Vi præsenterer her, en protokol til isolering af RNA, DNA og protein fra den samme prøve, i et forsøg på at reducere variation, forbedre reproducerbarhed og lette fortolkninger.
En enkelt biologisk prøve rummer et væld af oplysninger, og det er nu almindelig praksis at samtidig undersøge adskillige makromolekyler for at fange et fuldstændigt billede af de flere niveauer af molekylære forarbejdning og skifter mellem forskellige betingelser. Denne protokol præsenterer metoden isolering af DNA, RNA, og protein fra den samme prøve af fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans til at fjerne den variation, der er indført, når disse biomolekyler er isoleret fra replikater af ligeledes behandlet men i sidste ende forskellige prøver. Nukleinsyrer og proteiner er udvundet af fyrretræsnematoden med syre guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode, med efterfølgende nedbør, vask og oploesning af hvert. Vi viser den succesfulde isolering af RNA, DNA og protein fra en enkelt prøve fra tre stammer af fyrretræsnematoden og HeLa celler, med bedre protein isolation resultater i voksne dyr. Derudover forbedrer guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform-udvundet protein fra nematoder opløsningen af større proteiner, med forbedret påviselige mængder konstateret ved immunoblotting, i forhold til den traditionelle RIPA udvinding af protein.
Metoden præsenteres her er nyttigt at undersøge prøver ved hjælp af en multiomic tilgang, specielt til udforskning af proteomet og transkriptom. Teknikker, der samtidig vurderer multiomics er tiltalende, fordi molekylære signaling underliggende komplekse biologiske fænomener menes at opstå på supplerende niveauer; Det er imidlertid blevet mere og mere almindeligt at se, at ændringer i mRNA niveau ikke altid afspejler den samme ændrede Proteinniveau og at tidspunktet for indsamlingen er relevante i forbindelse med døgnrytmen forordninger. Denne metode fjerner enhver intersample variation, når boltpistoler forskellige indhold inden for den samme prøve (intrasample.)
Multiomics, den analytiske tilgang, der bruger en kombination af omik, såsom genom, proteomet, transkriptom, epigenome, microbiome eller lipidome, er blevet stadig mere populære, når de behandler store datasæt for sygdom karakterisering1, 2. Montering beviser har vist, at begrænse tilgange til en enkelt “ome” indeholder ufuldstændige Molekylær analyse (revision af Rotroff og Motsinger-Reif1). Store datasæt er genereret, navnlig når du udfører skærme med høj overførselshastighed teknikker, men for at male et komplet billede eller til at identificere de mest relevante mål, multiomic tilgange er at foretrække. Med anvendelse af multiomics metoder, men er der hyppig observation af uoverensstemmelser mellem mRNA og protein niveauer3,4,5,6. Navnlig, er mRNA og protein bruges til side-by-side transkriptom og proteom analyser med RNA sekventering (RNAseq) og liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), henholdsvis, ofte fremstillet af tilsvarende behandlede prøver fra forskellige replikater, potentielt at indføre variation mellem de samme betingelser,3,4,5,6. Harvald et al. udførte et elegant C. elegans sult tidsforløb undersøgelse, som sammenlignede transkriptom og proteomet af wild-type (WT) orme som hlh-30 mutant orm, der mangler en vigtig transskription faktor i levetiden 7. Bemærk, RNA og protein blev høstet fra de samme betingelse replikater, altså ikke fra samme prøve. Deres resultater viser en lav korrelation mellem mRNA niveau og protein niveauer for hvert tidspunkt (r = 0.559 til 0.628). I virkeligheden, deres heatmap dannet fire klynger: klynge jeg havde et stort fald i mRNA niveauer men lidt eller intet fald i tilsvarende protein niveauer, klynge II havde lidt eller ingen stigning i mRNA niveau men en stigning i protein niveauer, klynge III havde en stigning i mRNA niveauer, men et fald i protein niveauer og klynge IV havde en stigning i mRNA niveauer, men kun en subtil ændring i protein niveauer4. Dette intersample variation kan derudover indføres i tilfælde hvor prøver af den samme betingelse ikke opkræves på nøjagtig samme tid. For eksempel, svinger mRNA og proteiner reguleret af døgnrytmen cyklus afhængigt af tidspunktet for dag8,9, eller, mere specifikt C. elegans eksponering for lys9; udtryk for disse døgnrytmen proteiner kan være forsinket op til 8 timer efter gen expression induktion10. Dog, forekomsten af denne observation betyder ikke nødvendigvis det er forkert; i virkeligheden, kan det vise sig for at være informativ. Protein og mRNA er i en konstant dynamisk tilstand mellem dannelse og nedbrydning. Derudover er proteiner ofte posttranslationally modificeret til at øge stabiliteten eller fremkalde deres nedbrydning11. For eksempel, kan deres status som ubiquitination føre til enten aktivering eller målretning til proteasom eller lysosomet for nedbrydning12. Derudover spiller noncoding RNA’er en vigtig rolle i reguleringen af genekspression på transkriptionel og posttranskriptionelle trin13. Spørgsmålet er således, hvordan man kan begrænse variablerne for at bekræfte, at de uoverensstemmelser, vi observerer i disse ødelægge undersøgelser er reelle.
Her, foreslår vi en metode, der fjerner variablen intersample af tillade analyser af forskellige makromolekyler fra samme prøve. Målet med denne protokol er at tilbyde en metode til at konsekvent isolere DNA, RNA og protein fra en enkelt prøve af C. elegans (også benævnt orme) i et forsøg på at reducere variation, forbedre reproducerbarhed og lette fortolkninger. Yderligere fordele ved at bruge den samme prøve omfatter besparelse på tid og ressourcer under prøvetagning, lette tværsnits analyse af værdifulde og begrænset prøver, herunder stammer, der er svære at dyrke og vedligeholde, og få indsigt i den differentieret regulering af makromolekyler baseret på intrasample variationer i mRNA og protein niveauer.
Denne metode er velegnet til vurdering af gene udtryk og protein niveauer fra en enkelt prøve af orme, giver mulighed for en mere omfattende evaluering af flere niveauer af molekylære behandling. Guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform (GTCp) reagens14, et almindeligt anvendt kemikalie at isolere RNA, der bruges til udvinding af nukleinsyrer og proteiner fra orme, med efterfølgende nedbør, vask og oploesning af hvert. Denne protokol er en samling af forskellige protokoller15,16 med mindre ændringer, designet med fokus på C. elegans, men vi har også med succes isoleret RNA, proteiner, og DNA fra en pellet HeLa celler efter den samme fremgangsmåde. Men er ikke testet her, er denne protokol tilbøjelige til at arbejde på væv samt17,18.
Metoder til biomolekyle isolering, såsom DNA, RNA og proteiner, er ofte optimeret uden tekniske overlapning eller kombinationer. Dette er især uheldigt, når prøverne er vanskelig at opnå, som kunne føre til høst prøver på samme betingelser på forskellige tidspunkter. Afhængigt af den cellulære veje, kan replikater indsamlet på forskellige tidspunkter generere variation. Dette manuskript tilbyder en procedure for at omgå denne forhindring ved at aktivere samtidige isolering og oprensning af hver biomolekyle fra samme prøve af orme, reducere variationer indført af forskellige isolation teknikker, timingen af prøven høst, eller ulige høst. Kontrollere disse variabler ikke blot sparer tid og ressourcer, men også letter reproducerbarhed. Her viser vi en kombinatorisk tilgang, der undgår kompromitterende RNA og protein kvalitet, omend med variable resultater med DNA. Præparater kan optimeres yderligere, ved hjælp af DNA rengøringsprocedurer. Vi viste metoden ved hjælp af materiale fra nematodeprøveudtagning C. elegans og HeLa celler.
Tidligere arbejde at udforske transkriptom og proteomet N2 WT dyr og spise-2 og rsks-1 mutanter har tilbudt indsigt i forskellige veje, herunder mekanismer, at forlænge levetiden4,34,35 ,36. I et forsøg på at efterforske mekanismen af kaloriefattige begrænsning i forlængelse af levetiden, har en stabil isotop mærkning af/med aminosyrer i celle kultur (SILAC) analyse fundet at spise 2 orme en samlet downregulation af globale proteinsyntese 36. de data, der præsenteres her er i overensstemmelse med denne konstatering, selv som mRNA niveauer af de samme mål er steget kraftigt. En anden gruppe har til formål at identificere effektorer af S6K-medieret levetid og derfor udføres en proteom skærm af rsks-1 orme34. Fra de RNAseq data fundet med den aktuelle undersøgelse, identificeret vi mindst tre gener, der bestyrker med proteiner identificeret fra dette skærmbillede; MRP-1 og homologs af CPA og neuroligin (F07C4.12) blev opdaget som varierende udtryk i rsks-1 orme i forhold til WT N234.
De data, der genereres ved hjælp af denne metode er i overensstemmelse med tidligere multiomic undersøgelser. MRNA niveauer af ni mål blev brugt til at forudsige protein niveauer i hver prøve. Af disse mål havde mange forudsigelig protein niveauer baseret på mRNA niveau. Ikke desto mindre var der markante forskelle mellem mRNA og protein niveauer. Vigtigere, tillader protokollen præsenteres her videnskabsfolk til trygt vurdere og fortolke disse forskelle ved at fjerne intersample variabilitet ved at indsamle mRNA og protein fra samme prøve. Desuden sammenlignede vi mRNA niveau til Proteinniveau indsamlet fra samme prøve eller indsamlet fra en lignende, men forskellige prøve høstet med RIPA. Vi viste, at for en række mål, der var meget lavere niveauer af protein i RIPA-ekstraheres prøven. Uden kontrol den intersample variation, ville det være umuligt at vide, om denne forskel skyldtes differentieret regulering af mRNA og protein.
Det er vigtigt at huske, at der findes protokoller optimeret specielt til disse forskellige makromolekyler, så hvis en tværsnits analyse ikke er det endelige mål for eksperimentet, så ville det være relevant at anvende disse metoder i stedet. Bruge GTCp til at isolere DNA og protein forårsager dem til at blive mindre opløselige, der kræver rekonstituering af DNA i en svag base, såsom NaOH, og solubilizing protein i en buffer med en høj koncentration af vaskemiddel med varme, med risiko for at ufuldstændige oploesning. Derudover GTCp indeholder guanidinium kaliumthiocyanat og sure phenol, der inaktiverer enzymer såsom proteaser, men vil langsomt nedbrydes protein med tiden, medmindre frosset. Det bliver til skøn af forsker til at beslutte, hvis omgåelse af disse begrænsninger vil være umagen værd.
Vigtigst, når du arbejder med RNA, en steril teknik, at holde prøve på is, medmindre andet er anført og brugen af kommercielt tilgængelige dekontaminerende anbefales reagens at holde RNA intakt. Navnlig skal større prøver flere GTCp til at starte med, hvor hver ekstraktionsmiddel også skal skaleres. Denne protokol kræver ikke nogen manuelle homogenisering af orm eller celle prøverne, når den korrekte mængde af GTCp bruges. I forbindelse med DNA isolation er udbyttet stærkt afhængige af den færdighed at genoprette den økologiske (pink) lag. Endelig, for at forbedre oploesning af proteiner under isolation, øge mængden af resolubilization buffer eller tilføje andre rengøringsmidler udover SDS kan være nødvendigt. Faktisk, proteiner fra en voksen-bare befolkning af orme i stedet for en blanding af voksne, larver og æg er meget lettere at resolubilize.
Samlet set bruger denne protokol giver en integreret tilgang til biomolekyle isolering og letter fortolkningen af sammenhænge, eller mangel på samme, mellem mRNA og protein niveauer, der kan opstå fra separat høst biomolekyler fra forskellige prøver. Ved hjælp af denne metode kan hjælpe forskerne at identificere korrekt tilfælde hvor oversættelse af mRNA til protein er ikke korrelationsmaalinger og kan føre til en dybere undersøgelse af posttranskriptionelle og posttranslationelle reguleringsmekanismer under forskellige betingelser.
The authors have nothing to disclose.
L.R.L. var finansieret af tilskud fra NIH/NIA (R00 AG042494 og R01 AG051810), Glenn Foundation for Medical Research Award for forskning i biologiske mekanismer af aldrende og Junior Fakultet tilskud fra den amerikanske sammenslutning for aldring forskning. Forfatterne vil gerne takke Anita Kumar og Shi Quan Wong for deres nyttige feedback i skrivning af dette manuskript.
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels | BIORAD | 4568084 | |
Antibodies: | |||
CePAS7-s | DHSB- U of Iowa | ||
CeTAC1-s | DHSB- U of Iowa | ||
DLG1-s | DHSB- U of Iowa | ||
GRP78 | Novus Bio. | NBp1-06274 | |
HRP Goat Anti-Mouse | Li-Cor | 926-80010 | |
HRP Goat Anti-Rabbit | Li-Cor | 92680011 | |
HSP60-s | DHSB- U of Iowa | ||
LMP1-s | DHSB- U of Iowa | ||
MRP-1 | Abcam | ab24102 | |
Neuroligin 3 | Abcam | ab172798 | |
β-actin | Millipore | MAB1501R | |
ChemiDoc MP Imaging System | BIORAD | ||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Health hazard, Irritant, Toxic |
Coomassie Brilliant Blue | ThermoSci | 20279 | |
DC Protein assay | BIORAD | 500-0116 | |
Epoch 2 microplate reader | BioTek | ||
Ethanol (200 proof) | Fisher | 04-355-223 | Flammable, health hazard |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | BSL2 |
iScript Reverse Transcription Supermix | BIORAD | 1708840 | |
Hydra microdispenser: Matrix Hydra | Robbins/ThermoFisher | ||
Isopropanol | Fisher | A516-4 | Flammable, health hazard |
M9 buffer: 3 g KH2PO4 6 g Na2HPO4 5 g NaCl Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving. After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4 |
|||
Laemmli Sample Buffer (2x) | BIORAD | 161-0737 | |
NanoDrop One | ThermoSci | ||
PAGE apparatus | BIORAD | ||
Ponceau S | Alfa Aesar | J60744 | |
Primers | IDT | 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting | |
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3') R (5'-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3') |
|||
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3') R (5'-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3') |
|||
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3') R (5'-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3') |
|||
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3') R (5'-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3') |
|||
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC CGGACTCACG-3') R (5'-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3') |
|||
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3') R (5'-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3') |
|||
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3') R (5'-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3') |
|||
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3') R (5'-AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3') |
|||
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3') R (5'-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3') |
|||
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3') R (5'-CCGGCGGACT CCATACC-3') |
|||
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3') R (5'-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3') |
|||
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3') R (5'-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3') |
|||
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3') R (5'-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3') |
|||
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3') R (5'-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3') |
|||
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3') R (5'-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3') |
|||
LightCycler 96 qPCR machine | Roche | ||
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0.2% SDS 140 mM NaCl 1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 ml |
|||
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix | BIORAD | 1725274 | |
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate | ThermoSci | 34095 | |
Trans-Blot Transfer apparatus | BIORAD | ||
Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIORAD | 170-4159 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | Health hazard (skin, eyes) |
Worm strains: | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
N2 (wild type) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
eat-2 (MAH95) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
rsks-1 (VB633) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |