ヒト尿路上皮細胞癌および大腸癌腫瘍増殖および自発性転移に対する患者由来の眼科医異所性Xenograft移植片モデル
Summary
このプロトコルは、高品位の尿細胞癌細胞または非肥満糖尿病/重度の組み合わせに大腸癌細胞を直腸内注入することにより、患者由来のオルソトピック異種移植片モデルの生成を記述する。ヒト転移性疾患の進行を模倣するリンパ節間質細胞の影響下で原発性腫瘍増殖および自発的転移のための免疫不全(NOD/SCID)マウス。
Abstract
癌患者は、膀胱の高品位泌尿器細胞癌(HG-UCC)および大腸癌(CRC)の両方にリンパ節(LN)関与が存在する場合、予後不良を有する。筋肉侵襲性UCC患者の50%以上は、臨床的に局所的な疾患に対する治癒療法にもかかわらず、転移を発症し、5年以内に死亡し、転移性CRCは米国における癌関連死の主要な原因である。患者に見られるUCCおよびCRC転移を一貫して模倣する異種移植片モデルが必要である。本研究は、薬物スクリーニングのためのヒト転移性疾患の進行を模倣するLN間質細胞の影響下で原発性腫瘍増殖および自発的転移のためのUCCおよびCRCの患者由来のオルソトピック異種移植片(PDOX)モデルを生成することを目的としている。新鮮なUCCおよびCRC腫瘍は、HG-UCCおよび大腸腺癌の切除を受けた同意患者からそれぞれ得られた。LN間質細胞(LNSC)アナログHK細胞と共接種し、ルシフェラーゼタグ付きUCC細胞を女性非肥満糖尿病/重篤複合免疫不全(NOD/SCID)マウスに注入した内静脈内(IB)を、CRC細胞を直腸内(IR)に注入した。雄のNOD/SCIDマウス。腫瘍増殖および転移は、生物発光イメージング(BLI)を用いて毎週モニタリングした。犠牲に基づいて、原発性腫瘍およびマウス器官を採取し、計量し、ヘマトキシリンおよびエオシンおよび免疫組織化学染色のためにホルマリン固定した。私達の独特なPDOXモデルでは、異種移植片腫瘍は患者の移植前腫瘍に似ている。HK細胞の存在下では、両方のモデルはBLIおよび腫瘍重量によって測定される高い腫瘍注入率、UCCのための83.3%およびCRCのための96.9%および高い遠くの器官転移率(UCCのための33.3%およびCRCのための53.1%の肺転移を検出した)を有する。さらに、両方のモデルは、手順からの死亡率がゼロです。ヒトHG-UCCおよびCRCに対して、腫瘍の形成、増殖、転移研究を可能にするユニークで再現性の高いPDOXモデルを確立しました。これらのモデルにより、新規治療薬の試験を効率的かつ臨床的に模倣的な方法で行うことができる。
Introduction
リンパ節転移は、膀胱および大腸癌(CRC)1、2の高品位尿路上皮細胞癌(UCC)を含む多くの固形臓器悪性腫瘍において予後不良指標であることが示されている。筋肉侵襲性UCC(MIUCC)患者の半数以上は、臨床的に局所的な疾患に対する治癒療法にもかかわらず、転移を発症し、5年以内に死亡する。転移性CRCは、米国における癌関連死の主要な原因である。
2018年に米国では、膀胱3、4のUCCにより、推定81,190人の新しい患者と17,240人のがん特異的死亡が発生すると予想されています。患者が主に(70%)非筋肉侵襲性疾患を有し、30%はMIUCC5を有する。臨床的に局所的な疾患に対する治癒療法(全身性嚢胞切除術[RC])にもかかわらず、膀胱のMIUCC患者の半数は依然として転移を発症し、5年以内に死亡する3。リンパ節関与は、RC6、7、8を受けた患者の約20%−25%に見出される。LN陽性患者の5年生存率はRC後も35%未満であり、UCC患者の予後の重要な陰性予測としてLN関与を示唆している。
大腸癌は、米国の男性と女性の両方で診断された3番目に一般的な癌です。患者の転帰は、侵診の深さ、LN関与、遠方の臓器転移などの腫瘍特性および腫瘍微小環境に大きく依存する。CRCの死亡率は、スクリーニングと効果的な手術のために過去10年間に減少したが、CRC患者のほぼ50%が転移または再発性疾患9を発症すると推定される。
小動物モデルは、腫瘍の進行と異なる転移パターンを研究するための迅速で再現性の高い、変更可能なプラットフォームを提供します。現在、患者に見られるCRCおよびUCC転移を一貫して模倣する記述された異種移植片モデルはない。がん遠隔転移の主な経路は、リンパスプレッドを介してである。新しい研究は、LANが腫瘍にユニークな微小環境を提供し、癌細胞が一時的に通過する単なる静止標的であるだけでなく、転移過程で癌細胞と相互作用することによって不可欠な役割を果たしていることを示唆している。実際、我々の研究は、腫瘍の進行および転移の教育および促進に加えて、LN間質微小環境がCRC10、11における薬剤耐性にも関与することを発見した。我々の研究室は最近、患者由来のオルソトピック異種移植片(PDOX)マウスモデル12,13を用いてCRCおよびUcCに対するLN間質細胞(LNSC)の腫瘍性効果を確認した。
PDOXモデルの開発は、翻訳癌研究のための重要なプラットフォームを提供します 14,15.ドナー腫瘍の主要な組織学的および遺伝的特徴を維持することにより、PDOXモデルは通路を越えて安定したままであり、翻訳癌研究のための良好なプラットフォームを作る12,15.PDOXモデルは、臨床結果の予測を可能にする個別化医療戦略の前臨床薬の評価、バイオマーカー同定、前臨床評価に使用されています。現在、LN関与の重要性を考慮し、CRCおよびUCCにおける原発性腫瘍および遠隔臓器転移を一貫して再生することができる記述された異種移植片モデルはない。本研究では,転移性CRCおよびUCC疾患をLNSC関与で再現したNOD/SCIDマウスにおけるPDOXモデルの開発について述べた.
Protocol
Representative Results
Discussion
転移性疾患は、ほとんどの癌患者の死亡率を担当しています。前臨床治療試験では、自発的な遠隔臓器転移でヒト腫瘍の増殖を最も密接にエミュレートするマウスモデルを確立することが重要である。移植された患者腫瘍由来癌細胞(異種移植片)を有するマウスモデルを使用すると、腫瘍生物学および予測バイオマーカーの理解を深めるとともに、新規療法の抗腫瘍効果の試験および予測<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、優れた技術サポートのためにこれらの研究を開始するのを助けたブライアン・ロイター、ダニエル・ベルトーニ、ピーター・ミラー、シャノン・マッケスニーに感謝しています。著者らはまた、ヘザー・グリーン・マトラナ、マーガレット・ヴァリアーノ、スニル・タルワル、マリア・ラティスに対し、患者の同意と腫瘍標本の提供に対する支援に感謝している。
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
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