Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в Caenorhabditis elegans

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для изоляции РНК, ДНК и белка из того же образца, в попытке уменьшить вариации, улучшить воспроизводимость и облегчения толкования.

Abstract

Один биологический образец имеет множество информации, и это теперь обычной практикой расследовать одновременно несколько макромолекул захватить полную картину несколько уровней молекулярной обработки и изменений между разными условиями. Этот протокол представляет метод изоляции ДНК, РНК, и белка из той же выборке нематоды Caenorhabditis elegans удалить вариант, когда эти биомолекулы изолированы от реплицирует из аналогичным образом лечить но в конечном счете различные образцы. Нуклеиновых кислот и белков извлекаются из нематода, с помощью метода извлечения тиоцианат фенол хлороформ кислоты Гуанидиновые, с последующим осадков, стирки и солюбилизация каждого. Мы показываем успешной изоляции РНК, ДНК и белка от одного образца из трех штаммов нематод и клетки HeLa, с лучшими результатами изоляции белка у взрослых животных. Кроме того Гуанидиновые белка тиоцианат фенол хлороформ извлечено от нематод улучшает резолюции больше белков, с расширенной обнаружению уровней, как отметил immunoblotting, по сравнению с традиционными RIPA экстракции белка.

Метод, представленный здесь полезен при расследовании образцов с помощью multiomic подход, специально для изучение протеома и транскриптом. Методы, которые одновременно оценить multiomics являются привлекательными, потому что молекулярных сигналов базовой сложные биологические явления, как считается, происходят на дополнительных уровнях; Однако это становится все более распространенным, чтобы увидеть, что изменения уровня мРНК не всегда отражают то же изменение в уровнях протеина и что время коллекции является актуальной в контексте суточного правил. Этот метод удаляет любые intersample вариант, когда опробование различных содержимое в пределах того же образца (intrasample.)

Introduction

Multiomics, аналитический подход, который использует комбинацию омику, например генома, протеом, транскриптом, epigenome, микрофлора или lipidome, становится все более популярным, когда обработка больших наборов данных для болезнь характеристика1, 2. Монтаж доказательств показал, что ограничение подходы к сингл «Оме» обеспечивает неполное молекулярный анализ (обзор, Rotroff и Motsinger-Рейф1). Большие наборы данных создаются, особенно при выполнении экраны с использованием высокопроизводительных методов, но для того, чтобы нарисовать полную картину или для выявления наиболее актуальных целей, multiomic подходы являются более предпочтительными. С использование multiomics подходов однако, является частое наблюдение расхождений между мРНК и белка уровнях3,4,5,6. В частности мРНК и белка, используемых для транскриптомики бок о бок и протеомных анализов с РНК последовательности (RNAseq) и жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS), соответственно, часто получаются из аналогичным образом обработанных образцов от различные реплицирует, потенциально представляя различия между же условия3,4,5,6. Harvald et al. выполнена элегантным C. elegans голода-курс исследования, которые сравнивали транскриптом и протеом одичал типа (WT) червей, hlh-30 мутант червей, которые не хватает важной транскрипционный фактор продолжительности 7. записки, РНК и белка были собраны от же реплицирует состояние, так что не из той же пробы. Их результаты показывают низкие корреляции между уровни mRNA и уровни белка в каждый момент времени (r = 0.559 с 0.628). В самом деле, их heatmap сформированы четыре кластера: кластер, я имел значительное сокращение в мРНК уровнях но мало или вообще не снижение уровня соответствующего белка, кластер II имел небольшое или никакое увеличение в уровни mRNA но увеличение уровня белка, кластер III было увеличение в мРНК уровни, но снижение уровня белка и IV кластера было повышение уровня мРНК, но только тонкие изменения в уровни белка4. Кроме того этот intersample вариации могут быть введены в тех случаях, когда то же условие не образцов на то же самое время. К примеру мРНК и белков, регулируется суточного цикла колебаться в зависимости от времени день8,9, или, говоря более конкретно, подверженность C. elegans света9; выражение этих суточного белков может быть отложено до 8 ч после индукции выражение гена10. Тем не менее распространенность этого наблюдения не обязательно означает, что это неправильно; в самом деле это может оказаться информативным. Белок и мРНК находятся в состоянии постоянной динамической между формированием и деградации. Кроме того белки часто posttranslationally изменяются, для увеличения стабильности или побудить их деградации11. Например их статус ubiquitination может привести к активации или ориентации протеасом или Лизосома для деградации12. Кроме того некодирующей РНК играют важную роль в регуляции экспрессии генов на этапах транскрипционный анализ и посттранскрипционного13. Таким образом вопрос, как ограничить переменных, чтобы подтвердить, что расхождения, которые мы наблюдаем в эти нематоды исследования являются реальными.

Здесь мы предлагаем метод, который удаляет переменную intersample, позволяя анализ различных макромолекул из той же пробы. Целью настоящего Протокола является предложить метод последовательно изолировать ДНК, РНК и белков от одного образца C. elegans (также упоминаемый как черви) в попытке сократить вариации, улучшить воспроизводимости, и облегчения толкования. Дополнительные преимущества использования того же образца включают экономию времени и ресурсов во время сбора образцов, содействие поперечного сечения анализ образцов ценный и ограниченный, включая штаммы, которые трудно расти и поддерживать и получить понимание дифференцированного регулирования макромолекул, основанный на intrasample вариаций уровня мРНК и белка.

Этот метод подходит для оценки выражения гена и уровни белка от одного образца червей, позволяя для более всесторонней оценки нескольких уровней молекулярной обработки. Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ (GTCp) реагента14, широко используемых химических изолировать РНК, используется для извлечения нуклеиновых кислот и белков от червей, с последующим осадков, стирки и солюбилизация каждого. Этот протокол представляет собой компиляцию различных протоколов15,16 с незначительными изменениями, разработан с упором на C. elegans, но мы также успешно изолированные РНК, белков и ДНК от Пелле НеЬа клетки после же шаги. Хотя не проверял здесь, этот протокол может работать на ткани, а также17,18.

Protocol

Примечание: Каждый шаг осадков макромолекулы выполняется последовательно, следуют моет, сделали одновременно; Однако, рекомендуется для полной изоляции RNA сначала как внутренне нестабилен.

1. образец коллекции

  1. Семя 1000 яиц гельминтов в 10 см пластины с соответствующего роста условий19. Инкубируйте на 20 ° C для 72 ч.
    Примечание: Отбеливатель яйцо подшипник взрослых для того, чтобы собирать яйца как описано19.
  2. Вымойте тарелку с около 5 мл буфера M9 и собирать 1000 взрослых червей в трубку.
    Примечание: M9 буфер состоит из двуосновной фосфат натрия 35 мм, хлорид натрия 102 мм, 22 мм монокальций фосфат калия и магния сульфата 1 мм в стерильной воды19.
  3. Центрифуга червей на 1000 x g за 1 мин, отбросить супернатанта и передать пробки microcentrifuge 1,5 мл гранулированных червей с 1 мл буфера M9.
  4. Центрифуга снова в 845 x g за 1 мин и отбросить большую часть супернатант. Храните гранулированных червей в-80 ° C для минимум 4 часа.
    Примечание: Использование замороженных Пелле производит более высокую доходность, чем свежие лепешки. Серии циклов замораживания/оттаивания, с использованием жидкого азота или 95% этанола на сухой лед взломать червь кутикулы рекомендуется если использовать свежие лепешки. Оставляя небольшое количество M9 на гранулы поможет разорвать кутикулы при замораживании.

2. нуклеотидных и белка изоляции

  1. Удалите любые супернатант из талой гранулы и добавьте 1 mL реагента холодной GTCp. Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз. Поместите образец на льду за 10 мин и смешайте его изредка переворачивая.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Фенол коррозионные, нейротоксического и высоко токсичен и может вызвать химические ожоги и слепоту.
    Примечание: Мы использовали до 5000 взрослых червей в качестве исходного материала с сообщаемых объемов; Каждый том основана на использовании 1 мл GTCp реагента. При использовании более широкой выборки, это может быть необходимо наращивать.
  2. В решение червей и GTCp 200 мкл холодной метилхлороформа. Держите трубку между пальцами и встряхнуть для 15 s. оставить его при комнатной температуре (RT) 3 мин.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Хлороформ токсичных раздражитель, может привести к язвы кожи и другие ориентированные на орган вреда и является потенциальным канцерогеном.
  3. Центрифуга для трубки на 13500 x g 15 мин при 4 ° C.
    Примечание: Три слоя образуются после этого спина: верхней, ясно водной фазе, дно, розовый органические фазы и маленькие, облачно интерфаза, содержащий липиды и ДНК.
  4. С помощью микропипеткой, переместите снимите верхний слой (водная фаза) в новой свободной РНКазы 1,5 мл microcentrifuge трубки (метро A) изолировать РНК через алкоголь осадков (как описано в шаге 2.5) и перейти розовый слой (органические фазы) из оставшихся Пелле новой трубки ( метро B) и поместите его на льду.
    Примечание: Розовый органические фазы могут быть заморожены при температуре-80 ° C до изоляции ДНК и белка из этого образца. Более крупные выборки будет производить толстый белый слой между водные и органические фазы. Эта фракция содержит ДНК. Если этот слой может быть удален без затрагивания других фаз, сделать это и положил его в отдельном трубки (трубки B2).
  5. Изолируйте РНК следующим образом.
    1. С четкой водной фазе в трубке A осадить РНК с 500 мкл 100% изопропиловый спирт. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT. Затем центрифуга трубки A на 13500 x g 10 мин при 4 ° C.
      Примечание: Небольшие белые гранулы РНК должны быть видны в нижней части трубки.
    2. Декант большинство супернатант. Удалите остальные с 1 мл шприц с иглой и удалить супернатант.
      Примечание: Размер иглы не важен; Однако больше датчик иглы будет предлагать больше контроля, чтобы не нарушить гранулы. Микропипеткой может использоваться, если иглы не доступны.
    3. Добавьте 1 мл 75% этанола в метро A, чтобы помыть лепешка. Спиновые трубки на 5300 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Удалить супернатант из гранул сцеживать и используя 1 мл шприц с иглой, как описано в шаге 2.5.2 и отменить его.
    5. Пусть гранулы воздушно-сухой для 5-10 мин, но не позволяйте ему пересушить. Используйте 50 мкл РНКазы свободной воды для воссоздания Пелле РНК, прежде чем она станет совершенно прозрачным.
      Примечание: Это достаточное начальный объем для 1000 – 3000 червей, но он может должны быть скорректированы в зависимости от того, сколько исходного материала был использован.
    6. Инкубируйте Пелле в 55-60 ° C 10 мин распустить ее.
    7. Измерьте концентрацию и чистоты, используя спектрофотометр. Запись absorbances в 260 Нм для концентрации РНК и 230 и 280 Нм для выявления каких-либо примесей.
    8. Очистите РНК для удаления любых загрязнений, остатков фенол или ДНК, либо столбец очистки или с последующей этанола моет и DNase лечения.
      Примечание: На данный момент РНК готова быть отправлены для анализа RNAseq или может использоваться для cDNA для RT-ПЦР (см. раздел 3.1). РНК могут храниться при температуре-80 ° C до дальнейшего использования.
  6. Изолируйте ДНК следующим образом.
    1. Розовый органические фазы в метро B и образец в метро B2 если таковые имеются, осадить ДНК путем добавления 300 мкл, 100% этанола и микс инверсии. Оставьте трубки на RT на 2 – 3 мин.
    2. Центрифуга трубы B и B2 в 375 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет ДНК.
    3. Переместить супернатант из трубы B и B2, перелить нового 2-мл пробирку (метро C) и оставить его на льду для изоляции последующие белка. Помыть лепешка ДНК в трубку B или B2 с 1 мл 0,1 М натрия цитрата в 10% этанола для пробирок 30 мин, B и B2 в 375 x g 5 мин при 4 ° C.
      Примечание: Натрия связывается с ДНК позвоночника, делая ДНК осадок большей готовностью цитрат натрия и этанола, позволяя примеси удаляются центрифугированием низкой скорости.
    4. Повторите шаг мыть, как описано в шаге 2.6.3. Ресуспензируйте гранулы в 1,5 мл 75% этанола и оставить его на RT для 20 минут, с время от времени перемешивания, искаженную.
    5. Центрифуга трубки B и B2 в 375 x g 5 мин при 4 ° C.
    6. Отменить супернатант и дайте ему высохнуть на 5 – 10 мин.
    7. Растворяют гранулы в 150 мкл рабочего раствора гидроксида натрия 8 мм. При необходимости отрегулируйте нужную pH с HEPES. Спиновые образца на 375 x g 5 мин при 4 ° C.
    8. С помощью микропипеткой, переместите супернатант (ДНК) к новой пробке. Измерить концентрацию и определить чистоту, используя спектрофотометр. Запись absorbances в 260 Нм для концентрации ДНК и 230 и 280 Нм для выявления каких-либо примесей.
  7. Изолируйте белка следующим образом.
    1. Осадок белка, добавить до 1,5 мл 100% изопропиловый спирт в розовый супернатант в трубе C, микс от переворачивать несколько раз и Инкубируйте на RT за 10 мин.
    2. Центрифуга для трубки C на 13500 x g 10 мин при 4 ° C.
    3. Отменить супернатант и помыть лепешка с 2 мл 0,3 М Гуанидин гидрохлорид в 95% этаноле для 20 мин на RT. пластиковых пробирок C на 5300 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Повторите шаг мыть, как описано в шаге 2.7.3 2 x.
    5. Перенести Пелле белка в новой 1,5 мл трубки (труба C2) и добавить до 1,5 мл этанола 95%. Вихрь и пусть это сидеть в РТ за 20 мин.
    6. Центрифуга для трубки C2 на 5300 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и пусть гранулы сухого 10 мин на RT. растворяют гранулы в 300 мкл 5% SDS при 50 ° C 60 мин.
      Примечание: Длительное время инкубации может потребоваться полностью растворяют гранулы белка. В прошлом гранулы инкубировали в течение до 6 ч без ущерба для качества.
    7. Центрифуга для трубки C2 на 13500 x g 10 мин на 17 ° C. Переместите супернатант новой трубки.
    8. Измерьте концентрацию, используя assay количественная оценка предпочтительным белка, который совместим с моющим средством.
      Примечание: Белок готов к использованию в SDS-PAGE и Западный blotting. Он может храниться при температуре-20 ° C для использования в будущем. Для других методов, таких как LC-MS/MS моющих средств нужно будет dialyzed выкл.

3. Оценка мРНК и уровни белка

  1. RT-ПЦР
    1. Подготовьте cDNA, обратной транскрипции с 1 нг РНК, используя следующий протокол Термоциклер: грунтовка (5 мин при 25 ° C), обратная транскрипция (20 мин на 46 ° C) и инактивации RT (1 мин при 95 ° C).
    2. Сделайте запасов тарелку cDNA, добавив 100 мкл разведения 1: 100 каждого образца cDNA отдельных скважин 96-луночных плиты. Включать соответствующие элементы управления, такие как не шаблон только вода скважины и последовательно разбавленных пробах 1:25 до 1: 400 (возникла с пуле cDNA от всех проанализированных проб) для стандартной кривой для установления эффективности грунтовка для каждого гена проанализированы.
      Примечание: Этот формат может использоваться с 96-ну microdispenser, который позволяет для передачи всех образцов в тарелку RT-ПЦР пластины и для смягчения скважины для дозирования вариации. Мастер смесь (например, SYBR + грунтовки) могут добавляться к каждому хорошо после этого, с многоканальные пипетки. В целом такой подход уменьшает количество ошибок, когда рука дозирование каждого образца, таким образом, дальнейшее сокращение изменчивости.
    3. Мкл 3 cDNA от запасов пластины к добрам плиты RT-ПЦР.
    4. Сделайте основной микс для каждого набора грунты, которая включает 1 x Супермикс, содержащий ДНК, интеркалирующие цианиновые краска, 5 мкм из вперед и обратить вспять грунтовки и воды до 7 мкл на сэмпл. 7 мкл соответствующие лунки RT-ПЦР пластины и агитировать слегка перемешать.
      Примечание: Включает образцы для измерения уборки гены, чтобы использовать в качестве эталона для нормализации результаты20.
    5. Запустите пластину с помощью RT-ПЦР протокола, который подходит для используемого грунтовки.
  2. Западная помарка
    Примечание: Для подробной информации о западных помарках пожалуйста, обратитесь к Махмуд и Ян21.
    1. Подготовьте образцы для SDS-PAGE, объединяя 20 мкг белка с равным объемом 2 x буфер Лэмли образца и кипятят на 95 ° C в течение 10 мин.
    2. Загрузить образцы на 4% – 15% гель трис глицин и запускать их на 150 V 1 h, или до тех пор, пока краска фронта достигает нижней части геля.
    3. Передача белки от геля на нитроцеллюлозную мембрану на 25 V 30 мин в аппарат полусухое передачи.
    4. Подтвердите надлежащую передачу, окрашивание мембраны с Пуансо пятно.
    5. Тщательно промойте пятно от мембраны с трис амортизированное saline (TBS) с 0,01% Полисорбат 20 (TBS-T).
    6. Блок мембраны с 5% обезжиренное молоко в TBS-T 1 h на RT.
    7. Проинкубируйте мембрану в основное антитело на соответствующие разрежения согласно рекомендациям поставщика. Оставьте его на рокер на 4 ° C на ночь.
    8. Промойте мембрану 3 x, 5 минут каждый, с TBS-T.
    9. Проинкубируйте мембрану в соответствующие вторичное антитело на соответствующие разрежения согласно рекомендациям поставщика. Оставьте его на рокер за 1 час на RT.
    10. Промойте мембрану 3 x, 5 минут каждый, с TBS-T.
    11. Изображения и Западная помарка, используя Предпочитаемые методы количественной оценки.

Representative Results

Были проанализированы образцы ДНК, РНК и белка, и представитель результаты с помощью РНК и белки изолятов представлены здесь. Кроме того мы сравниваем образец протеина, собирают с помощью метода GTCp с общей RIPA лизис метод22. Для нашего эксперимента мы использовали четыре независимых реплицирует каждого WT (N2) червей и два долгоживущих мутант червей, едят-2 и rsks-123,24.

ДНК и РНК количество и качество

Концентрация РНК при высокомобильна в 50 мкл воды колеблется от 0,2-2 мкг/мкл, используя около 3000 взрослых червей как исходный материал. Коэффициенты поглощения, которые указывают чистоты, варьировались от 2.0 до 2.2 для A260/A280 и 1,9-2,5 для A260/A230 (Таблица 1), показывающее успешное извлечение РНК без загрязнения с GTCp компонентами, такими как фенол или Гуанидин гидрохлорид.

Экстракции ДНК была успешной, но качество было переменной. Концентрация ДНК при высокомобильна в 150 мкл рабочего раствора NaOH, варьировались от 0,04 до 1,1 мкг/мкл. Коэффициенты поглощения, варьировались от 1,8 до 2.1 для A260/A280 и 0,9-1.6 для A260/A230 (Таблица 1), указанием успешного извлечения ДНК; Однако некоторые образцы были загрязнены с GTCp компонентами, такими как фенол или Гуанидин гидрохлорид. Если необходима изоляция дна, необходимо соблюдать осторожность при разделении средний слой из разделение фаз GTCp, и больше моет может быть необходимым.

RT-ПЦР выбранных объектов

РНК изоляции от четырех независимых выборок каждого штамма червь был успешным и был направлен для RNAseq анализа, с последующей RT-ПЦР с помощью Супермикс, содержащий цианиновые красителя. Цели, анализируемой RT-ПЦР были выбраны из большого набора данных RNAseq на основе наиболее дифференциально регулируется генов, распространены в обоих мутантов по сравнению с WT червей. F07C4.1225, гомолога для человека нейролигины 3 изоформы b, был объектом отдельных общих upregulated. Мы также включили дифференциально регулируется генов между обеими мутантов, mrp-126, для дополнительного анализа, который был upregulated в черви едят-2 , но downregulated в rsks-1 червей. Изменения выражения mrp - 1 были подтверждены через RT-ПЦР; Однако upregulation F07C4.12 в rsks-1 червей предсказано RNAseq анализа не было воспринято RT-ПЦР (рис. 1).

Дополнительные цели с антителами, проверяется для червей были исследованы также. К ним относятся несколько маркеров органеллы, характеризуется занимался программированием et al.27. Ряд этих маркеров дифференциально были выражены на уровне мРНК в мутанта червей. Как видно на рисунке 1, lmp-128 и dlg-129 были upregulated в черви едят-2 ; HSP-4 30, hsp-7030и ПРТ-1 были upregulated в rsks-1 червей; HSP-60 31 и Пас-732 были downregulated в черви едят-2 ; HSP-60 и tac-1-33 были downregulated в rsks-1 червей.

Одновременная vs. RIPA белка подготовка

Чтобы подтвердить эффективность и качество белка с помощью метода GTCp, как описано выше, мы сравнил его с белками, собранных с использованием метода более традиционным RIPA лизис22. Используя то же количество исходного материала, а именно либо только для взрослых (около 10000 черви) или смешанного населения взрослых, личинок и яиц (около 130 000 червей), общее количество собранных с GTCp был меньше, когда высокомобильна в равных конце томов (Таблица 1 ); Однако добыча из только для взрослого населения был более успешным, чем от смешанного населения. Кроме того качество белков был похож, хотя и белка GTCp извлечены показал лучшее разрешение больше белков при равных загрузке общего белка, как показано на Кумасси пятно на рисунке 2. Действительно цели оценена иммуноблоттинга на рисунке 3 показан аналогичного уровня в большинстве случаев; Однако больше, чем 75 кДа белками показали более низких уровней в RIPA-извлечены белка по сравнению с GTCp извлечения белков (Рисунок 3А, правой полосе; Рисунок 3B, желтый бар).

Метод экстракции, представленные здесь также оценивалась в строке mammalian клетки HeLa. Для справки количество белка, экстрагируют РИПА из компактный Пелле шесть миллионов клеток HeLa (~ 25 мкл Пелле) был сопоставим с размером извлечено от 130.000 смешанное население червей (~ 75 мкл компактный гранулы), или около половины того, что добывается из 10 000 взрослых червей (~ 100 мкл поселились тяжести гранулы), как показано в таблице 1. Мы покажем, что в GTCp по сравнению с RIPA-извлечены белка в клетки HeLa, предполагая, что этот метод работает лучше в взрослого населения уменьшилась эффективность извлечения белков (Таблица 1) и резолюции более большие протеины (рис. 2) черви. Неполные солюбилизация белка гранулы из GTCp извлечены HeLa белка может быть ограничение этого метода в mammalian клетках.

Immunoblotting цели, анализируемой RT-ПЦР

Далее мы исследовали уровень белка гена продуктов проверена RT-ПЦР для определения, если уровни mRNA коррелирует с уровнем белка. Как видно на рисунке 3, средняя выражение изменения белка коррелирует с средняя выражения мРНК, изменено для многих целей; Однако некоторые уровни белка не отражает изменения в уровни mRNA. Зачастую уровни mRNA в черви едят-2 были выше, чем в других штаммов, но уровни белка были те же или ниже, чем в других штаммов той же цели. Наиболее выдающиеся наблюдения был очень высокий уровень dlg-1 мРНК в червей едят-2 , которые не привело к больше белка; в самом деле были ниже уровни белка dlg-1 по сравнению с другими напряжениями (рис. 3).

Наконец уровни в GTCp извлечения белков и RIPA-извлечения белков показали поразительное различие. РНК добывали таким же образом для обоих; Однако аналогичные, но отдельные образцы, собранные RIPA лизис показали заметно сократить уровни белка, особенно для тех, кто больше чем 75 кДа (рис. 3A, правой полосе; Рисунок 3B, желтый бар).

Intrasample сравнение уровня мРНК и белка

Одна из целей настоящего Протокола было определить вариации мы увидели на мРНК и уровень белка была реальной, или если он может быть артефактом intersample вариации. Рисунок 4подмножество задач сравнивали в пределах одной пробы. Каждый индивидуальный образец отображается как же тень и цвет точки, с образец 1, будучи Мрачные тени и образец 4 как легкий оттенок серого (WT), синий (едят-2) или красный (rsks-1). В большинстве образцов была низкой изменчивости уровня мРНК, с большей изменчивости уровня белка, потенциальный недостаток полуколичественный анализ западной помарки. При взгляде на положение каждого из цветных точек между парами мРНК и белка, порядок высокие и низкие часто не соответствует; Например, в БЗБ, hsp-60 мРНК приказ был образец 4, 3, 2, 1, но уровни белка были 1, 2, 3, 4. Таким образом безусловно существуют различия между уровнями мРНК и белков в рамках выборки, но представленные метод позволяет пользователям удалить время сбора как возможный источник наблюдаемых различий.

Table 1
Таблица 1: концентрации и коэффициенты поглощения. Концентрации РНК и ДНК и чистоты коэффициенты были измерены на спектрофотометре. Концентрации белков были определены с использованием assay количественная оценка колориметрические протеина. Серый, синий и красный выделите образцы, используемые для RT-ПЦР и западную помарку. Желтый цвет обозначает образцов, используемых для сравнения GTCp RIPA белка добычу или червя белка HeLa белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Figure 1
Рисунок 1: выражение гена по RT-ПЦР. RT-ПЦР анализ для мРНК, полученные этим методом, подтверждающий намеченных из RNAseq данных и органелл маркерных генов. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение; n = 4. Концентрация mRNA был определен против стандартной кривой для каждого набора грунтовки. Все уровни mRNA были нормализованы в среднем набор генов шести уборки, используется в качестве ссылки генов, которые включают акт-1, cdc-42, Ама-1, nhr-23, pmp-3и cyn-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: сравнение GTCp-против RIPA-извлечены белка в червей и клетки HeLa. Общий белок клеток HeLa, собирают через метод GTCp или RIPA лизиса, разделенных SDS-PAGE и витражи с Кумасси синим или одичал тип (WT) червей. Каждый Лейн содержит 25 мкг, общего белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: уровни белка в глистах. (A) Западная помарка целей, расследованных RT-ПЦР и (B) анализ денситометрии интенсивности сигнала. Каждый Лейн содержит 20 мкг общего белка GTCp извлечено от одичал тип (WT), есть-2или rsks-1 мутант червей. Изображение — это представление четырех независимых реплицирует на червя штамм. Β-актина (внизу) использовался для управления для равных загрузки для каждой цели; показан только один представитель набор. Правый ряд содержит 20 мкг общего белка RIPA-извлечено от мутантов червей rsks-1 . (B) соответствующий сигнал света были количественно с помощью ImageJ. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение; n = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: сравнение уровня Intrasample мРНК и белок. Уровень мРНК и белка от отдельных образцов из подмножества целей для каждого штамма выравниваются. Цвет является представителем в таблице 1. Серый/черный WT, синий — едят-2, и красный rsks-1. мРНК белка и той же цели парные рядом друг с другом и разделенных нематоды штамм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Методы для изоляции биомолекулы, такие как ДНК, РНК и белков, часто оптимизированы без дублирования технического или комбинации. Это особенно невыгодной когда образцы трудны для того получить, что может привести к сбора образцов на тех же условиях в разное время. В зависимости от сотовой пути реплицирует, собранные в разное время может создавать вариации. Эта рукопись предоставляет способ обойти это препятствие, позволяя одновременно изоляции и очистки каждого биомолекулы от той же выборке червей, снижения вариации, представленный изоляции различных методов, сроков образцов урожая, или неравные уборки. Контролировать эти переменные не только экономит время и ресурсы, но также способствует воспроизводимость. Здесь мы демонстрируем комбинаторный подход, который позволяет избежать ущерба РНК и белка качества, хотя и с переменной результаты с ДНК. Подготовка может быть оптимизирован с помощью ДНК, очистка процедур. Мы продемонстрировали подход с использованием материала от нематод C. elegans и НеЬа клетки.

Предыдущие работы, изучение протеома N2 WT животных и есть-2 и rsks-1 мутантов и транскриптом предложили проницательность в различных путей, включая механизмы, которые расширяют срок4,34,35 ,36. В попытке изучить механизм ограничение калорий в продлении жизни стабильного изотопа маркировки, / с аминокислоты в ячейке культуры (SILAC) анализ показал, что глисты что едят-2 имеют общую Даунрегуляция глобальных белкового синтеза 36. данные, представленные здесь согласуется с этой находкой, даже, как уровни mRNA же цели значительно увеличилось. Другая группа стремилась определить эффекторов S6K-опосредованной долголетия и, таким образом, выполняется proteomic экран rsks-1 червей34. По данным RNAseq с нынешнего исследования мы определили по крайней мере трех генов, которые подтверждают с белками, выявленных на этом экране; MRP-1 и гомолог ВМС и нейролигины (F07C4.12) были обнаружены как дифференциально выражается в глистах rsks-1 по сравнению с34WT N2.

Данные, полученные с помощью этого метода согласуется с предыдущей multiomic расследования. Уровни mRNA девяти целей были использованы для прогнозирования уровня белка в каждом образце. Из этих целей многие имели уровни прогнозируемого белка, основанный на уровни mRNA. Тем не менее существуют заметные расхождения между уровнями мРНК и белка. Важно отметить, что протокол, представленные здесь позволяет ученым уверенно оценивать и толковать эти различия путем удаления intersample изменчивость, собирая мРНК и белка из той же пробы. Кроме того мы сравнили уровни mRNA уровни белка собраны из того же образца или собраны из образца аналогичные, но разные, собирают с RIPA. Мы показали, что для целого ряда целей, были гораздо более низкий уровень белка в RIPA-извлечены выборки. Без контроля для intersample варианта, было бы невозможно знать, если это различие было обусловлено дифференцированного регулирования мРНК и белка.

Это важно иметь в виду, что существуют протоколы, оптимизированных специально для этих различных макромолекул, так что если межсекторальный анализ не является конечной целью эксперимента, то было бы уместно применять эти методы вместо. Использование GTCp для изоляции ДНК и белка вызывает им стать менее soluble, требующей воссоздания ДНК в слабой базой, например NaOH и растворяющие белка в буфере с высокой концентрации моющего средства с нагревом, с риском неполной солюбилизация. Кроме того GTCp содержит тиоцианат Гуанидиновые и кислой фенола, который инактивирует ферментов, таких как протеаз, но медленно деградирует белка со временем, если заморожен. Это будет на усмотрение исследователь решить, будет ли целесообразным обхода этих ограничений.

Важно отметить, что при работе с РНК, стерилизации, сохраняя образца на льду, если не указано иное и использование коммерчески доступных дезактивации реагентов рекомендуется держать РНК нетронутыми. Примечательно более крупные выборки будет нужно больше GTCp начать с, в котором каждый экстракции растворителем будет также необходимо активизировать. Этот протокол не требует каких-либо ручной гомогенизации червя или клеток образцов когда используется правильное количество GTCp. В контексте изоляции ДНК урожайность сильно зависит от знания, чтобы восстановить в органическом слое (розовый). Наконец чтобы улучшить солюбилизация белков во время изоляции, может потребоваться увеличение объема буфера resolubilization или добавление других моющих средств помимо SDS. Действительно белки от только для взрослого населения червей вместо смесь взрослых, личинки и яйца являются гораздо легче resolubilize.

В целом используя этот протокол обеспечивает комплексный подход к биомолекулы изоляции и облегчает толкование корреляции, или отсутствие таковых, между уровнями мРНК и белков, которые могут возникнуть из отдельно уборки биомолекул из различных образцы. С помощью этого метода может помочь ученым правильно определить случаи, когда перевод мРНК белка не корреляционного и может привести к более глубокого расследования посттранскрипционного и Посттрансляционная регулирующих механизмов в различных условиях.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

L.R.L. было финансирование, гранты от NIH/Ниа (R00 AG042494 и R01 AG051810), Glenn Фонд медицинских исследований премию за исследования в области биологических механизмов старения и младший факультет грант от американской Федерации старения исследований. Авторы хотели бы поблагодарить Анита Кумар и Ши цюань Вонг за их полезную обратную связь в написании этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
  2. Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
  3. Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
  4. Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
  5. Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
  6. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
  7. Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
  8. Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
  9. Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
  10. Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
  11. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
  12. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
  13. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  14. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  15. Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
  16. Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  17. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
  18. Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2006).
  20. Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
  21. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).
  23. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  24. Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
  25. Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
  26. Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
  27. Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
  28. Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
  29. Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
  30. Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
  31. Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
  32. Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
  33. Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
  34. McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
  35. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  36. Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).

Tags

Биология выпуск 145 multiomics протеомики transcriptomics RNAseq RT-ПЦР западной помарки ДНК РНК белков C. elegans Гуанидиновые тиоцианат
Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, J., McConnell, E.,… More

Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter