием двухосных механических процедур тестирования.
Двухосных механических процедур испытаний для мягких тканей различаются по всей литературы, с различных платформ тестирования, используется для получения различных характеристик1,2,3,4, 5,6,,78,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. методы тестирования были расширены для исследования механических характеристик сердца клапан листовок. В общем двухосных механических испытаний включает в себя загрузку ткани клапанов сердца с одновременным силами в двух основных направлениях, но как это тестирование проводится изменяется на основе биомеханических свойств соблюдаться. Некоторые из них протоколы испытаний включают в себя (i) скорости деформации, деформации ползучести (ii), (iii) релаксации напряжений и (iv) под контролем сил тестирования.
Во-первых скорости деформации тестирования использовались для определения поведения время зависимых тканей листовки18,20. В этом протоколе испытаний, листовки загружаются максимальная мембраны напряженность в разное время половину цикла (т.е., 1, 0.5, 0.1 и 0.05 s) для определения, если существует значительная разница в пик стрейч или гистерезис между погрузки раз. Однако эти тесты показали незначительное различие в наблюдаемых стрейч с различной штамм тарифы. Во-вторых ползучести тестирования, ткани загружен пик мембраны напряженность и состоявшейся в пик мембраны напряженности. Это тестирование позволяет демонстрация как смещение тканей подкрадывается к поддерживать напряжение мембраны пик. Однако, было показано, что ползучести является незначительным для сердца клапан листовки под физиологически функционирования3,20. В-третьих стресс-тестирование релаксации, ткани загружается пик мембраны напряженность и связанные перемещением проводится постоянная для длительного периода времени3,21,22. В этот тип тестирования тканевый стресс имеет заметное сокращение от пика напряжения мембраны. И наконец в силу контролируемых испытаний, тканей циклически загружаются в различных соотношениях пик мембраны напряженности в каждом направлении17,23. Эти тесты показывают анизотропии материала и ответ нелинейное напряженно деформированного и загружая ткани в различных соотношениях, может лучше понять потенциальные физиологические деформаций. Эти недавние расследования сделал очевидным, что релаксация напряжений и под контролем сил протоколы оказаться наиболее полезным для выполнения механических характеристик сердца клапан листовок. Несмотря на эти успехи в сердце клапан биомеханическая характеристика тестирование не проводилось под одной единой тестирования схемы, и есть ограниченное методы исследовать связь между направлениями.
Цель этого метода заключается в содействии полной материальной характеристику листовки клапан сердца схемой единой двухосных механических испытаний. Единой схемы тестирования рассматривается как одно место, где проверяется каждый буклет под всех протоколов испытаний в одной сессии. Это выгодно, как ткани свойств изначально переменной между листовки, поэтому полная характеристика для каждой листовке доказывает как дескриптор более точной, чем выполнение каждого протокола независимо на различные листовки. Тестирования схема состоит из трех основных компонентов, а именно (i под контролем сил двухосных тестирования протокола, (ii перемещение контролируемых двухосных тестирования протокола и (iii) протокола тестирования двухосных релаксации напряжений. Все тестирования схемы использовать скорость загрузки 4.42 N/мин и 10 циклов погрузки разгрузки для обеспечения напряженно деформированного кривой Воспроизводимость 10 цикла (как найти в предыдущей работе)23. Все протоколы также построены исходя из мембраны напряженность, которая требует, чтобы толщина менее 10% длины эффективного образца.
Под контролем сил протокол, используемый в этом методе представленных состоит из 10 погрузки и разгрузки циклов с пиковой напряженности мембраны 100 N/m и N 75/м для митрального клапана (MV) и трехстворчатого клапана (ТВ), соответственно,15,17. Передаточное, 1:0.75, 0.5:1 и 1:0. 5 в этой под контролем сил тестирования протокола, а именно: 1:1, рассматриваются пять коэффициенты загрузки. Эти пять загрузки соотношения оказаться полезным при описании напряжений и деформаций корреспондент для всех потенциальных физиологического деформаций листовки в естественных условиях.
Перемещение контролируемых протокола, представленные в этом методе состоит из двух сценариев деформации, а именно: (i) ограниченное Одноосное растяжение и (ii) чистого сдвига. В ограниченных Одноосное растяжение, одну сторону ткани перемещены в пик мембраны напряженности во время фиксации в другом направлении. В настройках чистого сдвига ткань растягивается в одном направлении и рассудительно сокращен в другом направлении, поэтому области ткани остается постоянной при деформации. Каждый из этих перемещение контролируемых процедур тестирования выполняется для каждого из направлений двух тканей (кольцевых и радиальных направлениях).
Релаксация напряжений протокол, используемый в методе представленных достигается путем загрузки тканей натяжение мембраны пик в обоих направлениях и удерживая ткани на корреспондентских перемещений за 15 минут, чтобы контролировать поведение релаксации напряжений ткани. Далее рассматриваются подробные экспериментальные процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Оклахома. Все ткани животных были приобретены от Соединенных Штатов Америки, Министерство сельского хозяйства-утвержденного бойни (страны домой мясо Co., Эдмонд, OK).
1. ткань приобретение и очистка
- Получить животных сердца в тот же день, как убой животных и хранить сердца в льда сундук для обеспечения свежести ткани. Транспортные сердца к космической лаборатории.
- По прибытии в лаборатории опускайте сердце в ведро фосфат амортизированное солевой раствор (PBS), чтобы смыть любой избыток крови. Извлекают щипцами, placemat, хирургическое лезвие, ведро раствора PBS, отбеливатель и пластиковый пакет. Подготовьте placemat, возложив его на счетчик рассечение, позволяющие проще очистки крови связанных беспорядок. После того как сердце было достаточно промыть, поместите сердце на столовых приборов (рис. 1a).
- С помощью щипцов, найдите прощание линии между предсердия и желудочка на каждой стороне сердца. С помощью лезвия бритвы, тщательно надрезают вдоль этой линии расставание и выявить клапанов сердца и желудочков (рис. 1b). Сделайте надрез вдоль всей внешней окружности сердца, таким образом, что предсердия и все сердце материала превосходит желудочков могут быть удалены.
- Пинцетом осторожно вытащите любой наблюдаемых сгустков крови в желудочки (рис. 1С). Если предпринимается попытка удалить сгусток крови, но он не двигаться, обеспечить сосцевидными tendineae или листовки не был схватил. Место образования сгустков крови в биологической сумка для удаления отходов.
- Когда были удалены все сгустки крови из желудочков, промойте сердце последний раз в ведро с раствором PBS. Место чистое сердце в полиэтиленовый пакет и хранить его в холодильнике.
- С помощью решения Блич 10% и 90% воды, смеси крови с раствор отбеливателя и Переполох непрерывно в течение примерно 10 минут искать лечение успешным отбеливатель, обозначается переход от красного до желтого раствора. Распоряжаться Блич лечение крови через дренаж.
Предупреждение: Bleach является токсичным веществом и может быть вредным Если организм.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
2. сердце диссекции и изучения анатомии
- Извлечь ранее очищенную сердца и дать ему растаять в ванне с теплой водой. Необходимые материалы для рассечения включают Щипцы хирургические лезвия, салфетки, PBS и небольшие контейнеры. После сердце полностью разморожен, положить его на placemat поглощать любые остающиеся крови.
- Держите сердца (Улучшенный) вид сверху вниз оптимально соблюсти клапан структур. Начиная с МВ на левой стороне сердца, используйте щипцы для тщательно управлять листовки и определить спайки, или прощание линии, между листовки.
- Надрезают вдоль спайки и тщательно вырезать через стенку желудочков, убедившись в том, чтобы не повредить листовки. Это может быть необходимо вырезать аккордовые вложения в ходе этого процесса, чтобы полностью открыть желудочка. Полный разрез, откройте желудочка (рис. 2a).
- Идентифицировать MV передней и задней листовки и использовать хирургическое лезвие разорвать аккордовые вложения папиллярных мышц. С помощью щипцов, растянуть тугой листовки и сделать разрезы отделить листовки от кольце. Подакцизным листовки в соответствующей маркировкой контейнера, заполненные раствором PBS и хранить его в холодильнике на около 4 ° C.
- Держите сердца для просмотра сверху вниз и определить ТВ на правой стороне сердца. Найдите спаек и надрезают через один из спаек и желудочковая стены (рис. 2b).
- Определить ТВ межжелудочковой перегородки, задний и передний листовки и выполнять листовка добыча, как это сделано в шаге 2.4. Поместите все полученные листовки в контейнере помечены заполнены раствором PBS и Храните контейнер в холодильнике на около 4 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Однако в течение 2 дней диссекции сердце должно происходить ткани биомеханические тестирования и анализа последующей гистологии.
3. ткань вскрытие
- Получить брошюру из холодильника, ткани резак для указанного размера резания, хирургической ручкой, щипцы, лезвия и резки мат.
- С помощью щипцов, удалить образцы из PBS решения и заложить плашмя на резки мат с радиальное направление (R) выравниваются по оси Y и окружности (C) соответствие в X-направлении (рис. 3a). Идентифицировать листовка центрального региона как тестирования секции.
- Совместите резец ткани так, что нужного ткани тестирования регион находится в пределах границ лезвия бритвы. Сделать один разрезать горизонтально, а другой по вертикали, чтобы сформировать площади региона желаемых размеров (рис. 3b). С помощью хирургического пера, этикетки ткани в радиальном направлении (рис. 3b).
- С помощью лезвия бритвы, обрежьте аккордовые вложения путем растяжения сосцевидными из листовки с щипцами и тщательно вырезать не причинив повреждения листовки.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если протокол приостановлена, хранить секционного ткани в контейнере помечены заполнены раствором PBS и хранить контейнер в холодильнике на около 4 ° C (как описано в шаге 2.6). Однако ткани тестирование должно происходить в течение 2 дней диссекции.
4. толщина измерение и настройка двухосных тестер
- Получить образец секционного ткани, Цифровые штангенциркули и небольшой металлической лопаткой. Используя цифровые Штангенциркули, измерить и записать толщины металлической лопаткой.
- С помощью щипцов, образец ткани заложить плашмя на металлической лопаткой. Используя цифровые Штангенциркули, измерьте толщину пары шпатель ткани (рис. 3 c) в трех местах различные листовки. Вычесть шпатель толщиной от каждого измерения и записывать средняя толщина.
- Подготовьте ванну PBS при 37 ° C, который соответствует ткани физиологических условиях.
5. ткани монтажа и фидуциальный маркер размещение
- Извлечь щипцы, образец ткани, крепеж, инструмент, острым концом, стеклянные бусины (с диаметром 300 – 500 µm) и супер клей.
- Монтировать ткани для двухосных тестирования системы (рис. 3de). Во время монтажа, убедитесь, что ткань кольцевых и радиальных направлениях выровнены с машиной X - и Y-направления.
- Для размещения фидуциальный маркер место стеклянные бусины в один контейнер с открытым лицом и небольшой бассейн супер клей в другом контейнере. Используя средство острым концом, пальто кончик с небольшим количеством супер клей и придерживаться индивидуальных шарик до кончика инструмента.
- Внимательно используйте средство для передачи шарик в одном углу средней трети ткани тестирования региона (Рисунок 3f). Повторите этот шаг, пока не квадратный массив из четырех бисера сформированные (рис. 3 g).
Примечание: Важно избегать избыточного клея, и что фидуциальное маркеры не слипаются, как позднее методов корреляции (DIC) цифровых изображений будет производить бесполезно отслеживания результатов. Важно, что квадратный массив должен быть в средней трети ткани тестирование региона.
6. Предварительная подготовка шаг и продолжительность сроков
- Чтобы вычислить соответствующие мембраны напряженности, получить ткани эффективное тестирование длины края и использовать следующее уравнение.
(1)
Примечание: T здесь, мембраны напряженность в единице силы/длины, f -сила, и L является эффективное тестирование длины образца. - Создайте предварительной протокол, чтобы ткани будет проходить 10 циклов погрузки/разгрузки на силы, связанные с пик мембраны напряженности со скоростью загрузки 4.42 N/мин, включая преднагрузки 2,5% от максимальной силы (рис. 4).
- Создайте новый каталог произвольного тестирования для временного хранения данных, предварительной, потому что он не является необходимым для будущих расчетов. Установить скорость загрузки 4.42 N/мин для последующего тестирования.
- Создайте новый набор параметров тестирования и задать имя протокола как Preconditioning0 (рис. 4a). Для X - и y установите режим управления сил и функции управления шаг. Задайте нагрузки величина силы, связанные с целевой пик мембраны напряжения (см. шаг 6.1) (рис. 4В). Установите преднагрузки величины как 2,5% от максимальной силы для первого повторения только (рис. 4 c). Установите растянуть продолжительность и продолжительность восстановления оба быть 25 s. набор количество повторений , чтобы быть 10 (Рисунок 4e).
- По завершении этапа предварительной запишите ткани деформации в X - и Y-направления. Подготовьте протокол переехать максимальной силы, начиная от записанных размер образца.
- Извлечь секундомер для времени целей. Максимальная сила нагрузки протокола начать и одновременно запустить секундомер, когда машина начинает срабатывания (Рисунок 5a). Остановите секундомер при остановке привода. Остановка будет видно через слуховые сигналы.
- Запись после предварительной деформации ткани пик наряду с время от секундомер, представляющие ткани оптимальное время растяжения (Рисунок 5b).
(1)7. двухосных механических испытаний
- Подготовьте протокол под контролем сил со скоростью загрузки 4.42 N/мин.
- Открыть новый тестирования каталог и имя теста. Задайте данные для сохранения в известном месте для использования в более поздних вычисления напряжений и деформаций. Переместите образца обратно к исходной конфигурации монтажа.
- Создание набора протокол под названием FirstImage. Установите Ось x и ось y режим управления силы и функции управления к шагу. Значение нагрузки величина 0 млн. Установка растянуть продолжительность и продолжительность восстановления каждый на 1 секунду. Количество повторений значение 1. Набор данных выходная частота и частота вывода изображения каждого 1Гц.
- Постройте новый проверочный набор, названный PreconditioningA. Создание параметров тестирования, таким образом, что ткани будет проходить 10 повторений циклических погрузки/разгрузки в целевых сил для желаемого мембраны напряжение точно так, как был подготовлен на шаге 6.2. Обратите внимание, что теперь, растянуть время и время восстановления должно быть время, записанный на шаге 6.3.2. Изображения не регистрируются в A тестирования набор, но данные регистрируются в 15 Гц.
- Постройте другой тестирования набора, названный PreconditioningB. Все тестирования параметров должны быть идентичны тем, которые, как упоминалось в предыдущем шаге, с исключением что частота вывода изображения устанавливается до 15 Гци не преднагрузки применяется.
- После предварительной протокол, создать протоколы испытаний, так что ткань загружается пик мембраны напряженность в следующие показатели кольцевых радиальные нагрузки со скоростью загрузки 4.42 N/мин: Передаточное 1:1, 1:0.75, 0.5:1 и 1:0.5 (Рисунок 6 ). Извлечение данных из двух последних циклов каждый коэффициент загрузки для последующей обработки данных и анализа, описанный в разделе 10. Обратитесь к таблице 1 для подробного описания протоколов должен быть создан.
- Перемещение контролируемых испытаний протокол 4.42 N/мин со скоростью загрузки готовят следующим образом. (i) Biaxial растяжения в направлении X и Y-направлении перемещения, связанные с пик кольцевых и радиальных тянется, соответственно (рис. 7a). (ii) чистый сдвиг вдоль оси X — растяжение в X-направлении, связанные с пик окружная стрейч и сокращение в Y-направлении, сохраняя неизменным при деформации (Рисунок 7b) пунктирной области. (iii) ограничением Одноосное растяжение вдоль оси X (рис. 7 c). (iv) чистый сдвиг вдоль Y-направления (рис. 7 d). (v) ограничением Одноосное растяжение вдоль Y-направления (рис. 7е).
- Между каждым из этих шагов Постройте отдыха «цикл» 1 мин, который держит ткани в первоначальной конфигурации установлен. Извлечение данных из двух последних циклов каждый коэффициент загрузки для обработки данных и анализов (статья 9). Обратитесь к таблице 2 для подробного описания протоколов должен быть создан.
- Подготовить протокол релаксации напряжений, так что ткань загружается в каждом направлении, со скоростью загрузки 4.42 N/мин, перемещения, связанные с пиковой напряженности мембраны (шаг 7.2) и состоявшейся в что переселение 15 мин (рис. 8 и Рисунок 9). После 15 минут протокола должно быть присвоено восстановить ткани к его исходной конфигурации монтажа.
Примечание: В случае разрыв ткани, прервать тест немедленно, чтобы предотвратить любой потенциальный ущерб, нанесенный Двухосная система тестирования.
8. ткани фиксации для анализа гистологии
- Размонтируйте ткани от двухосных системы тестирования. Поместите ткань в контейнер наполненный формалина 10%, а затем поместите контейнер в среде охлажденных около 4 ° c. Исправьте ткани за 24-48 ч, в зависимости от толщины ткани.
Предупреждение: Формалин известный канцероген и, если дышали, избыток может привести к легкие, чтобы стать фиксированным. Вся работа с формалином должны быть выполнены в вытяжной шкаф с достаточной вентиляцией. - После того, как ткани было зафиксировано в формалине за 24-48 ч, передать 80% этанола раствор для более поздних Гистология ткани. Ткань должна храниться в растворе в охлажденных окружающей среды при 4 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Как только ткани являются фиксированными, образцы могут быть проанализированы в любое время. Если протокол приостановлена, хранить ткани в контейнере Приклеенные этикетку, заполнены с 80% этанола и хранить контейнер в холодильнике на около 4 ° C (как описано в шаге 8.2). - Подготовка ткани для анализа коммерческих гистология согласно инструкциям производителя. Если определенные учредительного листовка, таких как коллаген, эластин, гликозаминогликанов и т.д., представляет интерес исследование, убедитесь, что используется соответствующий гистология пятно.
Примечание: Гистология слайды могут быть визуализированы с помощью микроскопа соблюдать желаемых компонентов (Рисунок 10). - С помощью программы ImageJ обработки изображений, выполните цвет деконволюция методы для определения доли каждой окрашенных составляющей в ткани. Для более подробной информации об этих процедурах пожалуйста, обратитесь к Ruifrok и Джонстон24.
9. двуосной проверочных данных после завершения процедуры обработки
- Выполнение отслеживания на базе DIC на четырех фидуциальный маркеры из снимков, сделанных в ходе двухосных механических испытаний (рис. 11) определить время зависимых маркер позиции.
(2)- Если он требуется для выполнения анализа в отношении конфигурации монтажа, пусть Xя быть маркер позиции в недеформированного состояние в начале двухосных теста. Если это требуется для выполнения анализа в отношении после предварительной деформации, пусть Xя быть маркер позиции в конце предварительной протокола.
Примечание: Последующие шаги будут проводиться таким же образом, независимо от выбранной конфигурации ссылку.
Примечание: Здесь, X,я и x,я недеформированного и деформированные позиции маркеров, соответственно, и d,я -вектор перемещения каждого маркера.
- Если он требуется для выполнения анализа в отношении конфигурации монтажа, пусть Xя быть маркер позиции в недеформированного состояние в начале двухосных теста. Если это требуется для выполнения анализа в отношении после предварительной деформации, пусть Xя быть маркер позиции в конце предварительной протокола.
- Вычислите градиент деформации (F) фидуциальный маркеров с помощью четырех узлов билинейная элементного2,23,25.
(3)
Примечание:, BxI ByIздесь и производных класса shape функции конечных элементов в X - и Y-направления для узла я, соответственно и u,я(t) и ( v,я t) являются время зависимых X - и Y-смещение, соответственно, как ранее определяется из шага 9.1. Обратите внимание, что координаты X и Y выровнены в ткани кольцевых и радиальных направлениях. - Вычислите право тензор деформации Коши – зеленый (C) и тензор зеленый штамм (E).
(4)
Примечание: Здесь, я — тензор личность второго порядка. Определите, кольцевых и радиальных тянется, взяв квадратные корни принцип значения C. - Определите тензор напряжений (1 PK) первый Piola-Кирхгофа (P).
(5)
Примечание: Здесь t толщина образца, и C T и TR являются применяемые мембраны напряженности в кольцевых и радиальных направлениях, соответственно. - Кроме того для вычисления тензоров другие стресса, например тензор напряжений Коши (σ) и тензор напряжений (2 PK) второй Piola-Кирхгофа (S).
(6)
Примечание: Здесь, J -Якоби градиента тензор деформации F.
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стресс стретч данных под контролем сил двухосных механических испытаний показывает нелинейной кривой с некоторым сходством экспоненциальной кривой (Рисунок 12). Что касается реакции в каждом главном направлении материальный поведение поперечно изотропного, с радиальным стрейч, больше, чем продольных деформаций. В некоторых случаях могут флип направления анизотропии, с окружности экспонируется более строгое, чем радиальном направлении. Этот перевернутый ответ наблюдается в телевизор чаще, чем в МВ.
С перемещение контролируемых испытаний, стресс стретч данных следует нелинейных ответ для основного направления, переживает напряжение (чистого сдвига, ограниченного одноосные напряжение [Рисунок 13]). Когда ткани, укорачивает в другие основные направления, наблюдается «отрицательные (компрессионный) стресс». В протоколе ограничением одноосные напряженности также экспонаты увеличение ответ стресс стретч в ограниченных направлении, демонстрируя муфта прикладной растяжения в другие основные направления.
От тестирования релаксации напряжений, нормированный мембраны напряжение время данных следует нелинейных распадаясь кривой (рис. 14, б). В МВ и телевидение листовка тканей экспонат большего снижения стресса в радиальном направлении по сравнению с показателем в направлении по окружности.
Представитель гистологические результаты митрального клапана передней листовка (MVAL) и трехстворчатого клапана тканей передней листовка (TVAL) с помощью Masson trichrome представлены на рисунке 10. Массон trichrome пятно демонстрирует типичные компоненты в предсердно сердечных клапанов, например волокон коллагена (синий) и клапанной интерстициальных клеток (красный цитоплазмой и черных ядер). Другие пятна может использоваться для визуализации составляющих, таких как эластин (Верхоеф Ван Гизону пятно) и гликозаминогликанов (Альциановый синий краситель).
Рисунок 1: экспериментальный фотографии свинину сердец, полученных из местных скотобоен. () A всем сердцем ополаскивается крови раствором PBS. (b) сокращение производится между предсердий и желудочков раскрыть митрального и трикуспидального клапанов. сгустки крови (c), затем удаляются из сердца перед хранением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: экспериментальной фотографии открытых свинину сердца, раскрывая пяти предсердно сердца клапан листовки и другие компоненты аппарата клапан. () митрального клапана с рассечение левого желудочка вдоль спайки между двумя листовки, показывая передней листовка (MVAL) и задней листовка (MVPL) и (b) трехстворчатого клапана с аналогичными рассечение на правой стороне сердце, выявление передней листовка (TVAL), задней листовка (TVPL) и межжелудочковой перегородки листовка (TVSL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: экспериментальные фотографии подакцизным листовки готовится для двухосных механических испытаний. Сердца клапан листовка тестирование требует () основная листовка секционного в (b) 10 x 10 мм тестирования регионом (радиальное направление отметил хирургической ручкой маркерами). (c) листовки толщина измеряется. Образцы устанавливаются для тестирования системы (d) двухосных (e) пирсинг ткани с металла пальцев. После монтажа, фидуциальный маркеры (f) наклеиваются на поверхность ткани до погружения (g) в растворе PBS при 37 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример параметры протокола для предварительной проверки митрального клапана передней листовка 7,5 х 7,5 мм тестирования региона. Предварительной протокол создается путем установки () протокол имя, (b) тестирования режим управления и сил на оси x, (c) преднагрузки условий, (d) оси y параметров, чтобы быть таким же, как и оси x, и (е. ) параметры цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: пример параметры протокола для времени шага для митрального клапана передней листовку по 7,5 х 7,5 мм тестирования региона. Шаг времени требует () перемещение ткани от после предварительной деформации напряжение мембраны пик (и соответствующие максимальной деформации) при одновременно начиная секундомер для записи растянуть время. Когда будет достигнут целевой силы, (b) после предварительной деформации записывается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: схема под контролем сил двухосных процедуры тестирования для тестирования митрального и трехстворчатого клапана листовки. Протокол испытаний состоит из equibiaxial загрузки, литраж шаг осуществлять ткани в естественных условиях состояние, следуют различные коэффициенты загрузки пик мембраны напряженности в каждом направлении ткани (Tx:Ty): 1:1, Передаточное, 1:0.75, 0.5:1 и 1:0. 5. Каждый подраздел протокола тестирования под контролем сил выполняется для 10 циклов погрузки/разгрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: схема перемещения контролируемой двухосных процедуры тестирования для тестирования митрального и трехстворчатого клапана листовки. Протокол испытаний состоит из () двухосных перемещений, связанных с пик мембраны напряженности, чистого сдвига (b) в X-направлении, (c) ограничивает одноосные перемещения в X-направлении, (d) чистого сдвига в Y-направлении и (e) ограничены одноосные перемещения в Y-направлении. Каждый подраздел перемещение контролируемых испытаний протокол выполняется для 10 циклов погрузки/разгрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: пример релаксации напряжений тестирования параметров для передней листовка митрального клапана с эффективного тестирования региона 7,5 х 7,5 мм. Проверка установленных параметров релаксационные стресс-тестирования для митрального клапана передней буклет, где целевые перемещение является пик деформации ткани, характерных для этой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: схема 15 min релаксации напряжений процедуры тестирования для тестирования митрального и трехстворчатого клапана листовки. Протокол испытаний включает в себя Холдинг двухосных перемещения, связанные с пик мембраны напряженности за 15 мин, после чего ткань возвращается для монтажа конфигурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: гистологические данные примера из предсердно сердечных клапанов передней листовки. Представитель гистология изображения () митрального клапана передней листовку и (b) задней листовка трехстворчатого клапана. Оба являются витражи с trichrome пятном Masson: коллаген в голубой, цитоплазмы и кератин в красном и ядер в черном. В баре шкалы = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11: представитель изображения, иллюстрирующие отслеживания координат четырех фидуциальный маркеров во время двухосных механических испытаний с использованием данных изображения метод корреляции (DIC). () ткани монтажа конфигурации. (b) конфигурации после предварительной шаг. (c) деформированную конфигурацию связанные с образцами тканей при механической нагрузке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12: репрезентативных данных из под контролем сил протоколы для передней листовка митрального клапана (MVAL). Репрезентативных данных демонстрирует анизотропии материала и нелинейной деформации реакции тканей под двухосных нагрузки на различные коэффициенты загрузки пик мембраны напряженности в каждом направлении ткани (Tx:Ty): () Передаточное 1:1, (b), (c) 1:0.75, 0.5:1 (d) и (e) 1:0. 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 13: репрезентативных данных от перемещения контролируемой протоколы для передней листовка митрального клапана (MVAL). Репрезентативных данных демонстрирует анизотропии материала и нелинейной деформации реакции тканей во время () двухосных перемещения, связанные с пик мембраны напряженности, чистого сдвига (b) в X-направлении, (c) ограничены одноосные перемещения в X-направлении, (d) чистого сдвига в Y-направлении, и (e) ограничены одноосные перемещения в Y-направлении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 14: репрезентативных данных от релаксации напряжений протоколы для митрального и трикуспидального клапана передней листовки. Репрезентативных данных для () MVAL и (b) TVAL, иллюстрирование экспоненциальный стресса с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя набора | Ось x | Ось y | Растяжение (s) | Провести (s) | Восстановление (s) | Отдых (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Повторений | Данные (Гц) | Изображение (Гц) | |
| FirstImage | Шаг 0.0 (mN) | Шаг 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (первый) | 0.0 (первый) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | Шаг F (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (первый) | 0.025*F (первый) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | Шаг F (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | Шаг F (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | Шаг F (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | Шаг (0.75*F) (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | Шаг (0.75*F) (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | Шаг F (mN) | Шаг (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | Шаг F (mN) | Шаг (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | Шаг (0.5*F) (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | Шаг (0.5*F) (mN) | Шаг F (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | Шаг F (mN) | Шаг (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | Шаг F (mN) | Шаг (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 | |
Таблица 1: полное тестирование параметров для всех протоколов тестирования схемы, под контролем сил. Сил (в millinewtons) записываются как F представлять силы, связанные с целевой пик мембраны напряженности. Растянуть время записывается как t представляют растянуть время (в секундах) конкретных для испытываемой ткани.
| Ось x | Ось y | Растяжение (s) | Провести (s) | Восстановление (s) | Отдых (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Повторений | Данные (Гц) | Изображение (Гц) |
| Шаг 0.0 (mN) | Шаг 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (первый) | 0.0 (первый) | 1 | 1 | 1 |
| Рамп dx (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (первый) | 0.025*F (первый) | 10 | 15 | 0 |
| Рамп dx (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Нет | Нет | 1 | 15 | 0 |
| Рамп dx (%) | Рамп 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 |
| Рамп dx (%) | Рамп 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Нет | Нет | 1 | 15 | 0 |
| Рамп 1 /dx (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 |
| Рамп 1 /dx (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Нет | Нет | 1 | 15 | 0 |
| Рамп dx (%) | Рамп 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 |
| Рамп dx (%) | Рамп 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Нет | Нет | 1 | 15 | 0 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 10 | 15 | 0 |
| Рамп 0.0 (%) | Рамп dy (%) | t | 0 | t | 0 | Нет | Нет | 2 | 15 | 15 |
Таблица 2: полное тестирование параметров для всех протоколов тестирования схемы перемещения контролируемой. Перемещений (в процентах) записываются как dx и dy представлять пик, после предварительной подготовки процентное удлинение в X - и Y-направления, соответственно. Растянуть время записывается как t представляют растянуть время (в секундах) конкретных для испытываемой ткани. Сокращения: PS = чистый сдвиг; CU = ограничены одноосные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги для двухосных механических испытаний включают в себя (i правильной ориентации листовки, (ii) надлежащего двухосных тестер установки для незначительный сдвиг, и (iii тщательного применения фидуциального маркеров. Ориентация листовка имеет решающее значение для полученных механическая характеристика листовка ткани как материал является анизотропной в природе. Таким образом кольцевых и радиальных направлениях должны быть известны для надлежащего согласования образцов ткани с тестирования X - и Y-направления. Важно также, что двухосных тестер правильно откалиброван таким образом, чтобы образец монтируется к системе с незначительным касательное напряжение представил. Если наблюдается не незначительное количество сдвига, результаты могут сильно смещены в последующих ткани напряжение и стресс расчеты. Для применения четырех фидуциальный маркеров для обеспечения, что ни один из маркеров прилипает к другим, чтобы избежать неточных расчетов штаммов ткани требуется особое внимание. Что касается расчетов деформации ткани заинтересованные читатели упоминаются процедуры как подробно говорится в предыдущих исследований2,23,-25.
Некоторые изменения, которые могут быть сделаны для текущей протоколы включают добавление скорости деформации и ползучести, тестирование, чтобы платформа тестирования. Эти тесты позволяют понять различные вязкоупругие свойства аорты сердца клапан (AHV) листовки, но это было показано в предыдущих литературе что и скорости деформации ползучести незначительны для сердца клапан листовка тканей под физиологически условия функционирования.
Ограничения этого метода включают потенциал для сдвига введение в случаях ненадлежащего Вселенский выравнивание образца и застрял фидуциальный маркеров, которые недействительными данные, как выше. Другие ограничения этого метода включают в себя использование пальцев для образца монтажа, как образец управляется только пять очков на каждого края, а не полное зажима образца краев элемента управления. Использование зубья зажимного методами вызывает проблемы с одноосные протоколов испытаний, таким образом, чтобы зубья может позволить малых деформаций несмотря на смещение зуб конца придает Двухосная система тестирования, постоянную. Однако этой деформации от движения отдельных зуб можно предположить незначительное.
Этот метод имеет важное значение в ее преимущества по сравнению с другими методами, потому что все протоколы испытаний (под контролем силы, перемещения контролем и релаксации напряжений) выполняются в одной единой ткани образца. Альтернативные методологии, представленные могут выполнять только один протокол испытаний для каждой ткани, а не три сводных протоколов испытаний. Это предполагает, что эти альтернативы не может быть точным в их описании поведения тканей, как свойства ткани могут значительно различаться между тканями от разных животных субъектов.
Этот метод может быть продлен на приложения для других материалов, помимо предсердно сердца клапан листовки. Например эти методы могут быть полезны при характеристике других мягких тканей, или материалы полимеры/резина типа. Предоставленный схема обеспечит для полного описания любых таких материалов, совместимых с двухосной тестирования устройство, при условии, что существует достаточное установки, такие как соответствующие нагрузки-соты и размер образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца ученый развития Грант 16SDG27760143. Авторы хотели бы также признать наставничество исследовательских стипендий от Университет Оклахомы управление Undergraduate исследований для поддержки Колтон Росс и Девин Лоуренс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
References
- May-Newman, K., Yin, F. Biaxial mechanical behavior of excised porcine mitral valve leaflets. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 269 (4), H1319-H1327 (1995).
- Billiar, K., Sacks, M. A method to quantify the fiber kinematics of planar tissues under biaxial stretch. Journal of Biomechanics. 30 (7), 753-756 (1997).
- Grashow, J. S., Sacks, M. S., Liao, J., Yoganathan, A. P. Planar Biaxial Creep and Stress Relaxation of the Mitral Valve Anterior Leaflet. Annals of Biomedical Engineering. 34 (10), 1509-1518 (2006).
- Humphrey, J. D., Vawter, D. L., Vito, R. P. Quantification of strains in biaxially tested soft tissues. Journal of Biomechanics. 20 (1), 59-65 (1987).
- Sacks, M. A method for planar biaxial mechanical testing that includes in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 551-555 (1999).
- Sacks, M., Chuong, C. Biaxial mechanical properties of passive right ventricular free wall myocardium. Journal of Biomechanical Engineering. 115 (2), 202-205 (1993).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Lanir, Y., Fung, Y. Two-dimensional mechanical properties of rabbit skin-II. Experimental results. Journal of Biomechanics. 7 (2), 171-182 (1974).
- Sun, W., Sacks, M. S., Sellaro, T. L., Slaughter, W. S., Scott, M. J. Biaxial mechanical response of bioprosthetic heart valve biomaterials to high in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (3), 372-380 (2003).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), H898-H912 (2009).
- Tong, J., Cohnert, T., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Effects of age on the elastic properties of the intraluminal thrombus and the thrombus-covered wall in abdominal aortic aneurysms: biaxial extension behaviour and material modelling. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 (2), 207-219 (2011).
- Billiar, K. L., Sacks, M. S. Biaxial mechanical properties of the natural and glutaraldehyde treated aortic valve cusp-Part I: Experimental results. Transactions-American Society of Mechanical Engineers Journal of Biomechanical Engineering. 122 (1), 23-30 (2000).
- Jett, S., et al. Biaxial mechanical data of porcine atrioventricular valve leaflets. Data in Brief. 21, 358-363 (2018).
- Pham, T., Sun, W. Material properties of aged human mitral valve leaflets. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (8), 2692-2703 (2014).
- Pierlot, C. M., Moeller, A. D., Lee, J. M., Wells, S. M. Biaxial creep resistance and structural remodeling of the aortic and mitral valves in pregnancy. Annals of Biomedical Engineering. 43 (8), 1772-1785 (2015).
- Potter, S., et al. A Novel Small-Specimen Planar Biaxial Testing System With Full In-Plane Deformation Control. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), 051001 (2018).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Grashow, J. S., Yoganathan, A. P., Sacks, M. S. Biaixal stress-stretch behavior of the mitral valve anterior leaflet at physiologic strain rates. Annals of Biomedical Engineering. 34 (2), 315-325 (2006).
- Huang, H. -Y. S., Lu, J. Biaxial mechanical properties of bovine jugular venous valve leaflet tissues. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , 1-13 (2017).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. W. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Jett, S., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 23 (4), 291-299 (2001).
- Sacks, M. S. Biaxial mechanical evaluation of planar biological materials. Journal of Elasticity. 61 (1), 199 (2000).
